Name: Diyet Lipid Emiliminin ve Şilomikron Sekresyonunun İn Vivo Kinetiğini Ölçmek için Farelerde Akan Mezenterik Lenflerin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Öğrenin, farelerde akan mezenterik lenf izolasyonu ile diyet lipid emilimi ve şilomikron sekresyonunun in vivo kinetiğini ölçme yöntemini. Bu teknik metabolizma ve bağışıklık etkileşimlerini gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kistik Fibrozis Vakfı'na (Pilot ve Fizibilite Ödülü 1810, ABK'ya), Rainin Vakfı'na (Sinerji Ödülü, PI GJ Randolph ve Co-I ABK'ya) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'ne (R01DK118239, R03DK116011'den ABK'ya) bu çalışmalara verdikleri destek için son derece minnettarız.

Tüm cerrahi prosedürler Pittsburgh Üniversitesi Dahili Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi [Protokol # 20047008] tarafından onaylanmıştır ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygundur. Bu çalışmada 8-14 haftalık C57BL6/J erkek fareler kullanıldı. Fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Tüm fareler, standart chow ve suya ad libitum erişimi olan 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsüne yerleştirildi.
1. Hayvan hazırlama
<ol><li>Deneysel tasarıma bağlı olarak, fareleri besleyin veya oruç tutmalarına izin verin. NOT: Mide boşalma hızındaki farklılıklarla ilgili endişeler olmadıkça bir gece oruç tutmak gereksizdir.</li>
	<li>% 5 izofluran gazı ile anesteziyi indükleyin ve kuyruk ve ayak parmağı sıkışması ile uygun anestezi sağlayın. Anestezi uygulandıktan sonra, fareleri% 2 -% 3 izofluran gazı ile uygun bir anestezik düzlemde tutun ve cerrahi platformda bantla konumlandırın.</li>
	<li>Fareleri, dolaşımdaki ılık suyu kullanan ısıtılmış bir cerrahi platformda sıcak tutun ( bkz.</li>
</ol>2. Cerrahi ve deneysel tasarım
<ol><li>Ameliyata gözlere veteriner merhemi uygulayarak, karnı tıraş ederek ve cerrahi bölgeye antiseptik cerrahi ovma uygulayarak (bkz. Bu, insizyonu sterilize eder ve orta hat insizyonu sırasında havadaki kürk oluşumunu azaltır.</li>
	<li>Steril aletler, perdeler ve ihtiyaç duyulan diğer ekipman ve malzemeleri kullanarak steril bir çalışma alanı sağlayın.</li>
	<li>Ağrı kesici (i.p.) için ilk karprofen dozunu (bakınız Malzeme Tablosu) 5 mg / kg'lık bir dozda enjekte edin.</li>
	<li>Cildi cımbızla kavrayın ve küçük makasla orta hat karın kesisi yapın. Sternuma doğru kesin (asla yukarıda değil) ve kasık yağına kadar kesin. Ardından, makası kullanarak kas tabakasını ayrı ayrı kesin. NOT: Kullanmadan önce tüm ekipmanları sterilize edin.</li>
	<li>Retraktörü kullanarak, lenf kanalı görünene kadar periton iç organlarını yoldan uzaklaştırın.</li>
	<li>Tuzlu suya batırılmış bir Q-ucu kullanarak ( bakınız Malzeme Tablosu), karaciğeri vücudun sağ üst tarafına ve bağırsakları ve mideyi hayvanın soluna doğru hareket ettirin.</li>
	<li>Superior mezenterik arteri ve bağırsak lenf kanalını ortaya çıkarmak için duodenumu sola doğru enine olarak gerin.</li>
	<li>Kanül tüpüne künt bir iğne sokarak 30-40 cm uzunluğunda bir kanül tüpü hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu) ve 1 mL'lik bir şırınga kullanarak tüpün içinden az miktarda heparin (1.000 U / L) yıkayın. NOT: Lenf akışı, buz üzerindeki mikrosantrifüj toplama tüplerine aşağı ve içine akması için yerçekimi tarafından desteklenir. Toplama buz kovasının cerrahi kuruluma bitişik olarak bulunduğu yere bağlı olarak, kanül borusunun uzunluğunun ayarlanması gerekebilir.</li>
	<li>Kanül borusunun ucundaki bir eğimi kesmek için makas kullanın.</li>
	<li>İnce bağırsaktaki görünümünden yaklaşık 5 mm uzakta lenf kanalında iris makası ile sığ bir kesi yapın (bkz.</li>
	<li>Kanül tüpünü bir çift ince forseps ile tutun ve ucu yavaşça kanala yerleştirin. NOT: Kanülü kanalın içine çok fazla itmemek önemlidir, çünkü geri çekilen organlar orijinal konumlarına geri döndüğünde lenf akışını önleyebilir.</li>
	<li>Lenf kanalı, kateterin bir dikişle bağlanmasıyla ilişkili manipülasyonlar için çok kırılgandır. Bunun yerine, lenf kanülünü mezenterik lenf kanalına yapıştırmak için bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.</li>
	<li>Lenf fistül kanülünden hemen akmaya başlayan sütlü, beyaz lenf (ameliyat öncesi zeytinyağı gavage kullanılmışsa) veya berrak lenf (fareler ameliyat öncesi oruç tutmuşsa) olup olmadığını kontrol edin. NOT: Lenf kanülünün başarıyla yerleştirildiğini ve lenfin aktığını kontrol edin; İntraduodenal kanül yerleşimi ile devam edin.</li>
	<li>18 G'lik bir iğne kullanarak, midenin pilorik bölgesinden pilor sfinkterine doğru bir delik açın.</li>
	<li>Duodenal infüzyon tüpünü (bakınız Malzeme Tablosu) midedeki bu delikten pilor sfinkterinin yaklaşık 1-2 mm ötesine duodenuma yerleştirin.</li>
	<li>İpek 5-0 sütür kullanarak bir çanta ipi bağı ile sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu) mideye bir iğne ile sabitleyin ve sızıntıyı önlemek için bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın.</li>
	<li>0.3 mL / s'de% 5 glikoz-% 0.9 salin intraduodenal infüzyonuna başlayın. NOT: Vücut ağırlığında küçük farklılıklar olan ve kabaca 25 g (~ 8 haftalık) olan fareler kullanıldığında, 0.3 mL / s glikoz / salin infüzyonu uygundur. Fareler önemli ölçüde daha büyükse, infüzyon hızı vücut ağırlığındaki ve kan hacmindeki değişikliği hesaba katmak için yukarı doğru ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Vücut boşluğundaki organları değiştirin ve kas ve cilt dokularını ayrı ayrı dikin (5-0). NOT: Lenf kanülü ve intraduodenal beslenme tüpü aynı insizyondan dışarı çıkarılır. Tüplerin bir dikişle ayrılması için bir öncelik yoktur ve tüplerin dışsallaşma açısı için bir tercih yoktur.</li>
	<li>Ameliyattan sonra ancak anestezinin geri çekilmesinden önce, hareketliliği sınırlamak için fareleri yavaşça Snuggle kısıtlamalarına (bakınız Malzeme Tablosu) yerleştirin. NOT: Sarılma kısıtlamaları, farelerin dikişleri ve boruları çiğnemek için kafayı kavramasını veya döndürmesini önler.</li>
	<li>Daha sonra, fareleri yumuşak sallanan bir rotatör üzerinde şeffaf bir pleksiglas kutuya yerleştirin ve muhafaza kutusunun yanına yapıştırılmış sıcaklık kontrollü ticari olarak temin edilebilen bir amfibi / sürüngen ısıtma yastığı kullanarak ısıtın. Muhafaza kutusunun köşelerinde steril deiyonize su kapları şeklinde de nemlendirme sağlayın (bkz.</li>
	<li>İzofluran çekilmeden 30 dakika önce, farelere ikinci ağrı kesici dozlarını uygulayın (Buprenex, 0.1 mg / kg, i.p.).</li>
	<li>Deneye bağlı olarak, farelere 1 saat boyunca 0.3 mL / s oranında% 5 glikoz-% 0.9 salin sürekli intraduodenal infüzyon sağlayın. NOT:% 5 glikoz-% 0.9 salin çözeltisi, eczaneden steril bir tuzlu su torbası (insan kullanımı için, pH 7.4) ve% 50 dekstrozun insan kullanımı için steril bir şişe kullanılarak, sterilite için katı kurallara uygun olarak hazırlanır. Çözelti taze yapılmalı ve tuzlu su torbasında veya dekstroz şişesinde verilen son kullanma tarihlerini geçmişse atılmalıdır.</li>
	<li>Fareleri Tablo 1'de listelenen lipitlerden biri ile intraduodenal kanül yoluyla deneysel bir lipit olarak uygulayın (bkz. NOT: Şekil 1'de gösterilen tüm veriler için, SMOFlipid (% 20 lipid enjekte edilebilir emülsiyon, USP, bakınız Malzeme Tablosu) intraduodenal olarak infüze edildi. Bu infüzyon, intraduodenal lipid bolusu öncesi ve sonrası, lenf kanalından boşalan kayıp sıvının yerini alır ve mutlak bir gerekliliktir. Fareler şimdi deneysel bir lipit dozu ile aşılanmaya hazırdır.</li>
