Name: İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Keşfedin nanobar destekli lipid çift katmanlı sistem ile membran eğriliği algılama proteinlerinin dinamiklerini in vitro ortamda karakterize etme yöntemini. Bu teknik hücresel süreçleri anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi'ndeki (NTU) Yıkıcı Fotonik Teknolojiler Merkezi'ne (CDPT), nanoyapı imalatını ve SEM görüntülemeyi destekledikleri için, protein saflaştırma için Biyolojik Bilimler Okulu NTU'daki Protein Üretim Platformu'na (PPP) ve konfokal mikroskop için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu'na teşekkür ederiz. Bu çalışma, Singapur Eğitim Bakanlığı (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 ve MOE-T2EP30220-0009), Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri programı kapsamında MOE finansmanı tarafından desteklenen Dijital Moleküler Analitik ve Bilim Enstitüsü (IDMxS), İnsan Sınırı Bilim Programı Vakfı (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao) tarafından finanse edilmektedir. Araştırma bursu için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu (X. Miao) ve araştırma bursu için Çin Burs Konseyi (J. Wu).

1. Nanoçip temizliği
<ol><li>Nanoçipi, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mL'lik bir beherin içine yerleştirin. NOT: Bu kuvars nanoçip,21'den önce açıklandığı gibi elektron ışını litografisi ile üretilmiştir. Çip üzerindeki nanoyapının geometrisi ve düzenlemesi özel olarak tasarlanabilir. Burada kullanılan gradyan nanoçubuklarının boyutları 2000 nm uzunluğunda, 600 nm yüksekliğinde ve 100 ila 1000 nm genişliğindedir (100 nm adım seti).</li>
	<li>Beher'e dikkatlice 1 mL% 98 sülfürik asit ekleyin ve asidin çipin ön ve arka tarafını tamamen kapladığından emin olun. NOT: %98 sülfürik asit son derece aşındırıcıdır ve cilt veya gözlerle temas ettiğinde hızlı doku yıkımına ve ciddi kimyasal yanıklara neden olabilir. Duman davlumbazında uygun koruma ile kullanın.</li>
	<li>Beheri yavaşça döndürün ve tüm beher ısınana kadar damla damla damla 200 μL% 30 hidrojen peroksit ekleyin. Sülfürik asit ve hidrojen peroksitin, organik moleküllerin nanoçip17'den uzaklaştırılması için piranha çözeltisi oluşturmak üzere iyice karıştırıldığından emin olun. SLB'yi daha önce açıklandığı gibi UV ışığı ve ozona maruz kalma gibi temiz hidrofilik yüzeylerde üretmek için alternatif teknikler vardır23. NOT: Reaksiyon son derece ekzotermiktir ve çözeltinin kaynamasına neden olabilir, bu nedenle sülfürik aside damla damla hidrojen peroksit ekleyin ve dönmeye devam edin.</li>
	<li>Beheri ikincil bir cam kaba yerleştirin ve safsızlıkları iyice temizlemek için nanoçipi gece boyunca piranha çözeltisine batırılmış halde tutun. NOT: Reaksiyonun gaz üretebilmesi ihtimaline karşı beheri herhangi bir örtü olmadan davlumbazın içine yerleştirin.</li>
	<li>Beheri çıkarın ve piranha çözeltisini dikkatlice bir asit atık kabına pipetleyin.</li>
	<li>Artık asidi seyreltmek ve asit atığına atmak için beherin içine 5 mL deiyonize su yükleyin. Bu adımı beş kez tekrarlayın ve asit atıklarını nötralize etmek için 5 M NaOH kullanın.</li>
	<li>Çipi cımbızla alın ve artık asidi iyice gidermek için sürekli bir deiyonize su akışıyla yıkayın. SLB oluşumu22 için çipi %99,9 azot gazı ile fön ile kurulayın.</li>
</ol>2. Küçük unilamellar veziküllerin (SUV'lar) üretimi
<ol><li>Kehribar bir şişeye 100 μL kloroform ekleyin. NOT: Kloroform oldukça uçucu, renksiz bir sıvıdır ve solunması veya yutulması durumunda toksik olabilir. Maske ve eldivenler açıkken duman başlığında kullanın.</li>
	<li>500 μg lipit karışımını kloroform içinde çözün. Burada kullanılan lipit karışımının bileşimi% 89.5 mol yumurta fosfatidilkolinleri (PC), beyin fosfatidilserin (PS) 10 mol% ve Texas Red 1,2-dihekzadekanoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, trietilammonyum tuzu (Texas Red DHPE) 0.5 mol'dür.</li>
	<li>Şişedeki lipit karışımını, kloroform uçucu hale gelene ve lipit karışımı kuruyana kadar% 99.9 azot gazı ile üfleyerek kurutun. NOT: Bu adım duman davlumbazında yapılmalıdır. Fön ile kuruturken sıvı sıçramasından kaçının.</li>
	<li>Kehribar şişede bulunan lipit karışımını kapaksız olarak alüminyum folyo kaplı vakumlu kurutucuya yerleştirin. Daha sonra kloroformu tamamen uçucu hale getirmek için numuneyi bir pompayla 3 saat vakumla kurulayın.</li>