	<li>İntra-duodenal infüzyon tüpü aracılığıyla 0.3 mL lipid emülsiyon bolusunun (SMOFlipid% 20 lipid enjekte edilebilir emülsiyonu, USP) klasik lipid infüzyonunu gerçekleştirin (bkz.</li>
	<li>İntraduodenal lipitlerin bolus infüzyonunu takiben, infüzyonu deneyin sonuna kadar sürekli olarak 0.3 mL / s'de% 5 glikoz-% 0.9 saline geri döndürün.</li>
	<li>Lenf örneklerini önceden tartılmış mikrosantrifüj tüplerinde 60 dakika boyunca toplayın ve lenfleri buz üzerinde tutun. Her 60 dakikalık periyotta salgılanan lenf ağırlığını belirlemek için tüpleri ikinci kez tartın. NOT: 0.3 mL lipid bolusundan sonra ~ 6 saat içinde fare başına saatte yaklaşık 50-300 μL lenf toplamayı bekleyin.</li>
	<li>Lenf, lipit infüzyonundan sonra 6 saate kadar akabilir. 6 saatlik zaman noktasında, fareleri izofluran ve servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın. NOT: Deney boyunca hayvanları izlemek için bir cerrah ve / veya laboratuvar teknisyeni bulunmalıdır. Gözlem sırasında, lenfatik drenajdaki pıhtılara ve ağrı / sıkıntıya işaret eden hayvan davranışlarındaki değişikliklere dikkat edin. Lenf kanalı deney sırasında herhangi bir noktada tıkanırsa, deney sonlandırılır ve hayvan ötenazi yapılır. Hayvan teknik olarak ameliyattan sonra 24 saate kadar canlı tutulabilir (IACUC hayatta kalma cerrahisi kurallarına göre). Bununla birlikte, hayatta kalma oranları zamanla azalır ve 6 saat, lipit emiliminin hala in vivo fizyolojiyi taklit ettiği ve hayvanın hayatta kalma ile mücadele etmediği tekrarlanabilir bir hayatta kalma süresidir.</li>
	<li>Ötanazi sonrası terminal doku toplama işlemini gerçekleştirin (adım 3.1). NOT: Ameliyat sonrası 6 saat veya 24 saat boyunca tutulan farelerde diyet lipit emilim profillerindeki fark yakın zamanda test edilmiştir44. 24 saatlik prosedürün hayvan hayatta kalma oranlarını ve diyet lipitlerinin lenf içine girmesini azalttığını bulduk. Bu nedenlerden dolayı, 6-h yaklaşımını şiddetle tavsiye ediyoruz. Bu güncellenmiş cerrahi tasarım, gereksiz hayvan ölümünü ve ameliyat sonrası dönemde hayvan sıkıntısı potansiyelini azaltır. Bu, Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakımı Akreditasyon Derneği'nin hayvan "Değiştirme, İndirgeme, İyileştirme" [ref PMID: 21595115] olan ana hedefini desteklemektedir.</li>
</ol>3. Luminal içeriğin ve mukozal dokunun toplanması
<ol><li>6 saatlik lipid infüzyon periyodunun sonunda, fareleri izofluran ve servikal çıkık yoluyla kurban edin. Luminal içeriğin sızmasını önlemek için midenin, ince bağırsağın ve çekumun her iki ucunu 5-0 dikişle bağlayın.</li>
	<li>Mide, çekum ve kolonu toplayın ve her birini 15 mL'lik bir cam tüpe yerleştirin. İnce bağırsağı üç veya dört bölüme ayırın ve uzunlamasına kestikten sonra dokuyu 2-3 mL soğuk PBS'de durulayarak luminal içeriği toplayın.</li>
	<li>Epitel hücreleri ve ilişkili lamina propriadan oluşan bağırsak mukozasını kas tabakasından 2-3 mL soğuk PBS'de her bir bölümü kavisli bir cımbız ile kazıyarak çıkarın.</li>
	<li>Tüm dokuları, luminal ve mukozal izolatları ve kas tabakasını cam tüplere yerleştirin ve her tüpe 8 mL 2: 1 hacim / hacim CHCl3: MeOH ekleyin.</li>
	<li>Folch ekstraksiyonu45'ten sonra radyoaktivite ve / veya lipit konsantrasyonlarını sıvı sintilasyon sayımı ve / veya bir trigliserit tahlil kiti (bakınız Malzeme Tablosu) ile belirleyin.</li>
</ol>4. İnce tabaka kromatografisi (TLC)
<ol><li>Luminal ve mukozal izolatların toplam lipitlerini modifiye Folch ekstraksiyonu 45 ile ekstrakte edin.</li>
	<li>Ekstrakte edilen lipitleri bir azot evaporatörü altında çözücü içinde kurutun ve daha sonra bir TLC silika jel plakasına yüklemeden önce 2: 1 hacim / hacim CHCl3: MeOH içinde tekrar askıya alın (bkz.</li>
	<li>Petrol eteri, etil eter ve buzul asetik asitten oluşan bir çözücü sistemi kullanarak lipitleri ayırın (25:5:1 vol/vol/vol). Standartlar da dahil olmak üzere farklı lipitlerin görselleştirilmesi için iyot buharı kullanın.</li>
	<li>Sintilasyon sayımı için 4 mL sintilasyon sıvısı ilavesinden önce monogliserit/fosfolipit, digliseritler, yağ asitleri, trigliserit ve kolesterol esterine karşılık gelen TLC plakasındaki lekeleri tek tek sintilasyon şişelerine kazıyın (bkz.</li>
	<li>Verileri toplam bolus lipid dozunun bir yüzdesi veya her örnek için tespit edilen toplam lipitin bir kısmı olarak ifade edin.</li>
</ol>5. Şilomikron izolasyonu ve karakterizasyonu
<ol><li>Kombine lenf örneklerini 6 saatlik post-lipid bolusundan (adım 2.29) ultrasantrifüj tüplerine,% 0.9 NaCl (300-500 μL) ile karıştırılmış olarak aktarın ve daha sonra% 0.87 NaCl (300-500 μL) uygun bir hacimle dikkatlice kaplayın.<ol><li>Ultra santrifüj (bakınız Malzeme Tablosu) numuneleri 110.000 x g'de 4 °C'de 16 saat boyunca kullanın. İzole şilomikronlar içeren üst fraksiyonu toplayın ve bunları yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek şilomikron trigliserit, kolesterol ve apoB konsantrasyonlarını belirleyin.<ol><li>Bir trigliserit ve kolesterol tahlil kiti kullanarak trigliserit ve kolesterol konsantrasyonlarını belirleyin (bkz.</li>
		<li>Kısaca, numunelerin 2 μL'sini 37 ° C'de 200 μL enzim reaktifi ile 96 delikli bir plakada 5 dakika boyunca inkübe edin. Trigliserit için 500 nm ve kolesterol için 600 nm'de bir plaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun. NOT: Konsantrasyonların hesaplanmasında standartlar ve boşluklar kullanılmıştır. ApoB konsantrasyonları Fare ApoB ELISA Kiti kullanılarak belirlendi (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Şilomikron parçacık boyutunu belirleyin.<ol><li>TEM görüntüleme için yaklaşık 40 mg / dL'lik trigliserit konsantrasyonlarında taze şilomikron örnekleri kullanın. Kısaca, her numuneden 5-10 μL'sini bir TEM ızgarasına yerleştirin ve kurutun.</li>
		<li>Izgarayı bir transmisyon elektron mikroskobu ile inceleyin ve görüntüleri yakalayın. Lipoprotein parçacık boyutlarını ölçün ve ImageJ yazılımını kullanarak analiz edin (bkz.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Orijinal 2 günlük lenf fistül prosedürü Bollman ve ark.25 tarafından tanımlanmış ve Patrick Tso'nun laboratuvarı tarafından son 45 yıldır uygulanmıştır26,27. Burada sunulan protokol, ince bağırsağın benzersiz şilokus sekresyonlarının yanı sıra diyet besin emilimi ve metabolizmasının, bağırsak hormonlarının ve bağırsak bağışıklığının in vivo dinamiklerini tanımlamak, ölçmek ve anlamak için bu klasik, altın standart yönteme güçlü bir ektir.
Bu modelin avantajları arasında (1) emilim, sindirim veya sekresyon sırasında bir zaman noktasında statik örnekleme yerine, beslenme ve post-prandial dönem boyunca mezenterik lenfleri sürekli olarak örnekleme yeteneği; (2) bağırsak hormonlarının ve sitokinlerin, seyreltildikleri ve enzimatik olarak parçalandıkları kandan ziyade doğrudan fizyolojik bölmelerinde ölçülmesi17,44; (3) Bir lipid öğününün yutulmasını takiben ince bağırsak tarafından salgılanan lipoproteinleri izole etme, nicelleştirme ve karakterize etme yeteneği ve mezenterik lenflerde endotel lipazlarının yokluğu, şilomikron trigliserit konsantrasyonlarını ve doğal şilomikron yapısını koruyan46,47; (4) lenf akış hızını, trigliserit ve kolesterolün (veya diğer duodenal infüzyonlu bileşiklerin) çıktısını, şilomikron bileşimini ve bağırsak hormonu konsantrasyonlarını doğrudan ölçme yeteneği. Son olarak, bu protokol 6 saatlik bir süre boyunca her saat >50 μL lenf nispeten büyük miktarlarda toplanmasına izin verir. Sıvı intra-duodenal salin ve glukoz infüzyonu ile doldurulduğundan, lenf fistül modeli diğer lenf örnekleme tekniklerine göre önemli ölçüde iyileştirilir ve mezenterik lenflerin statik havuzlarından ziyade akmaya neden olur. Hacim, lipidomik, proteomik ve metabolomik yaklaşımlar için büyük bir engel olduğundan, bu büyük bir güçtür.
Burada tarif edilen 1 günlük fare lenf fistül protokolü, orijinal lenf fistül protokolüne göre, ameliyattan sonra daha yüksek sağkalım oranı nedeniyle daha önce tarif edilen 2 günlük lenf fistül protokollerinden26,27 toplam deney hayvanı sayısında bir azalma da dahil olmak üzere çeşitli avantajlara sahiptir; genel deney süresinde 2 günden tek bir güne azalma; ve son olarak, fareler için iyileşme süresinde, çığır açan ağrının veya kötü ameliyat sonrası sonuçların ortaya çıkabileceği bir gecede (>18 saat), ameliyat sonrası daha yönetilebilir bir ~ 6 saatlik bir döneme kadar bir azalma.
Bu 1 günlük protokolün bir özelliği, insani düşüncelere ve son noktalara odaklanmaktır. Bunlar en yüksek önceliğe sahip olmalıdır: (1) hayvanlar intraduodenal veya IV replasman sıvıları almalıdır; (2) sıcak ve mümkün olduğunca ağrısız tutulmalıdırlar (deneysel tasarıma ve anti-enflamatuar etkilerden kaçınma ihtiyacına bağlı olarak ameliyat sonrası Buprenex ve / veya carprofen ile); (3) kanama, titreme, ishal veya sıkıntı belirtileri, insancıl bir son nokta için zorlayıcı nedenlerdir. Katı IACUC kurallarına göre, izofluran ve ardından servikal çıkık iyi bir son noktadır. Cerrahi sağkalım oranları tek bir gün için ~% 70'tir (orijinal 2 günlük ameliyat için ~% 40 ile karşılaştırıldığında), ancak araştırmacılar deneyi bir sıkıntı belirtisiyle sonlandırmakta tereddüt etmemelidir. Hayvan sayıları planlanırken bu dikkate alınmalıdır.
Bu tekniğin giderilmesi açısından lenf kanülünün başarılı bir şekilde yerleştirilmesi bu cerrahi işlemdeki en büyük darboğazdır. Ameliyatı uygularken, ameliyattan yaklaşık 2 saat önce fareyi 0.3 mL zeytinyağı ile gavage etmeye yardımcı olur. Bu, şilomikronların mezenterik lenf kanalına salgılanmasına neden olacak ve "sütlü" ve daha görünür görünmesini sağlayacaktır. Metilen mavisi de kullanılabilir, ancak genellikle sütlü lenf kanalından daha az belirgindir. Lenf kanülünün yerleştirilmesinden ve yapıştırıcı ile yerleştirilmesinden sonra, mezenterik lenf kanülden bir toplama kabına başarıyla akıyorsa, o zaman bir duodenal infüzyon tüpünün yerleştirilmesine devam edilebilir. Bazen, lenf sürekli akmayabilir, ancak hayvan dönen tablaya yerleştirildiğinde tekrar akmaya başlayabilir. Kritik olarak, lenf tüpü içindeki pıhtılara dikkat edin. Bunlar, lenf kanalındaki geri akış basıncını önlemek için tüplerden masaj yapılmalıdır.
Trigliserit sekresyonuna ve lenf akış hızına ek olarak, bu teknik aşağıdaki lipit absorpsiyon kinetiği ve şilomikron özelliklerini belirlemek için kullanılabilir:
Şilomikron sekresyonu45,48,49 Yağ içeren bir yemeğin hemen ardından, dolaşımdaki plazma trigliseritinde geçici bir artış olur. Trigliseritler doğası gereği hidrofobik olduğundan, önce kanda çözünür olmaları için emülsifiye edilmeleri gerekir50. İnce bağırsak enterositleri bu rolü yerine getirir ve diyet trigliseritini şilomikron emülsiyon parçacıklarına paketler51. Şilomikronlar, çekirdeklerinde kolesterol ve diyet trigliserit içerir, apoB-48, apoA-I, apoA-IV ve apoC-III52,53,54,55 dahil olmak üzere fosfolipitler ve apolipoproteinlerle çevrilidir. ApoB-48 temel yapısal proteindir ve diğer apolipoproteinler şilomikron metabolizması ve kandan temizlenmesi için gerekli çeşitli fonksiyonlara sahiptir. Trigliserit ve apolipoprotein içeriği de dahil olmak üzere şilomikronların temel özelliklerini belirlemek için, burada gösterilen 1 günlük lenf fistül tekniği kullanılmalıdır. Şilomikron sekresyon hızı, lenf içine salgılanan ve saatlik lenf örnekleri sayılarak sintilasyon ile ölçülen infüze edilen 3H-trigliseritin yüzdesidir. Bu, ayrıntılı şilomikron karakterizasyonu 48,49,56,57,58 ile birleştirilebilir. Saatlik lenf örnekleri birleştirilebilir veya ayrı tutulabilir. Lenf ultrasantrifüj tüplerine aktarılır,% 0.9 NaCl ile karıştırılır ve daha sonra% 0.87 NaCl'lik 300-500 μL ile dikkatlice kaplanır. Numuneler daha sonra 16 saat boyunca 4 ° C'de 110.000 x g'de ultra santrifüj edilir. İzole şilomikronlar içeren üst fraksiyonlar, trigliserit tahlil kiti kullanılarak trigliserit konsantrasyonları için toplanır ve test edilir. Kısaca, 2 μL şilomikron (1:10 seyreltme), 96 delikli bir plakada 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 μL enzim reaktifi ile inkübe edilir. Plaka, 500 nm'de bir plaka okuyucu tarafından okunur ve trigliserit konsantrasyonlarının hesaplanması için standartlar ve boşluklar kullanılır. Şilomikron boyutu daha sonra negatif boyama ve iletim elektron mikroskobu (TEM) 14,29 ile belirlenebilir. Trigliserit ve kolesterol, ELISA Kitleri veya Western blot ile kimyasal tahlil ve apolipoprotein içeriği (apoB-48, A-I, C-II, C-III) ile ölçülebilir.
Primer lipid absorpsiyon yerinin belirlenmesi 48,59 3H-trigliserit veya radyo etiketli karışık bir yemeğin infüzyonundan 6 saat sonra duodenum, jejunum ve ileumun luminal ve epitel hücre bölmelerini izole ederek, 3H-trigliseritin ne kadarının epitel hücre zarı boyunca emildiğini (normal) veya ince bağırsağın uzunluğu boyunca lümende (anormal) tutulduğunu belirlemek için içerikler Folch ekstrakte edilir48 . Bu çalışmalar, GI motilitesinde potansiyel farklılıklar varsa 60,61,62, safra asitleri ile ilgili bir hipotez varsa (lipit emilimi boyunca oldukça aktiftir ve kendileri ileumda yeniden emilir)63,64,65,66 veya besinlerin yanlış anatomik yerde (ileum veya hatta kolon) emildiğine dair bir endişe varsa67 özellikle etkilidir. ,68,69,70.
3H-trigliseritin absorpsiyon epitel hücrelerine kaçakçılığının mekanizmalarının belirlenmesi 48 Bu, bağırsak lümeninde 3 H-serbest yağ asidine hidrolize edilmiş, mukozaya emilmiş, ve şilomikron olarak salgılanmadan önce hücre içi 3H-trigliserit içine yeniden esterleştirilmiş 3 H-trigliserit yüzdesinin hesaplanmasıyla gerçekleştirilir. Bu, emilim / sekresyon kusurlarının güçlü bir belirtecidir, çünkü diyet trigliseritinin parçalanma ürünlerine hareketini ve ardından şilomikronlara ambalajını göstermek için izlenebilir. Yağ asidi absorpsiyon makinelerinin mRNA ekspresyonu (CD36, FABP'ler, ACSL'ler), yeniden esterifikasyon yolu (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) ve apolipoproteinler (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) RT-PCR ile daha da ölçülebilir.
Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları sadece bağırsak-organ çapraz iletişimi, metabolizma, bağışıklık, besin emilimi, çevresel diyet kirleticileri veya GI sisteminde rolü olan diğer hastalıklara olan ilgiyle sınırlıdır. Kritik mezenterik lenf sistemine erişimdeki zorluk nedeniyle birçok zorlayıcı deney ve hipotezin durmuş olması muhtemeldir ve bu görselleştirilmiş protokolün amacı bu tekniği daha kolay erişilebilir hale getirmektir. Şilomikronları ve başlangıçta bulundukları mezenterik lenfleri izole etmek, tüm vücut metabolizmasını anlamanın kritik bir parçasıdır; 1 günlük fare lenf fistül modeli, bu olayları incelemek için güçlü bir fizyolojik modeldir.