	<li>Flakona 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ekleyin. Çözeltiyi homojen olana kadar vorteksleyin. NOT: PBS tamponu, kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı içermeyen 150 mM NaCl'den oluşur; pH, PC ve PS lipit çift katmanlı hale getirmek için 7.2'ye ayarlanır.</li>
	<li>Bir banyo sonikatöründe lipit karışımını 30 kHz frekansında 50 dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra lipit karışımını 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve parafilm ile kapatın.</li>
	<li>Lipid karışımını sıvı azotta 20 s dondurun ve ardından bir su banyosunda 2 dakika boyunca 42 ° C'de çözün. Donma-çözülme döngülerini 30 kez tekrarlayın. Bundan sonra, lipit karışımı berrak bir sıvı gibi görünür. DİKKAT: Sıvı azot yaklaşık -195.8 °C kaynama noktasına sahiptir. Donma veya kriyojenik yanıklara neden olabilir. Isı yalıtım eldivenleri ile sınırlı olmayan alanda kullanın.</li>
	<li>İki cam gaz geçirmez şırıngayı ve mini ekstrüderin konektörünü sırasıyla etanol, kloroform ve metanol ile durulayın. Aparatı önceden temizlemek için durulama sırasını beş kez tekrarlayın. Organik çözücü tamamen uçucu hale gelene kadar onları duman davlumbazında bırakın.</li>
	<li>Mini ekstrüder aparatını monte edin ve aparatı önceden ıslatmak için konektörden 500 μL PBS tamponunu geçirin, ardından tamponu başka bir şırıngadan atın. Bu adım safsızlıkları giderir ve ekstrüzyonu kolaylaştırır.</li>
	<li>Mini ekstrüder aparatını 100 nm gözenek boyutunda bir polikarbonat filtre membranı ile birleştirin. NOT: Filtre zarının gözenek boyutu, lipozomların çapını belirler.</li>
	<li>Şırıngalardan biriyle 500 μL PBS tamponu alın ve diğer ucundaki ikinci boş şırıngayı doldurmak için yavaşça filtreden geçirin. Aparat sızıntısını kontrol etmek için ekstrüzyonu üç kez ileri geri tekrarlayın ve tamponu ikinci şırıngadan atın.</li>
	<li>PBS tamponunu değiştirmek için lipit karışımını mini ekstrüderden geçirin. Daha sonra SUV'ları oluşturmak için 20 kez ileri geri ekstrüzyon yapın. Veziküllerin çok katmanlı karakteri, SLB oluşumunu etkileyecek yetersiz sayıda ekstrüzyon süresi ile korunabilir23.</li>
	<li>Daha büyük parçacıklarla kirlenmeyi azaltmak için SUV'ları ikinci şırıngadan toplayın ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. NOT: Şırınganın kopması ihtimaline karşı şırıngayı doğrudan konektörden çıkarın.</li>
	<li>Floresan etiketli lipitlerin ağartılmasını önlemek için tüpü alüminyum folyo ile sarın ve 4 ° C'de saklayın. Genellikle, SUV'lar 7 güne kadar saklanabilir.</li>
</ol>3. Bir nanoçip üzerinde SLB'nin oluşumu
<ol><li>Temizlenmiş nanoçipi deiyonize sudan bir çift cımbızla dikkatlice çıkarın ve% 99.9 azot gazı ile fön ile kurutun.</li>
	<li>Nanoçipin yüzey temizliğini 1 saat boyunca hava plazma işlemi ile yapın.</li>
	<li>Nanoçipi, iki parça PDMS-bir orta PDMS ve bir üst PDMS'den oluşan bir polidimetilsiloksan (PDMS) odasında birleştirin (Şekil 1A). Orta PDMS, nanobar desenine yeterli pozlama sağlamak için merkezde oval şekilli büyük bir açıklık ile ince (~ 0,5 mm) dir. Üst PDMS kalındır (~4,0 mm), büyük oval açıklık içinde sıvı kullanımı için bir giriş ve çıkış olarak iki küçük delik vardır.<ol><li>Çipi, desen yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin.</li>
		<li>Orta PDMS'yi çiple yavaşça örtün ve tüm desenin orta PDMS'deki büyük oval şekilli açıklığın merkezi alanına maruz kaldığından emin olun.</li>
		<li>Üst PDMS'yi orta PDMS ile örtün ve iki küçük deliğini orta PDMS'nin büyük oval deliği bölgesinde tutun. Daha sonra PDMS odası monte edilir. NOT: PDMS en yaygın kullanılan silikon bazlı organik polimerdir. Biyouyumlu, şeffaf ve mikroskop altında çip montajı ve görüntüleme için özelleştirilmiş bir şekil olarak tasarlanmak üzere deforme olabilir. Daha da önemlisi, plazma işleminden sonra kovalent olarak başka bir PDMS tabakasına veya cama sıkıca yapıştırılabilir, bu da SLB'yi hazırlamak için oda olarak uygun hale getirir. Bu adım, boşlukları ve sızıntıyı önlemek için her PDMS katmanının sıkıca takılmasını sağlar.</li>
	</ol></li>
	<li>SUV'ları üst PDMS'deki iki küçük delikten birinden PDMS odasına bir pipetle yükleyin ve SLB'yi oluşturmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBS tamponunu küçük deliğin bir tarafından PDMS odasına nazikçe pipetleyin ve bağlanmamış SUV'ları yıkamak için atıkları diğer delikten pamuklu bir tomurcukla çıkarın. Daha sonra nanoçip üzerinde oluşturulan SLB'yi edinin (SLB'nin kalitesi, adım 4.4'te gösterildiği ve temsili sonuçlar bölümünde tartışıldığı gibi fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) ile test edilir). NOT: PBS tamponunu hazneye pipetlediğinizde, herhangi bir kabarcık enjekte edilmemesi için pipet ucu tamponla dolu ve sıvı yüzeyiyle temas halinde olmalıdır.</li>