Mezenterik lenfatik sistemin fizyolojik önemi Mezenterik lenfatikler, Herophilos'un hepatik portal sistemi ve tüm "bağırsaklardaki emici damarları" tanımladığı ~ M.Ö. 300'den beri bir şekilde tanımlanmıştır1,2,3,4,5. Bu ilk tanımlamadan sonra 1.700 yıldan fazla bir süredir, bağırsak lenfatiklerinin tanımlayıcı bir özelliği, bir yemekten kısa bir süre sonra mezenterik lenfte sütlü sıvının varlığıydı3. Artık sütlü, şilomikron içeren lenflerin ("şilous" lenf) portal ven ve karaciğere boşalmadığı, bunun yerine sarnıç şilisinden torasik kanala geçtiği ve nihayetinde sol subklaviyen ven6'daki kana katıldığı bilinmektedir. Bu anatomik düzenleme nedeniyle, şilokus lenf vücudun geri kalanında dolaşmadan önce önce kalp ve akciğerlerden geçer. Bu, kalbin ve akciğerlerin salgılarında mezenterik lenf7'ye "ilk geçiş" yaptığı anlamına gelir.
Mezenterik lenfatiklerin önemli bir rolü, diyet lipitlerinin ince bağırsaktan taşınmasıdır 8,9,10. Anatomik olarak, şilomikronlar, bağırsak bağışıklık hücreleri 11,12,13,14, bağırsak hormonları 15,16,17,18, antijenler 19,20,21, şilomikron olmayan lipofilik bileşikler22,23 ve fazla sıvı enterosit bazal membranının altında yatan lakteallere girer ve daha sonra lenfatik kılcal damarlardan mezenterik lenf nodlarına konsantre edilir. Muhtemelen metabolitler, antijenler, çevresel kirleticiler, besinler ve sinyal molekülleri dahil olmak üzere bilinmeyen birçok mezenterik lenfatik bileşen vardır.
Mezenterik lenf bileşenleri, büyük ölçüde mezenterik lenflerin izole edilmesinin zorluğu nedeniyle sistematik olarak tanımlanmamıştır. Mezenterik lenflere erişmek her zaman ciddi bir zorluk olmuştur, çünkü lenf kanalları renksizdir ve şilokus ve sütlü hale geldiklerinde yağlı bir yemekten sonra hariç, mezenterik lenfatikler renksiz lenfatik sıvı içerir 6,8,9,10.
Bağırsak lenfini izole etmek için güncel ve yaygın yöntemler İnsanlarda mezenterik lenfe erişilemez (ciddi GI travmasının meydana geldiği nadir ve aşırı durumlar hariç)24. İn vivo lenf toplanması cerrahi olarak karmaşık ve zordur. Orijinal 2 günlük lenf fistül prosedürü Bollman ve ark.25 tarafından tanımlanmıştır ve son 45 yıldır Patrick Tso'nun laboratuvarı tarafından geliştirilmiş ve profesyonelleştirilmiştir26,27. Lenf fistülü prosedürü, araştırmacıların 6 saatlik duodenal lipid infüzyon süresi boyunca bilinçli hayvanlardan akan lenfleri toplamasına izin verir.
Lenf fistül modeli esas olarak sıçanlarda lenf akış hızını, trigliserit ve kolesterolün (veya diğer duodenal infüzyonlu bileşiklerin), şilomikron bileşiminin ve bağırsak hormonu konsantrasyonlarının çıkışını ölçmek için kullanılmıştır. Daha az ölçüde, bu teknik farelerde de kullanılabilir, ancak cerrahi sağkalım ve lenf hacmi acı çeker. Mezenterik lenf kanallarını görmedeki zorluklar nedeniyle, tarihsel yöntemler mini domuzlar28, koyun 29, domuz30, köpekler31 ve sıçanlar17 gibi daha büyük hayvanlarda mezenterik lenflerin kanüle edilmesini içermektedir. Bu daha büyük modellerle çalışmak kaynak yoğundur ve nakavt veya nakavt modellerinde çalışmalara izin vermez.
Alternatif yaklaşımlar da kullanılmıştır. Şilomikronlar post-prandial durumda kandan izole edilebilir (ancak bunlar plazma lipoprotein lipaz tarafından kısmen hidrolize edilecektir)32,33,34,35. Torasik kanal da kanüle edilebilir, ancak burada toplanan lenf mezenterik lenf ve ekstraintestinal lenf drenajının bir karışımını içerir26,36. In vitro, Caco-2 hücreleri, yağ asidi tedavisine yanıt olarak şilomikron benzeri bir parçacık salgılar ve bu hücreler ilgili lenfatik endotel veya vasküler hücrelerle birlikte kültürlenebilir37,38. İnsan ve fare bağırsak organoid kültürlerinin apikal lipitleri işlediği ve şilomikronları salgıladığı gösterilmiştir 39,40,41,42. Bu modeller oldukça avantajlıdır ve ince bağırsak fizyolojisine mekanik bakış açısı sağlar, ancak in situ mezenterik lenfatiklerin karmaşıklığını, fizyo-kimyasal gradyanlarını veya dinamik lenf akışını kopyalayamazlar.
Burada sunulan 1 günlük fare lenf fistül modelinin avantajları Bağırsak lipoproteinlerini izole etmenin bu diğer yöntemleriyle ilgili olarak, Tso Lab lenf fistül tekniği geleneksel olarak diyet besinlerinin mezenterik lenf içine emilimini ölçmek için altın standart teknik olarak kabul edilmiştir. Bu in vivo teknik, diyet lipit emiliminin temel fizyolojik yönlerini yakalama avantajına sahiptir - emilim süresi boyunca bileşiklerin dinamik görünümü, bu da duodenal besinlerle canlı hayvanlarda akan mezenterik lenflerin tekrarlanan örneklemesini gerektirir. Bu cerrahi teknik aynı zamanda bağırsak hormonlarını ve sitokinleri, seyreltildikleri ve enzimatik olarak parçalandıkları kandan ziyade doğrudan fizyolojik bölmelerinde ölçer17,43.
Deneysel soru, lipid sekresyon dinamiklerinin veya herhangi bir hidrofobik GI bileşiğinin veya ilacının dinamik emilimini ve metabolizmasını anlamayı gerektiriyorsa, bu teknik sadece uygun değil, aynı zamanda luminal içeriğin proksimalden distal bağırsağa (mideden kolona) ve apikalden bazolateral yüzeye (luminal içerikler enterosit yoluyla lakteallere ve portal dolaşıma) hareketini interpolasyona tabi tutan tek yaklaşımdır. Bu teknik, besinlerin intraduodenal kateter yoluyla luminal olarak verilmesini kullandığından ve akan mezenterik lenf yönlendirildiğinden ve toplandığından, tüm absorpsiyon aparatı deneysel kontrol altındadır ve ince bağırsak emilim profillerini kalitatif olarak değerlendirmek için kullanılabilir.
Burada ilk kez görsel olarak sunulan, Tso Lab lenf fistül modelinde, (1) deneysel süreyi 1 günlük cerrahi implantasyon ve deneysel toplama süresine indirgeyen önemli bir güncellemedir; (2) fare hayatta kalma ve hayvan refahı hususlarını iyileştirir; ve (3) fare genetik modellerinin gücünden yararlanmak için farelerde yaklaşımın tekrarlanabilirliğini arttırır. Bu teknik, bağırsak sekresyonları, lipoproteinler veya diyet lipit emilimi ile ilgili tüm deneysel sorular için altın bir standart olarak düşünülmelidir ve lipit emilim kinetiğinin ve şilomikronların yüksek doğrulukta belirlenmesi için en iyi tekniktir.

<table><tbody><tr><td>% 0.9 Sodyum Klorür Enjeksiyonu, USP ve nbsp; steril</td><td>Hospira, Lake Forest, IL, ABD</td><td>NDC 0409-4888-06</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL Eppendorf tüpleri</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>7200184</td><td></td></tr><tr><td>14C-kolesterol: Kolesterol - [4-14C] (0.1mCi / mL)</td> <td>Amerikan Radyoaktif İşaretli Kimyasallar A.Ş., St. Louis, MO, ABD</td><td>ARC 0857</td><td></td></tr><tr><td>18 G iğne</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ABD</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont mikro diseksiyon forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları, Foster City, CA, ABD</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>2 Forseps</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet Co., Gaithersburg, MD, ABD</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>3H-TAG:&nbsp; Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/ mL)</td><td>Amerikan Radyoaktif İşaretli Kimyasallar A.Ş., St. Louis, MO, ABD</td><td>ART0199</td><td></td></tr><tr><td>3H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG)</td><td>Amerikan Radyoaktif İşaretli Kimyasallar, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>%50 Dekstro Enjeksiyonu, USP 25 gram/50 mL&nbsp; steril</td><td>Hospira, Göl Ormanı, IL, ABD</td><td>NDC-0409-6648-16</td><td></td></tr><tr><td>Analtech TLC Uniplates: silika jel matris Z265500-1PAK</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>11-101-0007</td><td></td></tr><tr><td>BD CareFusion ChloraPrep Swabstick</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, US</td><td>14-910-501</td><td></td></tr><tr><td>Betadine cerrahi önlük</td><td>Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Eğimli kesim kanül</td><td>Braintree Bilimsel.,&nbsp; Braintree, MA, ABD</td><td>MRE025</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin HCl Enjeksiyon Carpuject PFS 0.3mg / mL 10 / Bx (Buprenex)</td> <td>HenrySchein, Warrendale, PA, ABD</td><td>1278184</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6 / J erkek fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChloraPrep</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ABD</td><td>260100</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol Test Kiti</td><td>FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, ABD</td><td></td><td></td>99902601</tr><tr><td>Kolesterol-[4-14C]</td><td>Amerikan Radyoaktif İşaretli Kimyasallar, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf pleksiglas kutu L43cm X W26 X H 21, sıcaklık kontrollü ısıtma yastığı ve nemlendirme</td><td></td><td></td> ile <td>kendi tasarımımız ve modifikasyonlarımız</td></tr><tr><td>ticari olarak temin edilebilir&nbsp; amfibi / sürüngen ısıtma yastığı ShenZhen</td><td>XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, Çin</td><td>XHC-F035D</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk uçlu aplikatörler</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, US</td><td>22363156</td><td></td></tr><tr><td>Duodenal infüzyon tüpü - canuala</td><td>Braintree Scientific, Braintree, MA, US</td><td>MRE037</td><td></td></tr><tr><td>Abbott Nutrition, Columbus, OH</td><td></td><td></td><td>Sirkülasyonlu</td></tr><tr><td>ılık su pompası kombinasyonu ile ısıtma yastığı cerrahi platformu</td><td>sağlayın Patterson Scientific, Waukesha, WI, US</td><td>Gaymar T/ Pompa Klasik</td><td></td></tr><tr><td>Hetarin Sodyum Enjeksiyonu, USP 1.000 birim/mL steril</td><td>Mylan, Morgantown, WV, ABD</td><td>NDC-67457-384-31</td><td></td></tr><tr><td>Resim J Yazılım</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüsü, Bethesda, Maryland,</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>İris makası</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet A.Ş., Gaithersburg, MD, ABD</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Piramal İlaç Çözümleri, Riverview, MI, ABD</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran indüksiyon aparatı ve Anestezi Aparatı</td><td>Patterson Scientific, Waukesha, WI, ABD</td><td>fare indüksiyon odası</td><td></td></tr><tr><td>Krazy tutkal</td><td>Elmer'in ürünleri Inc., Columbus, OH, ABD</td><td>KG484</td><td></td></tr><tr><td>Liposyn III% 20 lipid enjekte edilebilir</td><td>Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 Çok Amaçlı Sintilasyon Sayacı</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro diseksiyon Yaylı Makas</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet Co, Gaithersburg, MD, ABD</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Fare apoB ELISA Kiti</td><td>ABCAM Inc., Waltham, MA, ABD</td><td>ab230932-1</td><td></td></tr><tr><td>İğne Tutucu</td><td>Güzel Bilim Araçları, Foster City, CA, ABD</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Ekartörler</td><td>Kent Scientific Co., Torrington, CT, ABD</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofen)</td><td>Zoetis Inc., Kalamazoo MI, ABD</td><td>4019449</td><td></td></tr><tr><td>Döner tabla Barnstead Thermolyne</td><td>Labquake, Z&uuml; zengin, İsviçre</td><td>Barnstead Thermolyne</td><td></td></tr><tr><td>SMOFlipid% 20 lipid enjekte edilebilir emülsiyon, USP</td><td>Fresenius Kabi, Warrendale, PA, ABD</td><td>NDC-63323-820-01</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biyomedikal A.Ş., Notre-Dame-de-l'&Icirc; le-Perrot, QC J7V 7M4, Kanada</td><td>MS 02.5PM</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Makas</td><td>ROBOZ Cerrahi Alet Co., Gaithersburg, MD, ABD</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sütür (iğneli 5-0 ipek)</td><td>DemeTECH, Miami Lakes, FL, ABD</td><td>DT-719</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon Elektron Mikroskobu (JEOL 1400-FLASH 120KV</td>) <td>JEOL, Peabody, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trigliserit Test Kiti</td><td>Randox Laboratuvarları, Crumlin, İngiltere</td><td>TR210</td><td></td></tr><tr><td>ULTIMA GOLD XR Sintilasyon Sıvısı</td><td>Perkin Elmer, Hebron, KY, US</td><td>6013119</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj, rotor S100AT4-497</td><td>SORVALL RC M120 GX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