</ol>4. SLB'nin ve nanoçip üzerindeki eğrilik algılama proteininin bağlanmasını görüntüleme
NOT: Bu bölüm, deney için mevcut mikroskop sistemine bağlı olacaktır. Burada, görüntülemenin nasıl yapılacağına dair genel bir kılavuz açıklanacaktır. Ayrıntılı ayarlar farklı mikroskop kurulumları arasında değiştirilebilir.
<ol><li>100x (N.A.1.4) yağ hedefi kullanarak lazer tarama konfokal mikroskopisini ayarlayın. Lipid ve proteinin floresansını uyarabilecek uyarma lazer gücünü seçmek için ZEN yazılımını açın. Texas Red DHPE / EGFP> Akıllı Kurulum > Edinme modunu seçin.</li>
	<li>Nanobar kenarları lipit kanalının altında keskin olana kadar çip üzerindeki nanoçubukları bulmak için odak düğmesiyle odağı ayarlayın.</li>
	<li>Protein eklemeden önce lipit kanalının kontrol görüntüsünü elde etmek için tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Çerçeve Boyutu = 512 piksel x 512 piksel (512 piksel x 512 piksel, 124 nm piksel boyutu), Piksel Başına Bit = 16 (16 bit derinlik), Tarama hızı = 5 ve Ortalama = 4 (dört kez/çizgi ortalama modu).</li>
	<li>FRAP tahlilini, floresan etiketli lipit çift katmanını rastgele tek bir nanobar alanı üzerinde ağartarak yapın.<ol><li>Deneme Bölgeleri ve Ağartma onay kutularını seçin. Merkezdeki tüm nanobarı içerebilen 5 μm çapında dairesel bir alan çizin (nanobar boyutu 2 μm'dir) ve Deney Bölgelerine ekleyin. Hızlandırılmış görüntüleme parametrelerini aşağıdaki örnekte olduğu gibi girin: Tarama hızı = 9 ve Ortalama = 1'i seçin. Zaman Serisi > Süre = 100 döngü ve Aralık = 2 sn'yi seçin. Ağartma parametrelerini aşağıdaki örnekte olduğu gibi girin: # görüntülerden sonra başla onay kutusunu seçin ve üç görüntü seçin.</li>
		<li>FRAP gerçekleştiren lazer onay kutularını seçin ve gücü %100,0 olarak değiştirin. FRAP denemesi için Denemeyi Başlat'ı tıklatın. NOT: FRAP, hücresel moleküllerin hareketliliğini karakterize etmek için yaygın bir yöntemdir. SLB iyi akışkanlığa sahipse, ağartılmış alandaki floresan, ağartılmış floroforlar yayıldıkça ve diğer alanlardan ağartılmamış floroforlar yayıldıkça yavaş yavaş iyileşecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein çözeltisini PDMS odasına yükleyin ve proteinin SLB üzerine bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. NOT: Şekil 2G,H'de lipid bileşimini göstermek için kullanılan proteinler, nanobar kavisli SLB'lerde protein bağlanmasını kolaylaştırır 74 μM GFP ve 79 μM GFP-His'tir. Bu iki protein, His-etiketi olmayan veya His-etiketi olan yeşil floresan proteinlerdir. Şekil 4 ve Şekil 5'te eğrilik algılama çalışması için kullanılan proteinler 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 ve 16 μM FBAR + IDRFBP17'dir. Bu üç protein, sezgisel olarak hem eğrilik jeneratörleri hem de sensörler olarak kabul edilen tipik bir BAR proteini olan FBP17'nin alanlarıdır. Her protein hacmi 20 μL'dir.</li>
	<li>Nanobarları yeniden odaklayın ve protein eğriliği algılama tespiti için hem lipit hem de protein kanallarının görüntülerini almak için adım 4.3'ü tekrarlayın.</li>
	<li>FRAP testini hem lipit hem de protein kanallarında yapmak için adım 4.4'ü tekrarlayın ve eğrilik algılama proteininin hareketliliğini karakterize etmek için hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.</li>
</ol>5. Nanoçipin yeniden kullanımı
<ol><li>Nanoçipi cımbızla alın ve deiyonize suyla doldurulmuş 50 mL'lik bir beherde PDMS odasından dikkatlice ayırın. NOT: Bu kritik bir adımdır. Cımbızların nanoyapıya temas etmesini önleyin ve çatlakları önlemek için çipi ayrılmaya zorlamayın.</li>
	<li>Yüzeye yapışmış organik kalıntıları gidermek için nanoçipi susuz etanol ile iyice yıkayın. NOT: Susuz etanol ile yıkamadan önce yüzeydeki suyu çıkarmak için temiz mendil kağıdı kullanın. DİKKAT: Susuz etanol oldukça uçucu ve hafif tehlikeli bir kimyasaldır. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Maske ve eldivenler açıkken duman başlığında kullanın.</li>