diyet lipid emiliminin ve Şilomikron sekresyonunun İn vivo kinetiğini Ölçmek için farelerde akan mezenterik lenflerin İzolasyonu

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

Bağırsak lipoproteinleri, özellikle trigliserit bakımından zengin şilomikronlar, metabolizma, inflamasyon ve kardiyovasküler hastalıkların önemli bir itici gücüdür. Bununla birlikte, bağırsak lipoproteinlerinin izole edilmesi in vivo olarak çok zordur, çünkü ilk önce ince bağırsaktan mezenterik lenfatiklere salgılanırlar. Şilomikron içeren lenf daha sonra yemeğin bileşenlerini kalbe, akciğerlere ve nihayetinde tüm vücut dolaşımına iletmek için torasik kanaldan subklaviyen damara boşalır. Naif şilomikronları izole etmek kandan imkansızdır, çünkü şilomikron trigliserit, dolaşımdaki lipoprotein lipaz ve diğer lipoprotein reseptörleri ile etkileşime girdikten hemen sonra hidrolize uğrar. Bu nedenle, sıçanlarda Bollman ve ark. tarafından tanımlanan orijinal 2 günlük lenf fistül prosedürü, tarihsel olarak torasik ven içine girmeden önce taze mezenterik lenfleri izole etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, son 45 yıldır Patrick Tso'nun laboratuvarı tarafından geliştirilmiş ve profesyonelleştirilmiştir ve bu kritik lipoproteinlerin ve bağırsaktan salgıların analizine izin verilmiştir. Tso lenf fistül prosedürü güncellendi ve ilk kez görsel olarak burada sunuldu. Bu revize edilmiş prosedür, bir duodenal besleme tüpü takmak, mezenterik lenf kanalını kanüle etmek ve bilinçli farelerde bir yemekten sonra lenf toplamak için tek günlük bir cerrahi tekniktir. Bu yeni tekniklerin başlıca faydaları arasında farelerden lenf reproducibly toplama yeteneği (genetik fare modellerinin gücünden yararlanır); duodenal infüzyon tüpünün ve lenf kanülünün implantasyonu sırasında fareler için azaltılmış anestezi süresi; beslenme ve post-prandial dönem boyunca lenfleri sürekli örnekleme yeteneği; kandaki seyreltme ve enzimatik hidrolizden önce hormonları ve sitokinleri nicel olarak ölçme yeteneği; ve bağırsak lipoproteinlerini izole etmek için büyük miktarlarda lenf toplama yeteneği. Bu teknik, diyet besin emilimini, bağırsak lipoprotein sentezini ve şilomikron sekresyonunu doğrudan ve nicel olarak ölçmek için güçlü bir araçtır.

Şekil 2 , mezenterik lenflerde trigliserit sekresyonunu ve burada tarif edilen tek günlük lenf fistül prosedürünü geçiren en son n = 17 vahşi tip (WT) farede ortalama lenf akış hızlarını göstermektedir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, lenflerdeki trigliserit konsantrasyonu, 300 μL SMOFLipid'in intraduodenal bolusuna yanıt olarak artar. Pik trigliserit konsantrasyonuna bolus sonrası ~ 2-3 saatte ulaşılır ve 6 saatlik süre boyunca (ötenaziden hemen önce) istikrarlı bir şekilde azalır. Trigliserit sekresyonuna paralel olarak, lenf akış hızı Time 0 bolus infüzyonundan deneyin sonuna kadar artar (Şekil 2B).
Bu sonuçlar, hem mezenterik lenf kanalının hem de intraduodenal kanülün cerrahi implantasyonunun gerçekleştiğini ve diğer lenfatik içeriklerin (hormonlar, peptitler, besinler) karşılaştırılabileceği pozitif bir kontrolü temsil ettiğini göstermektedir. Bolus intraduodenal lipitlerine yanıt olarak lenflerdeki trigliserit konsantrasyonunda bir değişiklik yoksa, bu, ameliyatın ince bağırsakta önemli hasara neden olduğunu, böylece lipit emme kapasitesinin bulunmadığını veya daha önce fenotipli olmayan genetik modellerde, farenin lipit emiliminde fizyolojik olarak anlamlı bir kusura sahip olduğunu gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig01.jpg"> Şekil 1: Lenf fistül fare modeli için önerilen zaman çizelgesi. T-4, T-3, T-2: Çift kanülasyon yaklaşık 2-4 saat sürer, ardından farelerin iyileşme odalarına yerleştirilmesi gerekir. T-1: Fareler iyileşme periyoduna girdikten sonra,% 5 glikoz-% 0.9 salin sürekli bir duodenum infüzyonu alırlar. T0: Sürekli intraduodenal infüzyon% 5 glikoz-% 0.9 salinden deneysel besin infüzyonuna geçirilir. T0-T6: Fareler, salin veya alternatif olarak sürekli besinler içinde sürekli intraduodenal% 5 glikoz alırlar. Bu dönemde lenf saatlik olarak toplanır. Son nokta: Fareler ötenazi yapılır ve dokular toplanabilir. Figür BioRender.com ile oluşturuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig02.jpg"> Şekil 2: Mezenterik lenf trigliserit konsantrasyonu ve akış hızı. Vahşi tip farelere intraduodenal beslenme tüpü ve mezenterik lenf kanülü takıldı. Fareler 300 μL lipitlik bir bolus infüzyonu aldı. Lenf 6 saat boyunca saatlik alikotlarda toplandı ve buz üzerinde tutuldu. (A) Lenf trigliserit içeriği, her saatlik lenf alikotunda kimyasal bir tahlil ile belirlendi. (B) Bolus infüzyonundan sonraki 6 saat içinde, lenf akışı saatte salgılanan lenf gramı olarak çizilir. Puanlar SEM'± araçlardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lipid Dağıtım Yöntemleri</td>
			<td colspan="6">Öneriler/Talimatlar</td>
		</tr><tr><td>Karışık lipid emülsiyon bolusu</td>
			<td colspan="6">İntra-duodenal infüzyon tüpü yoluyla ( A ) Liposyn III% 20 lipid enjekte edilebilir veya (B) SMOFlipid% 20 lipid enjekte edilebilir emülsiyon, USP'nin 0.3 mL'lik bir dozu kullanılabilir. Bu emülsifiye lipitler yararlıdır çünkü önceden hazırlanmaları gerekmez, oda sıcaklığında sıvıdırlar, sterildirler ve serbest yağ asitleri, trigliserit, fosfolipitler ve sodyum taurokolatın "kolayca sindirilebilir" bir karışımını içerirler. Bu, pankreas veya safra yetmezliği olabilecek fareler için iyi bir başlangıç infüzyonudur.</td>
		</tr><tr><td>Trigliserit bolus</td>
			<td colspan="6">Doymamış yağ, domuz yağı (yüksek doymuş yağ içeriğine sahip bir diyetin yansıtıcısı) veya hindistancevizi yağı (yüksek orta zincirli trigliserit içeriğine sahip bir diyetin yansıtıcısı) bakımından zengin bir diyeti yansıtan nötr bir lipit olarak 0.3 mL hafifçe ısıtılmış zeytinyağı (veya saflaştırılmış triolein), hepsi intra-duodenal infüzyon tüpü veya oral gavaj ile verilebilir. Deneysel trigliserit doymuş ise, oda sıcaklığında sıvı olması için ısıtılmalıdır.</td>
		</tr><tr><td>Karışık yemek bolusu</td>
			<td colspan="6">0.3 mL 0.075 g yağ (% 21.6), 0.5 g karbonhidrat (% 64.0) ve 0.1125 g protein (% 14.4) içeren ve az yağlı karışık bir yemeği yansıtan formülasyon ile sağlayın, intra-duodenal infüzyon yoluyla uygulanabilir.</td>
		</tr><tr><td>Radyoaktif işaretli lipid bolus</td>
			<td colspan="6">5.0 μCi3H etiketli gliserol trioleat ve / veya 0.3 mL zeytinyağında 1.0 μCi 14C-kolesterol, duodenal infüzyon yoluyla verilebilir. 14 C-kolesterol: Kolesterol-[4-14C] 55Ci / mmol spesifik aktivitesi ve 0.1mCi / mL konsantrasyonu ile. 3 H-TG Triolein [9,10-3H(N)] (3H-TG), spesifik aktivitesi 60Ci/mmol ve konsantrasyonu 1mCi/mL olan</td>
		</tr><tr><td>Sürekli doz</td>
			<td colspan="6">Yukarıdaki deneysel besin formülasyonlarından herhangi birinin 0.3 mL / s oranında (0.3 mL toplam bolus yerine) infüzyonu, lenf içine sabit bir trigliserit çıkışı ile sonuçlanacaktır. Bu, lenflerdeki trigliserit konsantrasyonunun ~ 2-3 saatte zirveye ulaştığı ve daha sonra ~ 6-8 saatte başlangıç konsantrasyonlarına geri döndüğü bir bolus infüzyonundan farklıdır.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Lipid infüzyonları tablosu.

Bu protokol, farelerde intraduodenal besin infüzyonlarına yanıt olarak akan bağırsak lenfini izole etmek için ayrıntılı bir cerrahi protokolü tanımlamaktadır. Bu, çeşitli deneysel besinlere yanıt olarak toplam bağırsak lipit emiliminin ve şilomikron sentezinin ve sekresyonunun fizyolojik olarak belirlenmesini sağlar.

Diyet Lipid Emiliminin ve Şilomikron Sekresyonunun İn Vivo Kinetiğini Ölçmek için Farelerde Akan Mezenterik Lenflerin İzolasyonu

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, ...