	<li>Artık etanol çıkarmak için çipi bol miktarda deiyonize suyla iyice yıkayın. Daha sonra çipi %99,9 azot gazı ile kurulayın. NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce çip üzerindeki tüm etanol izlerini çıkarmak önemlidir, çünkü piranha asidi organik çözücü ile şiddetli reaksiyona girebilir ve patlamalara neden olabilir.</li>
	<li>Çipi, desen tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir 10 mL beherine yerleştirin ve çipi, 'nanoçipin temizlenmesi' ile aynı adımları izleyen yeniden kullanım için piranha çözeltisi ile temizleyin.</li>
</ol>6. Görüntü ölçümü
<ol><li>Bir mikroskop tarafından elde edilen görüntüleri, nanobar dizisi Fiji yazılımında sonraki analizler için dikey konumda olacak şekilde döndürün.</li>
	<li>Tek tek nanobarı hem lipit kanalında hem de protein kanalında kare bir maske (51 piksel x 51 piksel) ile bulmak için özel olarak yazılmış bir MATLAB kodu 'c_pillarmask_averaging' kullanın. NOT: Bu MATLAB kodu nanoçip için özel olarak tasarlanmıştır. GitHub'da şu bağlantı aracılığıyla edinilebilir: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.</li>
	<li>MATLAB kodu 'BarGra_avg'daki meshgrid işleviyle görüntünün köşelerindeki üç ROI (5 piksel x 5 piksel) ile her görüntünün arka plan sinyallerini çıkarın. Bu işlem, mikroskop kurulumunun veya mikroskop aşamasında çip tesviyesinin neden olduğu potansiyel düzensiz arka plan gürültülerini düzeltmeyi amaçlamaktadır.</li>
	<li>MATLAB kodu 'BarGra_avg' kullanarak aynı büyüklükteki nanobarların ortalama görüntülerini oluşturun, burada her bir nokta, tüm bireysel nanobar kare maskelerinde o noktadaki değerlerin ortalamasıdır. Nanoçubukların etrafındaki ortalama sinyal dağılımını sezgisel olarak göstermek için Fiji yazılımındaki ortalama görüntülerin 3B yüzey grafiklerini oluşturun. Poligon Çarpanı için > Yüzey Grafiğini Analiz Et > Giriş 100'ü seçin ve Gölge, Çizim Ekseni ve Pürüzsüz onay kutularını seçin.</li>
	<li>Her nanobarı, floresan yoğunluklarını sırasıyla MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' ile çıkarmak için iki nanobar uç alanı ve bir nanobar merkezi alanı içeren üç alana ayırın. Nanobar ROI'lerinin boyutları, 'konum' dosyası kullanılarak nanobarların boyutuna göre ayarlanır.</li>
	<li>Yüzey alanı etkisini hariç tutan nanobar-uç yoğunluğunu elde etmek için protein yoğunluklarını çubuk uç alanındaki 'avg_nanobar_quantification' MATLAB kodundan çıkarılan lipit yoğunluklarına bölün.</li>
	<li>Bağlanma eğrisini elde etmek için nanobar uç yoğunluğunu GraphPad Prizma'da farklı konsantrasyonlarla çizin. Analiz menüsünü açın. Eğriyi Hill denklemine uydurmak için Doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) > Bağlama - Doygunluk > Tepe eğimi işleviyle özel bağlama'yı seçin ve ardından KD ve Tepe katsayısı değerini hesaplayın.</li>
	<li>Lipid ve protein yoğunlukları, MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' kullanılarak aynı görüntüde elde edilen 600 nm nanobar merkezinde karşılık gelen yoğunluklarına normalleştirilir.</li>
	<li>Aynı büyüklükteki nanobarlarla protein eğriliği algılamasını ölçmek için nanobar uç alanında normalleştirilmiş protein yoğunluklarının en parlak dokuz pikselini çubuk merkez alanına bölünerek kullanın, değer "uçtan merkeze oran" olarak adlandırılır. Farklı büyüklükteki nanobarlarla protein eğriliği algılama aralığını ölçmek için lipit yoğunluğunu normalleştirmek için normalleştirilmiş protein yoğunluğunun oranını kullanın, değer "Normalleştirilmiş Nanobar-Uç Yoğunluğu" olarak adlandırılır. Bu değerler MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' ile hesaplanır.</li>
	<li>FRAP yığını görüntüsünü Fiji yazılımına yükleyin. FRAP alanını seçin ve bir yatırım getirisi oluşturun. Her seferinde FRAP alanının yoğunluğunu ölçmek için Daha > Çoklu ölçüm işlevini seçin. FRAP kurtarma eğrisini oluşturmak için yoğunluğu GraphPad Prizma'da çizin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Yazarlar bu çalışmada rakip bir finansal çıkar olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan nanobar-SLB sistemi, mevcut birkaç in vitro tahlildeki avantajların benzersiz bir kombinasyonunu sunmaktadır. Proteinlerin lipozom yüzdürme veya sedimantasyon testi olarak yüksek oranda kavisli membranlara tercihli bağlanmasını etkili bir şekilde ortaya çıkarır, ancak çok daha az numune gerektirir ve bireysel nanobarlarda daha doğru tanımlanmış eğrilik sunar 8,29. Ayrıca, SLB hareketli olduğundan ve sürekli olarak nanobarların tüm boyutl...

Membran eğriliği, morfogenez, hücre bölünmesi ve hücre göçü1 gibi çeşitli hücresel süreçlerde meydana gelen bir hücrenin kritik bir fiziksel parametresidir. Membran eğriliğinin hücresel olayların basit bir sonucunun ötesinde olduğu artık yaygın olarak kabul edilmektedir; bunun yerine, protein etkileşimlerinin ve hücre içi sinyalleşmenin etkili bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, klatrin aracılı endositozda yer alan birkaç proteinin tercihen kavisli membrana bağlandığı ve endositoz2 için bir sıcak nokta oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Membran deformasyonunun sitoiskelet kuvvetleri tarafından membran çekilmesi, farklı büyüklükte kafa gruplarına sahip lipit asimetrisinin varlığı, konik şekilli transmembran proteinlerinin varlığı, BAR-domain proteinleri (Bin, amfifin ve Rvs proteinlerinden sonra adlandırılmıştır) gibi membran şekillendirici proteinlerin birikmesi ve amfipatik helislerin membrana yerleştirilmesi gibi birçok farklı nedeni vardır1 . İlginç bir şekilde, bu proteinler ve lipitler sadece zarı deforme etmekle kalmaz, aynı zamanda membran eğriliğini algılayabilir ve tercihli birikim gösterebilir1. Bu nedenle, farklı eğriliklere sahip membranların, bunlara bağlı proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini ve ilgili hücre içi süreçler üzerindeki potansiyel etkilerini değiştirip değiştirmediğini ve nasıl değiştirdiğini incelemek çok önemlidir.
Hem canlı hücre hem de in vitro sistemlerde kavisli membran ve proteinler arasındaki etkileşimi analiz etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Canlı hücre sistemi, zengin lipit çeşitliliği ve dinamik protein sinyal regülasyonu 2,3,4,5,6,7 ile gerçek bir hücre ortamı sağlar. Bununla birlikte, böyle sofistike bir sistemin, hücre içi ortamdaki belirsizlikler ve dalgalanmalar nedeniyle incelenmesi zordur. Bu nedenle, bilinen lipit türlerinden ve saflaştırılmış proteinlerden oluşan yapay bir membran kullanan in vitro testler, proteinler ve kavisli membranlar arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için güçlü sulandırma sistemleri haline gelmiştir. Geleneksel olarak, farklı çaplardaki lipozomlar, eğriliğe duyarlı proteinleri, santrifüj kuvveti kullanan bir ko-sedimantasyon testi veya protein agregasyonunu önlemek için yoğunluk gradyanına sahip bir ko-yüzdürme testi yoluyla tespit etmek için ekstrüzyon ile üretilir 8,9. Bununla birlikte, ekstrüde lipozomların eğriliği, ekstrüder10'da kullanılan membran filtresinin mevcut gözenek boyutu ile sınırlıdır. Tek lipozom eğriliği (SLiC) testinin, farklı çaplara sahip lipozomların floresan etiketli olduğu ve yüzeye hareketsiz hale getirildiği, böylece eğriliğin floresan yoğunluğu11 ile işaretlenebildiği bu sınırlamanın üstesinden geldiği kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, küçük veziküllerde lipit bileşiminde güçlü değişkenlik gözlenmiştir, bu da eğrilik ölçümünün doğruluğunu etkiler12. Tether çekme deneyleri, optik bir cımbız kullanarak dev unilamellar veziküllerden (GUV'ler) çekilen geçici tether üzerindeki eğriliğin daha doğru bir ölçümünü sağlar, burada eğrilik13,14 üretilen membran gerilimi tarafından iyi kontrol edilebilir. Bu yöntem, pozitif veya negatif eğrilik algılama proteinlerini incelemek için uygundur, ancak tüp nesil10'un verimi ile sınırlıdır. Desteklenen membran tüpleri (SMrT) testi, mikroakışkan akışlarla aynı lipit rezervuarından ekstrüde edilen çoklu membran tüplerinin eşzamanlı olarak üretilmesini sağlar. Bununla birlikte, membran eğriliği nanotüp boyunca içsel olarak değişir, bu da floresan yoğunluğuna dayalı eğrilik ölçümünün doğruluğunu tehlikeye atar15,16. Buna karşılık, tasarlanmış topografyaları içeren yüzeylerde desteklenen bir lipit çift katmanlı (SLB) oluşturmak için küçük unilamellar veziküller (SUV'lar, çap <100 nm 17) kullanarak, nanofabrikasyon veya nanomalzemeler tarafından önceden belirlenmiş eğriliklere sahip tek bir çift katmanlı membran üretti18,19,20.
Burada, nanobar dizileri ile imal edilmiş nanoçip yüzeylerinde SLB'nin oluşumu ve proteinlerin in vitro eğrilik hassasiyetini araştırmak için nasıl kullanılabileceği için bir protokol sunuyoruz. Şekil 1'de gösterildiği gibi, tahlilin altı temel bileşeni vardır: A) Çipin mikroakışkan bir oda ile temizlenmesi ve montajı; b) Tanımlanmış lipit bileşimine sahip SUV'ların hazırlanması; C) SLB'nin bir nanoçip üzerinde oluşumu ve eğriliğe duyarlı proteinlerle bağlanması; d) Floresan mikroskobu altında SLB ve eğriliğe duyarlı proteinlerin görüntülenmesi ve karakterizasyonu; e) Çipin yeniden kullanılmak üzere temizlenmesi; f) Protein eğriliği algılama yeteneğinin kantitatif analizi için görüntü işleme. Ayrıntılı protokol aşağıda adım adım açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Susuz Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Elmas</td><td>RN0879999FU</td><td></td></tr><tr><td>Amber Flakon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27115-U</td><td></td></tr><tr><td>Beyin PS: L-&alfa;-fosfatidilserin (Beyin, Domuz) (sodyum tuzu)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>840032</tr><tr><td>10 mL Beher</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211060804</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Beher</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211061706</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Beher</td><td>Schott-Duran</td><td>SCOT211065408</td><td>İkinci kap&nbsp;</td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V800117</td><td></td></tr><tr><td>Pamuk tomurcukları</td><td>Watsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18: 1 DGS-NTA (Ni): 1,2-dioleoil-sn-glisero-3 - [(N- (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) süksinil] (nikel tuzu)</td> <td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>790404</tr><tr><td>Yumurta PC: L-&alfa; -fosfatidilkolin (Yumurta, Tavuk)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>840051</tr><tr><td>F-BAR</td><td>Protein Üretimi Plaftorm, Biyolojik Bilimler Okulu, Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur</td><td></td><td>Proteinler ve peptit</td></tr><tr><td>F-BAR+IDR</td><td>Protein Üretimi Plaftorm, Biyolojik Bilimler Okulu, Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur</td><td></td><td>Proteinler ve peptit</td></tr><tr><td>GFP</td><td>Protein Üretimi Plaftorm, Biyolojik Bilimler Okulu, Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur</td><td></td><td>Proteinler ve peptit</td></tr><tr><td>GFP-His</td><td>Protein Üretimi Plaftorm, Biyolojik Bilimler Okulu, Nanyang Teknoloji Üniversitesi, Singapur</td><td></td><td>Proteinler ve peptit</td></tr><tr><td>GraphPad Prizma</td><td>GraphPad</td><td>V9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit,% 30 (Sertifikalı ACS)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>İnsan</td> FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.'den H325-500 <td></td></tr><tr><td>IDR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri</td><td>1.50d</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Taramalı Konfokal Mikroskopi</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>Airyscan</td><td>100x (N.A.1.4) yağ objektifli LSM 800.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher bilimsel</td><td>10010240</td><td></td></tr><tr><td>Mini-extuder&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipidler, Inc.</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL</td><td>Mikrotüpler Greiner</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2018b</td><td></td></tr><tr><td>Çekirdek Gözenek Hidrofilik Membran, 0.1 & mu; m</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Tuzlu Su (PBS)</td><td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) Tabanı</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloksan (PDMS) Çapraz Bağlayıcı</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Temizleyici</td><td>HARRICK PLASMA</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>Kuvars Nanoçip</td><td>Donghai İlçesi Alfa Kuvars Ürünleri CO., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Teksas Kırmızısı DHPE: Teksas Kırmızısı 1,2-Dihekzadekanoil-sn-Glisero-3-Fosfoetanolamin, Trietilamonyum Tuzu</td><td>Yaşam Teknolojileri Holdings Pte Ltd.</td><td></td><td></td>T1395MP</tr><tr><td>Cımbız</td><td>Gooi</td><td>PDC-002-HP</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik Temizleyiciler</td><td>Elma</td><td>D-78224</td><td></td></tr><tr><td>Voterx</td><td>Scientific Industries</td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu Kurutucu</td><td>NUCERITE</td><td>5312</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>Julabo</td><td>TW8</td><td></td></tr></tbody></table>

İn vitro membran eğriliği algılama proteinlerinin Çalışması için nanobar destekli bir lipid Çift katmanlı sistem

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Membran eğriliği, hücre göçü, hücre bölünmesi ve vezikül kaçakçılığı gibi hücrelerin çeşitli temel süreçlerinde önemli roller oynar. Sadece hücresel aktiviteler tarafından pasif olarak üretilmez, aynı zamanda protein etkileşimlerini aktif olarak düzenler ve birçok hücre içi sinyallemede rol oynar. Bu nedenle, membran eğriliğinin proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini düzenlemedeki rolünü incelemek büyük değer taşımaktadır. Son zamanlarda, kavisli membran ve protein in vitro arasındaki ilişkiyi incelemek için birçok teknik geliştirilmiştir. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında, yeni geliştirilen nanobar destekli lipit çift katmanlı (SLB), önceden tanımlanmış bir membran eğriliği ve yerel düz kontrol ile desenli nanobar dizileri üzerinde sürekli bir lipit çift katmanı oluşturarak membran eğriliği üretiminde hem yüksek verim hem de daha iyi doğruluk sunar. Hem lipit akışkanlığı hem de kavisli membranlara protein duyarlılığı, floresan mikroskopi görüntüleme kullanılarak kantitatif olarak karakterize edilebilir. Burada, nanobar dizileri içeren fabrikasyon cam yüzeylerde bir SLB'nin nasıl oluşturulacağına ve bu SLB üzerinde eğriliğe duyarlı proteinlerin karakterizasyonuna ilişkin ayrıntılı bir prosedür tanıtılmaktadır. Ek olarak, nanoçip yeniden kullanımı ve görüntü işleme protokolleri ele alınmaktadır. Nanobar-SLB'nin ötesinde, bu protokol eğrilik algılama çalışmaları için her türlü nanoyapılı cam çipine kolayca uygulanabilir.

Nanobar tasarımı, nanobar genişliği ile tanımlanan eğrilik ve merkezde yerel olarak bir düz / sıfır eğrilik kontrolü ile her iki ucunda yarım daire içeren pozitif eğrilik algılama proteinlerini araştırmak için önerilir (Şekil 2A, B). SLB'nin nanobarlar üzerinde başarılı bir şekilde oluşturulması, Şekil 2C'de gösterildiği gibi tüm nanobar yüzeyi boyunca eşit olarak dağılmış lipit işaretleyici sinyalleri ile sonuçlanır. Birden fazla nanobardan gel...

Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Bu nanobar destekli lipit çift katmanlı sistem, hücre aktiviteleri sırasında protein ve lipitlerin dinamiklerini ve dağılımını düzenlemede membran eğriliğinin rolünü incelemek için kullanılabilir. Bu teknik, yüksek çözünürlüklü nanofabrikasyon ile önceden tanımlanmış membran eğriliği ile patent nanobar hataları üzerinde sürekli bir lipit çift katmanı oluşturarak membran eğriliği üretiminde hem yüksek alt kök hem de kötü sunar. Başlamak için, nano çipi desen tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mililitrelik bir beherin içine yerleştirin.Beher'e dikkatlice bir mililitre% 98 sülfürik asit ekleyin ve asidin çipin ön ve arka tarafını tamamen kapladığından emin olun. Beheri yavaşça döndürün ve tüm beher ısınana kadar damla damla damla 200 mikrolitre% 30 hidrojen peroksit ekleyin. Sülfürik asit ve hidrojen peroksitin, organik moleküllerin nano çipten uzaklaştırılması için Piranha çözeltisi oluşturmak üzere iyi karıştırıldığından emin olun.Beheri ikincil bir cam kaba koyun ve safsızlıkları iyice temizlemek için nano çipi gece boyunca Piranha çözeltisine batırılmış halde tutun. Beheri çıkarın ve Piranha çözeltisini dikkatlice bir asit atık kabına pipetleyin. Artık asidi seyreltmek ve asit atığına atmak için beherin içine beş mililitre deiyonize su yükleyin.Bu adımı beş kez yineleyin. Çipi cımbızla alın ve artık asidi iyice gidermek için sürekli bir deiyonize su akışıyla yıkayın. SLB oluşumu için talaş %99,9 azot gazı ile üflenerek kurutun.Lipid karışımını 30 dakika boyunca sonikleştirin. Lipit karışımını sıvı azotta 20 saniye dondurun ve ardından bir su banyosunda iki dakika boyunca 42 santigrat derecede çözün. Donma/çözülme döngülerini 30 kez tekrarlayın.Bundan sonra, lipit karışımı berrak bir sıvı gibi görünür. Lipit karışımını mini ekstrüderden geçirin ve 20 kez ileri geri ekstrüzyon yapın. Daha büyük parçacıklar veya yabancı madde ile kontaminasyonu azaltmak için SUV'ları diğer taraftaki şırıngadan toplayın ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.Temizlenmiş nano çipi deiyonize sudan bir çift cımbızla dikkatlice çıkarın ve% 99,9 azot gazı ile fön ile kurulayın. Bir saat boyunca hava plazma işlemi ile nano çipin yüzey temizliğini yapın. Nano çipi bir PDMS odasına monte edin.Çipi, desen yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirerek başlayın. Orta PDMS'yi çiple yavaşça örtün ve tüm desenin orta PDMS'deki oval şekilli büyük açıklığın merkezi alanına maruz kaldığından emin olun. Üst PDMS'yi orta PDMS ile örtün ve iki küçük deliğini orta PDMS'nin büyük oval deliği bölgesinde tutun.Daha sonra, PDMS odası monte edilir. SUV'ları üst PDMS'deki iki küçük delikten birinden PDMS kanalına bir pipetle yükleyin ve SLB'yi oluşturmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. PBS tamponunu küçük deliğin bir tarafından PDMS kanalına nazikçe pipetleyin ve bağlanmamış SUV'ları yıkamak için atıkları diğer delikten pamuklu bir tomurcukla çıkarın.Ardından nano çip üzerinde oluşan SLB'yi edinin. 100 x yağ hedefi kullanarak lazer taramalı konfokal mikroskopiyi ayarlayın. Lipid ve proteinin floresansını uyarabilecek uyarma lazer gücünü seçmek için Zen yazılımını açın.Edinme Modu'nu seçin. Ardından Akıllı Kurulum'a ve ardından Texas Red'e tıklayın. Nano çubuk kenarları lipit kanalının altında keskin olana kadar çip üzerindeki nano çubukları bulmak için odak düğmesiyle odağı ayarlayın.Protein eklemeden önce lipit kanalının kontrol görüntüsünü elde etmek için tarama parametrelerini ayarlayın. FRAP tahlilini, rastgele tek bir nanobar alanı üzerinde floresan etiketli lipit çift katmanlı ağartarak yapın. Deneme Bölgeleri ve Ağartma onay kutularını seçin.Merkezdeki tüm nanobarı içerebilen beş mikrometre çapında dairesel bir alan çizin ve deney bölgelerine ekleyin. TimeLapse görüntüleme parametrelerini girin. Zaman Serisi'ni seçin.Ardından Süre'yi tıklayın. 100 döngü ve iki saniyeye eşit aralık seçin. Giriş ağartma parametreleri.FRAP gerçekleştiren lazer onay kutularını seçin ve FRAP denemesi için gücü %100 Denemeyi Başlat'a değiştirin. Protein çözeltisini PDMS kanalına yükleyin ve proteinin SLB üzerine bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Nanoçubukları yeniden odaklayın ve protein eğriliği algılama tespiti için hem lipit hem de protein kanallarının görüntülerini almak için tarama parametrelerini ayarlayın.Deney Bölgeleri'ni seçin ve FRAP testini hem lipit hem de protein kanallarında yapın ve eğrilik algılama proteininin hareketliliğini karakterize etmek için TimeLapse görüntüleme gerçekleştirin. Her ikisi de 300 nanometre genişliğinde SLB kaplı bireysel nanobarların ucunda artan birikim göstermektedir. Burada SLB, protein bağlanmasını elektrostatik olarak arttırmak için% 10 PS içerir.Her iki protein de lipitlerden daha yüksek bir uç-merkez oranına sahiptir, bu da yaklaşık bir tanesidir. IDR FBP17 ve F-Bar'ı karşılaştırırken, IDR FBP17'nin daha yüksek uçtan merkeze oranı, F-Bar'dan daha güçlü eğrilik algılamasını gösterir. Her üç protein de, eğrilik çapı 400 nanometrenin altına düştüğünde nanobar uç kavisli membran bölgelerinde tercihli birikim gösterdi.Bu üç protein alanı arasında, IDR FBP17 en yüksek nano çubuğu ve yoğunluğu verir, bu da en güçlü eğrilik algılama yeteneğini gösterirken, F-Bar en düşük değeri gösterir. Protein bağlanma eğrisi, IDR FBP17'nin güçlü bir işbirlikçi eğrilik algılama yeteneğine sahip olduğunu gösteren protein konsantrasyonunu kademeli olarak artırarak çizilebilir. Nanobarlardaki lipit sinyallerinin hızlı geri kazanımı ile karşılaştırıldığında, F-Bar iki dakika içinde iyileşemez, bu da kavisli membran bölgelerinde membran hareketliliğinin ve ilişki dinamiğinin önemli ölçüde azaldığını gösterir.Şaşırtıcı bir şekilde, F-Bar'ın davranışından farklı olarak, IDR FBP17 sinyalleri, kavisli membranlarda biriken IDR FBP17'nin dinamik doğasını gösteren, aynı zaman diliminde belirgin bir iyileşme gösterdi. Bununla birlikte, çözümdeki bağlanmamış IDR FBP17'yi temizledikten sonra, IDR FBP17 kanalında eskisi gibi aynı iyileşme gözlenemedi. SLB kalitesi, kavisli membran ve protein arasındaki etkileşimi incelerken çok önemlidir.Bu nedenle, membran hareketliliğini doğrulamak için deneyimizde FRAP testi gereklidir. Bu sistem, araştırmacıların eğrilik algılama alanları ve lipit bileşimi gibi kavisli membran ile protein etkileşimini etkileyen çeşitli parametreleri incelemelerine ve yüz ayırma davranışları gibi kavisli membran üzerinde dinamik çalışmalar yapmalarına yardımcı olacaktır.

a-nanobar-supported-lipid-bilayer-system-for-study-membrane-curvature

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Membran protein fonksiyonu, hücre zarı lipid bileşimi tarafından düzenlenir. Bu video-makale nasıl değişmiş membran özellikleri gazetecilere olarak çift katlı yama elektrotlar, hem de nasıl kullanılacağı gibi gramicidin kanallarını kullanarak bir yama oluşturmak için ayrıntıları.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Bu videoda, toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak in vitro olarak cam destekli bir lipid çift tabakası üzerinde septin organizasyonunu araştırmak için bir prosedür gösteriyoruz.

Düzlemsel Destekli Lipid Bilayer Deneyi: Biyolojik Membran Mimiklerinde Septin Montajını Araştırmak İçin Mikroskopi Tabanlı İn Vitro Teknik

Bu video, lipid çift katmanları ile kaplanmış mikroküreler üzerinde septin protein düzeneğini inceleme tekniğini açıklar. Bu teknik, eğri yüzeyler üzerindeki eğriliğe bağlı protein düzeneklerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Küresel Destekli Lipid Çift Tabakalı Deney: Mikroküreler Üzerinde Septin Düzeneğini Gözlemlemek İçin Bir Teknik

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Çoğu protein hücredeki hissediyorum ve membran eğriliği neden. Membran nanotüpler lipid veziküller eğri membranlar içinde vitroetkileşim proteinler veya herhangi bir eğrilik aktif molekül çalışmaya üzerinden çekmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

Biz bir protokol vitro için zihin ve benim kendi kendine organizasyon deneyleri desteklenen lipid bilayer açık bir odasında üzerinde sağlar. Ayrıca, biz tepki doğumdan tarafından vivo koşulları taklit için PDMS microcompartments lipid kaplı tahlil içine alın anlatan.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.

Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Septinler sitoiskelet proteinleridir. Lipid membranlarla etkileşime girerler ve mikron ölçeğinde membran eğriliğini algılayabilir ancak aynı zamanda üretebilirler. Bu protokolde membran deformasyonlarını, eğriliğe duyarlı septin bağlanmasını ve septin filament ultrayapısını analiz etmek için aşağıdan yukarıya in vitro metodolojileri tanımladık.

Septinlerin Ultrayapısal Organizasyonunu, Membran Yeniden Şekillendirmesini ve Eğrilik Duyarlılığı Davranışını Analiz Etmek için Aşağıdan Yukarıya In Vitro Yöntemler

Hücresiz resusyon, sitoiskelet düzeneğini anlamak için önemli bir araç olmuştur ve son on yıldaki çalışmalar, septin dinamiklerini minimal sistemlerde incelemek için yaklaşımlar oluşturmuştur. Burada septin montajını farklı membran bağlamlarında gözlemlemek için üç tamamlayıcı yöntem sunulmaktadır: düzlemsel çift katmanlılar, küresel destekler ve çubuk destekleri.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Keşfedin nanobar destekli lipid çift katmanlı sistem ile membran eğriliği algılama proteinlerinin dinamiklerini in vitro ortamda karakterize etme yöntemini. Bu teknik hücresel süreçleri anlamak için değerlidir.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Daha fazla video keşfet