Protokolümüz, akan mezenterik lenflerde postprandiyal metabolizmayı doğrudan ölçmemizi sağlar. Bu güçlüdür, çünkü besinlerin ince bağırsaktan lenf içine hareketini nicel olarak belirleyebiliriz. Ve sitokinleri, diyet lipitlerini, diğer diyet bileşenlerini ve lenfositleri ölçebiliriz.Bu teknik, lenf içine hareket eden diyet lipitlerinin dinamiklerini, şilomikronların sentezini ve sekresyonunu incelememize yardımcı olabilir. Burada sunulan bir günlük modelin birkaç avantajı vardır. İlk olarak, deneysel zamanı azaltır.İkincisi, hayvan stresini azaltır. Hayvanların hayatta kalmasını arttırır. Ve genel olarak, deney sayısını azaltır.Bugün tekniğimizi gösteren, Kıdemli Laboratuvar Cerrahımız Bay Nick Dedousis olacak. Ve Araştırma Bilimcimiz Dr. Lihong Teng. Fareyi ameliyata hazırladıktan sonra, cildi cımbızla kavrayın ve küçük makasla orta hat karın kesisi yapın.Daha sonra, sternuma doğru ve kasık yağına doğru kesin. Retraktörü kullanarak, lenf kanalı görünene kadar periton iç organlarını yoldan uzaklaştırın. Tuzlu suya batırılmış bir Q-ucu kullanarak, karaciğeri vücudun sağ üst tarafına ve bağırsakları ve mideyi hayvanın soluna doğru hareket ettirin.Daha sonra duodenumu enine sola doğru gererek superior mezenterik arteri ve bağırsak lenf kanalını açığa çıkarın. Künt bir iğne sokarak 30 ila 40 santimetre uzunluğunda bir kanül tüpü hazırlayın. Daha sonra, bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, tüpün içinden az miktarda heparin yıkayın ve makas kullanarak kanül borusunun ucunda bir eğim kesin.Ardından, makalede açıklandığı gibi iris makası kullanmak için sığ bir kesi ve lenf kanalı yapın. Kanül borusunu bir çift ince forseps ile tutun ve uç eğimini yavaşça kanala yerleştirin. Lenf kanalı kırılgan olduğundan, kateteri bir dikişle bağlamak yerine lenf kanülünü mezenterik lenf içine yapıştırmak için bir damla siyanoakrilat kullanın.Şimdi, 18 gauge'lik bir iğne kullanarak, midenin pilorik bölgesinden pilor sfinkterine doğru bir delik açın ve duodenal infüzyon tüpünü mideye pilor sfinkterinin bir ila iki milimetre ötesinde duodenuma yerleştirin. Daha sonra, tüpü bir ipek 5/0 dikiş kullanarak bir çanta ipi bağı ile mideye sabitleyin ve sızıntıyı önlemek için bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı ile kapatın. % 5 glikoz ve% 0.9 salin intraduodenal infüzyonuna başlayın.Vücut boşluğundaki organları değiştirin ve orta hat insizyonunu dikin. Fareyi nazikçe sıkıca tutturulmuş bir kısıtlamaya yerleştirin. Farelere bir saat boyunca sürekli intraduodenal salin ve glikoz infüzyonu sağlayın.Kanülü lenf akışı açısından kontrol edin ve lenf akışını sürdürmek için lenf kanülünü sağmaya başlayın. İntraduodenal infüzyon tüpü yoluyla 0.3 mililitrelik lipid emülsiyon bolusunun klasik lipid infüzyonunu gerçekleştirin. Daha sonra, infüzyonu, deneyin sonuna kadar sürekli olarak saatte 0.3 mililitrede% 5 glikoz ve% 0.9 saline geri döndürün.Lenf örneklerini toplayın ve mikro santrifüj tüplerini 60 dakika boyunca önceden tartın ve lenfleri buz üzerinde tutun. Her 60 dakikada bir salgılanan lenf ağırlığını belirlemek için tüpleri ikinci kez tartın. Mide, çekum ve kolonu toplayın ve her organı 15 mililitrelik bir cam tüpe yerleştirin.İnce bağırsağı üç veya dört bölüme ayırın. Uzunlamasına kesin ve dokuyu iki ila üç mililitre soğuk PBS ile durulayarak luminal içeriği toplayın. Epitel hücrelerini ve ilişkili lamina propria'yı içeren bağırsak mukozasını kas tabakasından, her bölümü iki ila üç mililitre soğuk PBS'de kavisli bir cımbız ile kazıyarak çıkarın.Tüm dokuları, luminal ve mukozal izolatları ve kas tabakasını cam tüplere yerleştirin. Lenflerdeki trigliserit konsantrasyonu, 300 mikrolitre SMOFlipid'in intraduodenal bolusuna yanıt olarak artmıştır. Pik trigliserit konsantrasyonuna bolus sonrası iki ila üç saatte ulaşılır ve altı saatlik süre boyunca istikrarlı bir şekilde azalır.Lenf akış hızı, sıfır bolus infüzyonundan deneyin sonuna kadar artar. Bu protokolün temel amacı, hayvan stresini azaltmak, hayatta kalma oranını artırmak ve anestezi süresini azaltmaktı. Bunu başarmak için, Bollman emniyet kafeslerini takılmalar için değiştirdik ve nem, sıcaklık ve sıvı ikmali ekledik.Bir günlük topallama fistül protokolümüz, gerçek zamanlı, in vivo, lipit emilim dinamiklerini ölçmemizi sağlar. Aynı zamanda bağırsak organı çapraz iletişimi, metabolizması, diyet besin emilimi ve bağışıklık fenotiplerini incelememizi sağlar.

the-isolation-flowing-mesenteric-lymph-mice-to-quantify-vivo-kinetics

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endotelyal endotel / glycocalyx yüzey tabakası ideal intravital mikroskobu kullanılarak incelenmiştir. Intravital mikroskop teknik gibi akciğer gibi hareketli bir organ zordur. Biz eş zamanlı aydınlık ve floresan mikroskop serbestçe-hareket eden endotel yüzey tabakasının kalınlığını belirlemede nasıl kullanılabileceğini...

Fare Pulmoner Endotelyal Yüzey Katman in vivo ölçümü olarak

Burada, sıçanlarda mezenterik lenf kanalını kanüle etmek için bir tekniği tarif ediyoruz, bu da bağırsak doğumunu takiben lenfatik sistem yoluyla lipid ve ilaç taşınmasının nicelikini sağlar. Teknik, mezenterik lenf konsantrasyonlarını ve/veya sıvının, bağışıklık hücrelerinin, peptitlerin, proteinlerin ve lipofilik moleküllerin taşınmasını değerlendirmek için uyarlanabilir.

Mezenterik Lenf Kanal Kanüllü Rat Modeli: Bağırsak Lenfatik İlaç Ulaştırma Değerlendirilmesine Uygulaması

Caco-2 hücreleri, lipitlerin ve yağda çözünen ilaçların/vitaminlerin enterosit taşınmasını incelemek için in vitro bir model olarak hizmet edebilir. Geçirgen membran sistemi, apikal kısmı bazolateral bölmeden ayırırken, lentivirüs ekspresyon sistemi etkili bir gen aşırı ekspresyon yöntemi sunar. Lipoproteinlerin izolasyonu TEM ile doğrulanır.

Bağırsak tarafından Lipit Transport Eğitim için Caco-2 hücreleri kullanarak

Neonatal domuzlarda efferent lenflerden büyük miktarlarda lipid metabolizması bileşenlerini toplamak için bağırsak lenf gövdesini kateterize etmek için cerrahi bir prosedür sunuyoruz.

Yenidoğan Domuzların Lenf Bağırsak Lenf Trunk ve Koleksiyonu Uzun Vadeli Kateterizasyon

Bağırsak lenfositlerinin kantitatif karakterizasyonuna, bu hücrelerin çeşitli bağırsak ve sistemik hastalıklarda kritik bir rol oynadığının giderek daha fazla tanınması nedeniyle artan bir ilgi vardır. Bu protokolde, sonraki akış sitometrik karakterizasyonu için tek hücreli popülasyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini açıklıyoruz.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Bu makale, farelerde lipid metabolizmasını değerlendirmek için üç kolay ve erişilebilir test sağlar.

Farelerde Tüm Vücut Lipid Taşıma Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Bu protokol, mezenterik lenf düğüm zinciri boyunca dört istasyonun her biri için güvenli ve iyi tolere edilen fare mezenterik lenfadenektomyatı için bir hayatta kalma prosedürünü tanımlar. Bu prosedür, distal kolon, proksimal kolon ve/veya ince bağırsak ile lenfatik iletişimin seçici olarak bozulmasına olanak tanıyacak şekilde uyarlanabilir.

Bölgeye Özgü Bağırsakla Lenfatik İletişimin Seçici Bozulması İçin Molin Mezenterik Lenfadenektomi

Öğrenin, farelerde akan mezenterik lenf izolasyonu ile diyet lipid emilimi ve şilomikron sekresyonunun in vivo kinetiğini ölçme yöntemini. Bu teknik metabolizma ve bağışıklık etkileşimlerini gerçek zamanlı gözlemlemeyi sağlar.

Diyet Lipid Emiliminin ve Şilomikron Sekresyonunun İn Vivo Kinetiğini Ölçmek için Farelerde Akan Mezenterik Lenflerin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal

Diyet Lipid Emiliminin ve Şilomikron Sekresyonunun İn Vivo Kinetiğini Ölçmek için Farelerde Akan Mezenterik Lenflerin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet