Name: Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Öğrenin, pirosekanslama ile mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin genotiplenmesini. Bu yöntem, patojenik varyantların heteroplazmi düzeylerini belirleyerek mitokondriyal hastalıkların tanısını kolaylaştırır ve maliyet etkin bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Silvia Marchet ve Constanza Lamperti'ye (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) bu protokol için açıklayıcı örnekler olarak kullanılan m.3243A>G cybrid hücrelerini hazırladıkları ve sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Mitokondriyal Genetik Grubu (MRC-MBU, Cambridge Üniversitesi) üyelerine bu araştırma sırasında yararlı tartışmalar için teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma, İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi'nin (MC_UU_00015/4 ve MC_UU_00028/3) çekirdek finansmanı ile desteklenmiştir. P.A.N. ve P.S.-P. ayrıca sırasıyla Lily Vakfı ve Champ Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Bu çalışmada kullanılan insan 3243A>G cybrid hücrelerinin ve ölümsüzleştirilmiş m.5024C>T MEF'lerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam verilmiştir. Hasta hücreleri Cambridge Üniversitesi'nde toplanmadığı için bu durumda etik onay gerekli değildi. Bununla birlikte, insan fibroblastlarının kullanımı etik onay gerektirebilir. Pirosekans için örnek DNA'yı hazırlarken PCR kurulumu için en iyi uygulamaları takip etmeniz şiddetle tavsiye edilir. Aynı primerlerin kullanıldığı sık amplifikasyon, amplikon kontaminasyonuna yol açabilir ve PCR öncesi ve PCR sonrası alanlar arasında katı bir ayrım gözlenmezse, sonraki genotiplemeye önyargı getirebilir. Burada sunulan boru hattı, tek bir üreticinin özel ekipmanlarını kullanır; detaylar Malzeme Tablosunda bulunabilir. PCR için astar tasarımı istenirse manuel olarak gerçekleştirilebilir; ancak, bu amaçla mevcut yazılımların kullanılması önerilir ( Malzeme Tablosuna bakınız).
1. Pyrosequencing astar tasarımı ve tahlil seçimi
<ol><li>Primer adaylarının yazılım ile elde edilmesi<ol><li>Genotiplendirilen türler için bir mtDNA dizi dosyası edinin ve SNP'nin konumunu tanımlayın. SNP'nin konumunun kolayca tanımlanabilmesi için kullanılan referans dizisinin, incelenen mutasyon için uygun baz numaralandırmasını kullandığından emin olun.</li>
		<li>SNP sitesinin yukarı ve aşağı yönünde 1.000 baz çiftini kopyalayın ve kesilen diziyi pyrosequencing astar tasarımı için tasarlanan yazılıma yapıştırın ( bkz.</li>
		<li>Analiz edilen SNP tabanını, polimorfik tabanı vurgulayarak ve sağ tıklayıp ardından hedef bölgeyi ayarla'yı seçerek yazılımdaki pyrosequencing testinin hedefi olarak ayarlayın.</li>
		<li>Primer seçimini başlatmak için arayüzün sağ üst köşesindeki oynat simgesine basın.</li>
		<li>Yazılımın şimdi otomatik olarak primer üçlüsü oluşturmasını bekleyin: şablon DNA'nın ön amplifikasyonu için iki primer ve pyrosequencing makinesinde sentez yoluyla dizileme için üçüncü bir astar. Sağ tıklayıp Tüm astar setlerini kopyala'yı seçerek tüm astar setlerini koruyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Oluşturulan listeden en uygun astar setlerinin seçilmesi<ol><li>Astarlama kümelerini, kalite puanına göre azalan sırada sağlayan yazılım çıktısına dayalı olarak en yüksek kalite puanına sahip astar kümelerini koruyun. Mümkünse, puanı 80'in altında olan astar setlerini atlayın.</li>
		<li>Tutulan astar setleri için, amplifikasyon primerleri tarafından üretilen amplikonu tanımlayın ve kopyalayın.</li>
		<li>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi'daki çevrimiçi gönderim portalını kullanarak NCBI Blast kullanılarak genotiplendirilecek organizmanın tüm genomu ile üretilen amplikonları hizalayın. Gönderim sırasında açılır menülerden aşağıdakileri seçin:<ol><li>Veritabanı Seçin | Genomik + Transkript veritabanları.</li>
			<li>Analiz edilen SNP'ye bağlı olarak açılır menüden İnsan veya Fare'yi seçin.</li>
			<li>Şunun için optimize et'i seçin | Biraz benzer diziler (Blastn).</li>
		</ol></li>
		<li>(İsteğe bağlı) Fare veya insan dışında bir organizmayı genotiplendiriyorsanız, gönderim sırasında aşağıdakileri seçin:<ol><li>Veritabanı Seçin | Standart veritabanı.</li>
			<li>Açılır menüden RefSeq Temsilcisi genomları'nı seçin</li>
			<li>Şunun için optimize et'i seçin | Biraz benzer diziler (Blastn)</li>
		</ol></li>
		<li>Mümkün olduğunda, mtDNA amplikonuna mükemmel homolojiye sahip herhangi bir amplikonu atlayın, özellikle de primer bağlanma bölgeleri mükemmel homolog ise (tartışmaya bakınız). NOT: BLAST hizalama aracı, amplifikasyon öncesi amplikonlara kayda değer homolojiye sahip herhangi bir diziyi döndürecektir. Bu, girişte açıklanan NUMT'lerin tespit edilmesine izin verir; bu, hesaba katılmazsa, mitokondriyal DNA ile birlikte güçlendirildikleri için bir önyargıya neden olabilir.</li>
		<li>Bu boru hattı ile elde edilen oligoları sipariş edin. Sentez sırası sırasında doğru amplifikasyon primerine 5' biyotin modifikasyonunun eklendiğinden emin olun, böylece dizileme astarı biyotinile ipliği tamamlayıcı olacaktır. NOT: Sıralama astarı seçimi, amplifikasyon primerlerinden daha esnektir ve sıralama astarının 3' ucunu ve değişken konumu ayıran en az bir bazın olması önerilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preamplifikasyon PCR optimizasyonu
<ol><li>Uygun bir yöntem kullanarak toplam genomik DNA'yı çıkararak DNA örneklerini hazırlayın. NOT: Bu büyük ölçüde genotiplendirilen hücrelerin sayısına ve kökenlerine bağlı olacaktır. DNA, proteinaz K içeren bir lizis tamponu kullanılarak tek hücrelerden izole ediliyorsa, numune, sonraki PCR sırasında polimerazı bozmamak için 10 dakika boyunca 95 ° C'de denatüre edilmelidir.</li>
	<li>PCR kurulumu ve termal blok ayarları<ol><li>PCR'yi tercih edilen yüksek doğruluklu bir polimeraz ile ayarlayın. Dört reaksiyon için bir Master Mix hazırlayın. Bir pirozezans çalışması için sadece 10 μL PCR reaksiyonu gerektiğinden, 25 μL PCR reaksiyonu hazırlayın (gerekirse teknik bir tekrara izin vermek için). Hem ileri hem de geri primerlerin 1 μM'si ile başlangıç materyali olarak yaklaşık 10 ng genomik DNA içeren 40 döngü PCR kullanın.</li>
		<li>Uzatma süresini, seçilen ön amplifikasyon primerlerinin uzunluğunu dikkate alarak, kullanılan polimeraz için üreticinin spesifikasyonlarına göre ayarlayın.</li>
		<li>Değişken tavlama sıcaklığı ayarlarına sahip bir termal döngüleyici kullanın. Tavlama sıcaklığı astar dizisine, polimeraz tamponunun tuz içeriğine ve diğer faktörlere bağlı olarak farklılık gösterebildiğinden, termal döngü programına dört farklı tavlama sıcaklığı programlayın. NOT: Temsili sonuçlarda çalışılan örnekte aşağıdaki sıcaklıklar kullanılmıştır: 55 °C, 60 °C, 65 °C ve 70 °C.</li>
		<li>Master Mix'i dört adet 200 μL PCR tüpüne bölün ve bunları 40 döngü boyunca termal döngüleyicide seçilen dört tavlama sıcaklığının her birinde çalışacak şekilde ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Ön amplifikasyon bandı görselleştirme<ol><li>PCR çalışması sırasında, görselleştirme maddesi olarak SYBR Safe veya ethidyum bromür ile 1x TBE'de% 2'lik (w / v) bir agaroz jeli hazırlayın. NOT: Güçlendirilmiş parçalar genellikle kısa, tipik olarak 100 ila 500 baz çifti arasında değiştiğinden, görselleştirme için daha yüksek bir yüzde jeli önerilir.</li>
		<li>Adım 2.2'deki PCR tamamlandıktan sonra, reaksiyonun 10 μL'sini uygun miktarda DNA yükleme tamponu ile karıştırın ve yaklaşık 45 dakika boyunca 7 V / cm'de% 2 agaroz jeli üzerinde çalıştırın.</li>
		<li>Elde edilen DNA parçalarını bir UV transilluminatörü üzerinde görselleştirin. NOT: Ön amplifikasyon adımı için seçilen termal döngü koşulları, beklenen boyutta tek bir temiz bant üretmelidir. Daha düşük tavlama sıcaklıkları bazen hedef dışı amplifikasyona neden olabilir, bu da sonraki pyrosequencing'e önyargılar getirebilir.</li>
		<li>Sonraki amplifikasyonlar için doğru boyutta temiz bir bant üreten en düşük tavlama sıcaklığını seçin.</li>
		<li>(İsteğe bağlı) Beklenen boyuttaki bir bandı tüketin, tercih edilen bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın ve numunenin yaklaşık heteroplazmisini referans olarak doğrulamak için Sanger dizilimi ile analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cihaz kurulumu ve çalıştırması
NOT: Önceki bölümdeki PCR adımı optimize edildikten sonra, bir sonraki adım, spesifik SNP'yi analiz etmek için pirosequencer'ı doğru nükleotid dizisiyle programlamayı içerir. Bu, sıralama astarının 3' ucunun doğrudan aşağı yönünde 10 baz girmeyi içerir. Bu, aşağıdaki bölümde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
<ol><li>Tahlil yapılandırması<ol><li>Pirosequencer ile birlikte verilen çalıştırma yazılımını açın ve arayüzün sol üst köşesindeki Yeni Tahlil'i seçin.</li>
		<li>Alel niceleme testi şablonunu seçin.</li>
		<li>Analiz edilecek Sekansı, ilgili SNP'nin yukarı akışı olması gereken dizileme astarının doğrudan aşağı yönünde dahil edilecek nükleotidleri yazarak ilgili kutuya girin. Değişken konum için, eğik çizgiyle ayrılmış iki olası tabanı belirtin (örneğin, A/T).</li>
		<li>Dağıtım sırası oluştur düğmesine basın ve yazılımın sentez yoluyla sıralama reaksiyonunda dağıtılacak nükleotidler için uygun bir sırayı otomatik olarak belirlemesine izin verin.</li>
		<li>Kaydedin ve test için bir ad sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Reaktif hazırlama ve depolama<ol><li>Pirosequencer reaktif kitinde sağlanan Tavlama Tamponunda 4 μM'ye sipariş edilen sıralama astarını seyreltin. NOT: Sıralama astarı önce bir stok çözeltisi olarak suda 100 μM'ye kadar seyreltilebilir ve daha sonra gerektiğinde Tavlama Tamponunda 4 μM'ye kadar seyreltilebilir.</li>
		<li>Enzim ve substrat hazırlama ve kullanma<ol><li>İlk kutudan çıkarken, liyofilize enzimi ve substratı üreticinin tavsiyelerine göre yeniden çözün. Kullanılmadığında -20 °C'de saklayın.</li>
			<li>Daha sonraki kullanımda, enzim ve substrat şişelerini -20 ° C'den çözün. NOT: Sağlanan kitteki diğer tüm reaktifler 4 °C'de buzdolabında tutulabilir. Seyreltilmiş dizileme astarları da 4 °C'de tutulabilir.</li>
		</ol></li>
		<li>Her reaktifin gerekli miktarını buz üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Gerekli kalan bileşenleri, yani streptavidin kaplı manyetik boncukları, emici şeritleri ve pyrosequencing disklerini 4 ° C'de tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Yürütmeyi çalıştır NOT: Bir tahlil ilk tasarlandığında, bilinen heteroplazmiye sahip PCR ürünleri kullanılarak kalibre edilmelidir, bu da tahlilin heteroplazmileri doğru bir şekilde ayırt edebilmesini sağlar. Araştırmacılar, bilinen heteroplazmideki PCR ürünlerinin karışımlarını standart olarak kullanabilirler. Örnekler, giriş ve tartışmada belirtilen diğer yöntemlerle, özellikle de NGS ile doğrulanabilir.<ol><li>Analiz edilecek DNA'yı 5 ng / μL'ye seyreltin. Özellikle ilk çalışmada, bilinen heteroplazmi örneklerini referans olarak ve / veya vahşi tip örnekleri dahil ettiğinizden emin olun.</li>
		<li>Bölüm 1 ve bölüm 2'de tanımlanan amplifikasyon primerlerini ve parametrelerini kullanarak 25 μL reaksiyonlarda 5 μL seyreltilmiş DNA'nın ön sekanslama PCR'sini gerçekleştirin. Her numune için teknik PCR çoğaltmaları gerçekleştirin. NOT: Ön amplifikasyon PCR, dizilemeye geçmeden önce 4 ° C'de kısa süreli veya -20 ° C'de uzun süreli olarak saklanabilir.</li>
		<li>Dosya kurulumunu çalıştırma<ol><li>Pyrosequencer yazılımının sol üst köşesindeki Yeni Çalıştır'ı seçin.</li>
			<li>Pirosequencer, aynı anda 48 ayrı önceden güçlendirilmiş reaksiyonu sıralayabilir, boş bir kare bir pirozanslama diskinde tek bir sıralama kuyusunu temsil eder. Bölüm 3.1'de yapılandırılan tahlilleri bir kareye sağ tıklayıp yük tahlilini seçerek yükleyin. Gerekirse, farklı sıralama primerleri ile dört adede kadar ayrı tahlil sıralayın.</li>
			<li>Çalıştırma için kullanılan her sekanslama astarı için otomatik olarak bir enjeksiyon odası atamak üzere astar dağıtım modunu Otomatik olarak ayarlayın.</li>
			<li>Bir sıralama diskinde dört farklı türde tahlil çalıştırmadıkça Çalıştırma modunu Standart olarak ayarlayın.</li>
			<li>Çalıştırma şablonu dosyasındaki tahlil sayısının, yükseltilen PCR reaksiyonlarının sayısıyla eşleştiğinden emin olun. NOT: 48'den fazla örnek çalıştırıyorsanız, ek çalıştırma dosyalarının ayarlanması gerekir.</li>
			<li>Çalıştırma dosyalarını bir USB sürücüsüne kaydedin.</li>
		</ol></li>
		<li>Pirosequencer'ın astarlanması<ol><li>Cihazın ana dokunmatik ekranındaki Temizleme düğmesine basın ve ekrandaki talimatları izleyerek tüm enjektörleri yüksek saflıkta suyla temizleyin. Emici şeridi makineye takarken, uçların "saat 9 yönünde" (merkezin doğrudan solunda) buluştuğundan emin olun.</li>
			<li>Adım 3.3.3'te ayarlanan çalıştırmalarla USB belleği takın ve adım 3.3.3'te tanımlanan çalışma dosyalarını yükleyin. NOT: Çalıştırma dosyaları USB'deki herhangi bir dizin veya klasörün dışına kaydedilmelidir, aksi takdirde makine tarafından okunamazlar.</li>
			<li>Reaktifleri makinedeki ilgili enjektörlere gerektiği gibi yüklemek ve astarlamak için cihazdaki talimatları izleyin.</li>
		</ol></li>
		<li>Örnek disk hazırlama ve tahlil başlatma<ol><li>Streptavidin kaplı manyetik boncukların oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin. NOT: Bu boncuklar, cihazın ön amplifikasyon PCR adımından biyotinile ipliği yakalamasını sağlayacaktır. Kitten ayrı olarak satın alınmaları gerekir.</li>
			<li>Adım 3.3.3'ten itibaren çalıştırma dosyasında tanımlanan kuyucuklara 3 μL boncuk yükleyin.</li>
			<li>İlgili numuneye dizilenecek her PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve numuneyi manyetik boncuklarla karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın. Mümkünse kabarcıklardan kaçının.</li>
			<li>Astarlanmış pirosequencer'da diskin makineye yüklenebileceğinin göstergesini arayın. Yüklü numune plakasını disk bölmesindeki metal pimle hizalamadan önce plaka tutma somununu sökün.</li>
			<li>Plaka plaka bölmesine sıkıca vidalandıktan sonra, dokunmatik ekran arayüzündeki başlat düğmesine basarak sıralama işlemini başlatın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Sonuç elde etme
<ol><li>Çalıştırma tamamlandıktan sonra, USB sürücüsünü makineden çıkarın ve pirosequencer yazılımını çalıştıran bilgisayara tekrar takın. Aşağıdaki adımlarla devam ederken, günün son çalışması ise istemleri izleyerek pirosequencer'ı temizlemeye devam edin.</li>
	<li>Yeni oluşturulan çalıştırma dosyasının USB sürücüsünde görünmesini bekleyin ve çalıştırma sonucu dosyasına çift tıklayın. Bu, nükleotid katılımı üzerine her bir kuyucuğun lusiferaz çıkışını otomatik olarak analiz eder ve bölüm 3.1'deki tahlil konfigürasyonu sırasında tanımlanan mitokondriyal alelini nicelleştirir.</li>
	<li>Okumaların kalitesine bağlı olarak yazılım tarafından gösterilen aşağıdaki renk puanlarını arayın. Mavi en uygun çalıştırmayı, sarı uyarı içeren bir çalıştırmayı ve kırmızı başarısız bir çalıştırmayı gösterir. Sonuçları kaydetmek için üst pencerede Raporlar'ı seçin | Pirogramları ve çalıştırmanın her bir kuyucuğundan elde edilen sonuçları içeren bir .pdf dosyası oluşturmak için tam rapor. Alternatif olarak, sonuçları Raporlar sekmesi altındaki diğer biçimlerde de indirebilirsiniz.</li>
</ol>

<ol><li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome%3A+Structure%2C+transcription%2C+translation+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li>
<li>Vafai, S. B., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+disorders+as+windows+into+an+ancient+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle.</a> Nature. 491, 374-383 (2012).</li>
<li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-embedded+mitochondrial+DNA+sequences+in+66%2C083+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes.</a> Nature. 611, 105-114 (2022).</li>
<li>Chinnery, P. F., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genetics.</a> British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).</li>
<li>Ryzhkova, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases+caused+by+mtDNA+mutations%3A+A+mini-review%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutics+and+Clinical+Risk+Management%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).</li>
<li>Payne, B. A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+heteroplasmy+of+human+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA.</a> Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).</li>
<li>Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mitochondrial disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).</li>
<li>Mok, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cytidine+deaminase+toxin+enables+CRISPR-free+mitochondrial+base+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing.</a> Nature. 583, 631-637 (2020).</li>
<li>Cho, S. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+A-to-G+base+editing+in+human+mitochondrial+DNA+with+programmable+deaminases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases.</a> Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).</li>
<li>Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrially+targeted+ZFNs+for+selective+degradation+of+pathogenic+mitochondrial+genomes+bearing+large-scale+deletions+or+point+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).</li>
<li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-complete+elimination+of+mutant+mtDNA+by+iterative+or+dynamic+dose-controlled+treatment+with+mtZFNs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs.</a> Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).</li>
<li>Gammage, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+mitochondria+corrects+a+pathogenic+mtDNA+mutation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo.</a> Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).</li>
<li>Bacman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoTALEN+reduces+mutant+mtDNA+load+and+restores+tRNAAla+levels+in+a+mouse+model+of+heteroplasmic+mtDNA+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation.</a> Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).</li>
<li>Ren, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mtDNA+SNPs+in+Chinese+Han+population+using+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%3A+Genetics+Supplement+Series%22%5BJournal%5D)">Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).</li>
<li>Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sequence+analysis+for+forensic+identification+using+pyrosequencing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology.</a> BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+is+an+accurate+and+reliable+method+for+the+analysis+of+heteroplasmy+of+the+A3243G+mutation+in+patients+with+mitochondrial+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).</li>
<li>Song, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+LATE-PCR+to+allow+single-cell+analysis+by+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing.</a> Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).</li>
<li>El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MELAS+syndrome%3A+Clinical+manifestations%2C+pathogenesis%2C+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options.</a> Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).</li>
<li>Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+single-chain%2C+quasi-dimeric+zinc-finger+nuclease+for+the+selective+degradation+of+mutated+human+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).</li>
<li>Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+testing+of+engineered+zinc-finger+proteins+for+sequence-specific+modification+of+mtDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA.</a> Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).</li>
<li>Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+mitochondrial+genes+and+mtDNA+heteroplasmy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy.</a> Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).</li>
<li>Gammage, P. A., Minczuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+manipulation+of+human+mitochondrial+DNA+heteroplasmy+in+vitro+using+tunable+mtZFN+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology.</a> Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).</li>
<li>Pickett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+in+m.3243A%3EG+mitochondrial+disease%3A+The+role+of+nuclear+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).</li>
<li>Nunes, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OXPHOS+dysfunction+regulates+integrin-%CE%B21+modifications+and+enhances+cell+motility+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration.</a> Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).</li>
<li>Kauppila, J. H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phenotype-driven+approach+to+generate+mouse+models+with+pathogenic+mtDNA+mutations+causing+mitochondrial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease.</a> Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).</li>
<li>Burr, S. P., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+mitochondrial+DNA+copy+number+and+heteroplasmy+using+digital+droplet+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. (185), e63870(2022).</li>
</ol>

M.M., Pretzel Therapeutics, Inc. PS-P.'nin kurucu ortağı, hissedarı ve Bilimsel Danışma Kurulu üyesidir. ve P.A.N. Pretzel Therapeutics, Inc. için danışmanlık hizmetleri vermektedir.

Protokolün başarısı için kritik bir husus, özellikle düşük miktarda başlangıç malzemesi kullanıldığında kontaminasyondan kaçınmaktır. Numuneleri hazırlarken mümkün olduğunca UV davlumbaz ve filtrelenmiş pipet uçlarının kullanılması, ayrıca ön amplifikasyon ve amplifikasyon sonrası alanların ayrı tutulması önerilir. Boş ölçümler ve bilinen heteroplazmi örnekleri (vahşi tip DNA gibi), teknik veya biyolojik önyargıyı kontrol etmek için kıyaslama ölçütü olarak kullanılmak üzere her zaman dahil edilmelidir. 
<p class="jov...

Mitokondriyal genom, matris olarak adlandırılan mitokondrinin en iç bölmesinde bulunan küçük (16.5 kb) dairesel moleküller (mtDNA) formunda bulunur ve mitokondriyal solunum zincirinin 13 alt birimini ve ayrıca mitokondriyal ribozom1 tarafından yerinde translasyonu için gerekli olan tRNA'ları ve rRNA'ları kodlar. Bu genom, mitokondriyal fonksiyon için gerekli olan tüm proteinlerin yaklaşık% 1'ini temsil eder, geri kalanı nükleer DNA (nDNA) tarafından kodlanır. Mitokondrilerin, alfa-proteobakteriyel bir ata ile atasal bir ökaryotik hücre arasındaki endosimbiyotik füzyon olayından türetildiği varsayılmaktadır. Bu varsayımsal simbiyoz gerçekleştikten sonra, mitokondrinin genetik bilgisi, modernsiyanobakterilerin genomlarıyla karşılaştırıldığında mtDNA'nın yukarıda belirtilen kompaktlığını açıklayan çağlar boyunca çekirdeğe kademeli olarak aktarıldı. Genlerin böyle bir transferi, mtDNA'da bulunan dizilere oldukça homolog olan uzun nDNA uzantılarının varlığı ile en güçlü şekilde kanıtlanmıştır. Bu nükleer mitokondriyal diziler (NUMT'ler), genotipleme sırasında yaygın bir yanlış yorumlama kaynağıdır ve mtDNA3'ü genotiplendirirken nükleer önyargıları önlemek için bazı önlemler alınmalıdır (Şekil 1A).
mtDNA'nın bir diğer ayırt edici özelliği, kopya sayısının hücre tipine bağlı olarak değişmesi vehücre başına on binlerce kopya 4 arasında herhangi bir yerde numaralandırılmasıdır. Bu çok kopyalı doğası nedeniyle, mtDNA, tek bir hücre içinde çok çeşitli genotipleri barındırabilir, bu da kromozomların zigotluğu göz önüne alındığında, nükleer genlerle ilişkili ayrık alellerin aksine, alellerin daha sürekli bir dağılımına neden olabilir. Mitokondriyal alellerin bu heterojenliği, tipik olarak belirli bir mutasyonun yüzde prevalansında belirli bir hücredeki toplam mtDNA'nın bir oranı olarak ifade edilen mitokondriyal heteroplazmi olarak adlandırılır. Heteroplazmi, bir hücrede bulunan benzersiz bir mtDNA türünü ifade eden homoplazmi ile karşılaştırılabilir.
Mitokondriyal heteroplazminin ölçülmesi, patojenik varyantları barındıran mtDNA moleküllerinin oranını ölçerken özellikle ilgi çekicidir. Bu tür varyantlar, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), küçük indeller veya büyük ölçekli delesyonlar şeklinde gelir5. Çoğu insan patojenik varyantlar için heteroplazmiktir; Bununla birlikte, genellikle eşik etkisi6 olarak adlandırılan bir fenomende patojenik mtDNA'nın daha yüksek heteroplazmi seviyelerinde ortaya çıkan herhangi bir klinik fenotip sergilemezler. Patojenite ile ilişkili değerler, patojenik mutasyonun doğasına ve meydana geldiği dokuya büyük ölçüde bağlı olsa da, tipik olarak% 60 heteroplazmi7'nin üzerindedir.
Mitokondriyal genotiplemenin yaygın olduğu birkaç araştırma alanı vardır. Tıp alanında, mtDNA mutasyonlarının test edilmesi veya ölçülmesi, birçoğu kökenleri olarak mtDNA anormalliklerine sahip olan mitokondriyal hastalıklar için bir tanı kriteri olarak hizmet edebilir5. İnsan patojenik mutasyonlarının incelenmesine ek olarak, mtDNA'da patojenik SNP'leri barındıran hayvan modellerinin prevalansının artması muhtemeldir, mitokondriyal olarak hedeflenmiş DddA kaynaklı sitozin baz editörleri (DdCBE'ler)8 ve adenin baz düzenlemesi için TALE bazlı deaminazlar (TALED'ler) tarafından sağlanan mitokondriyal baz düzenlemesinin son zamanlarda ortaya çıkması göz önüne alındığında9. Bu yaklaşım, anormal mitokondriyal genotipler ile ortaya çıkan işlev bozuklukları arasındaki etkileşimi anlamada etkili olacaktır. Ayrıca, insan mitokondriyal hastalıklarında terapötik bir strateji olarak nihai kullanım için mitokondriyal genomun, heteroplazmi kayması olarak bilinen bir yaklaşımla yeniden şekillendirilmesi için devam eden bilimsel araştırmalar da vardır. Bu araştırma alanı öncelikle mutasyona özgü nükleazların mitokondriyal matrise yönlendirilmesini içerir; bu, patojenik mtDNA'nın tercihli bozulmasına neden olur ve fenotip10,11,12,13'te kurtarmalara yol açar. Mitokondriyal genotipin yeniden şekillendirilmesini içeren herhangi bir deney, heteroplazmi kaymalarını değerlendirmek için sağlam bir nicel yöntem gerektirir.
MtDNA'yı genotiplemek için çok çeşitli yöntemler kullanılır ve bunlar mutasyonun doğasına göre değişir. Yeni nesil dizileme (NGS) yöntemleri, mtDNA'daki SNP'lerin nicelleştirilmesi söz konusu olduğunda daha hassastır; Bununla birlikte, bu yöntemler, özellikle numune sayısı küçükse, mitokondriyal heteroplazminin rutin nicelleştirilmesi için engelleyici derecede pahalı olmaya devam etmektedir. Sanger dizilimi, SNP'lerin algılanmasına da izin verebilir; Bununla birlikte, bu yaklaşım nicel değildir ve genellikle düşük heteroplazmi seviyelerini tespit etmekte başarısız olur veya yüksek heteroplazmileri tahmin ederken yanlış olabilir. Pyrosequencing, minimal hazırlık içeren ve herhangi bir mtDNA örneği için heteroplazminin hızlı bir şekilde nicelleştirilmesini sağlayan bir tahlil olarak, bu iki uç nokta arasında uygun bir uzlaşma olarak önerilmektedir. Bu yöntem, adli analiz 14,15, klinik tanı 16 veya mtDNA'nın tek hücrelerden genotiplenmesi 17 dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda çok sayıda araştırmacı tarafından mitokondriyal SNP'leri ölçmek için rutin olarak kullanılmıştır.
Bu tahlil, mtDNA'da SNP'yi çevreleyen bir bölgenin ilk PCR preamplifikasyon adımını içerir ve bunu daha önce üretilen amplikonun bir ipliğini kullanarak sentez yoluyla bir sıralama testi izler. Ön amplifikasyon adımında kullanılan iki primerden biri, 5' ucunda biyotinillenmelidir, bu da pirozanslama aparatının, dizileme reaksiyonu için şablon olarak kullanılacak tek DNA ipliğini izole etmesini sağlayacaktır. Üçüncü bir dizileme primeri daha sonra tutulan biyotinile iplikçik üzerine tavlanır, bu da deoksinükleotidler olarak ortaya çıkan DNA sentezinin reaksiyon odasına önceden tanımlanmış bir sırayla dağıtılmasına izin verir. Pirosequencer, ışıldayan bir okumaya dayanarak dahil edilen her bir bazın miktarını kaydeder ve DNA sentezi üzerine mutant ve vahşi tip mitokondriyal alellerin nispi nicelleştirilmesine izin verir (Şekil 1B). Lüminesans, ATP varlığında ışık yayan bir lusiferaz enzimi tarafından üretilir, bu da bir ATP sülfürilazın her bir nükleotid tarafından salınan pirofosfatlardan her birleşme olayında de novo sentezlediği ışığı yayar. Bu iki reaksiyon şu şekilde özetlenebilir:
1. PPi (nükleotid birleşmesinden) + APS → ATP + sülfat (ATP sülfürilaz)
2. ATP + lusiferin +O2 → AMP + PPi + oksilüsiferin + CO2 + ışık (lusiferaz)
İkinci reaksiyonda lusiferaz ile çapraz reaksiyona giren ATP olmadan pirosequencer tarafından adenin bazlarının tespit edilmesi bir zorluktur. Bununla birlikte, bu, DNA sentezi için bir adenin analoğu, yani dATPαS kullanılarak çözülür. Lusiferaz için mükemmel bir substrat olmamasına rağmen, pirosequencer tarafından dijital olarak ayarlanan ve 0.9 faktörüne ayarlanan diğer üç nükleotid ile karşılaştırıldığında daha güçlü bir lüminesans üretir. Bu doğal değişkenlik nedeniyle, SNP pozisyonunda adenin diziliminden kaçınılması önerilmektedir (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakınız).
Aşağıdaki protokol, pirozanslama ile mtDNA heteroplazmi değerlendirme yöntemini detaylandırmakta ve mtDNA'daki SNP'leri genotiplendirirken biyolojik veya teknik önyargıyı önlemek için amplifikasyon primerlerinin tasarımında gerekli önlemleri özetlemektedir. İkincisi, astar setlerinin dijital olarak incelenmesini ve seçilmesini, ön amplifikasyon PCR'sinin optimize edilmesini ve son olarak tahlilin sıralanmasını ve rafine edilmesini içerir. İki uygulamalı örnek tahlil gösterilmiştir: birincisi, en yaygın insan patojenik varyantı m.3243A>G18'in optimizasyonu ve ikincisi, Cambridge 10,11,12,19,20,21,22'deki Minczuk laboratuvarında geliştirilen teknolojiler kullanılarak heteroplazmi kayması geçiren fare embriyonik fibroblast (MEF) hücrelerinin genotiplenmesi.

<table><tbody><tr><td>KOD Hot Start DNA</td><td>Polimeraz Sigma-Aldrich</td><td>71086</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Test Tasarımı&nbsp; 2.0</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyromark Q48 Emici Şeritler&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>974912</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q48 Gelişmiş CpG Reaktifleri (4 x 48)</td><td>QIAGEN</td><td>974022</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark Q48 Otomatik Hazırlık&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>9002470</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q48 Kartuş Seti</td><td>QIAGEN</td><td>9024321</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark Q48 Diskler</td><td>QIAGEN</td><td>974901</td><td></td></tr><tr><td>Pyromark Q48 Manyetik boncuklar&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>974203</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q48 Yazılım Lisansı (1)</td><td>QIAGEN</td><td>9024325</td><td></td></tr></tbody></table>

mitokondriyal genomdaki tek nükleotid polimorfizmlerinin pirosequencing ile genotiplenmesi

Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing

Mitokondriyal genomdaki (mtDNA) mutasyonlar maternal kalıtsal genetik hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, mtDNA polimorfizmlerine olan ilgi, mtDNA mutagenezi ile model üretme yeteneğinin yakın zamanda geliştirilmesi ve mitokondriyal genetik anormallikler ile kanser, diyabet ve demans gibi yaşa bağlı yaygın hastalıklar arasındaki ilişkinin yeni bir şekilde değerlendirilmesi nedeniyle son yıllarda artmıştır. Pyrosequencing, rutin genotipleme deneyleri için mitokondriyal alanda yaygın olarak kullanılan bir sentez yoluyla sıralama tekniğidir. Masif paralel dizileme yöntemleriyle karşılaştırıldığında göreceli olarak satın alınabilirliği ve uygulama kolaylığı, onu mitokondriyal genetik alanında paha biçilmez bir teknik haline getirmekte ve heteroplazminin artan esneklikle hızlı bir şekilde nicelleştirilmesine izin vermektedir. Bu yöntemin pratikliğine rağmen, mtDNA genotiplemesinin bir aracı olarak uygulanması, özellikle biyolojik veya teknik kökenli belirli önyargılardan kaçınmak için belirli kılavuzların gözlemlenmesini gerektirir. Bu protokol, heteroplazmi ölçümü bağlamında kullanılmak üzere pyrosequencing testlerinin tasarlanması ve uygulanmasında gerekli adımları ve önlemleri özetlemektedir.

Bu bölümde, insan patojenik mtDNA mutasyonu için bir pirozanslama testinin örnek optimizasyonunun yanı sıra, mitokondriyal çinko parmak nükleazları (mtZFN'ler) ile tedavi edilen heteroplazmik (m.5024C&gt;T) fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) genotiplendirilmesinden elde edilen dizileme verileri sunulmaktadır. Tahlilin insan hücreleri için optimize edilmesi ve iki farklı tahlilin karşılaştırılması, en doğru olanın nasıl seçileceğini gösterirken, ikinci örnekte genetiği değiştirilmiş MEF hücrelerinin genotiplendir...

Pirosekans testleri, heteroplazmik hücrelerde veya dokularda mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin sağlam ve hızlı genotiplendirilmesini sağlar.

Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi

Mutations in the mitochondrial genome (mtDNA) have been associated with maternally inherited genetic diseases. However, interest in mtDNA polymorphisms ...

Pyrosequencing, mitokondriyal DNA'daki tek nükleotid polimorfizmlerini genotiplemek için kullanılabilen sentez tekniği ile bir dizilemedir. Bu yöntem, diğer sıralama yöntemlerine kıyasla uygulama kolaylığı ve maliyet etkinliği açısından avantajlıdır. Mitokondriyal DNA'daki patojenik varyantların heteroplazmi değerlerini belirleyerek bazı mitokondriyal hastalıklar için tanı yöntemi olarak kolayca kullanılabilir.Başlamak için, genotiplendirilen türler için bir mitokondriyal DNA dizi dosyası elde edin ve tek nükleotid polimorfizminin veya SNP'nin konumunu tanımlayın. SNP'nin konumunun kolayca tanımlanabilmesi için kullanılan referans dizisinin, incelenen mutasyon için uygun baz numaralandırmasını kullandığından emin olun. SNP sahasının yukarı ve aşağı akış yönünde 1.000 baz çiftini kopyalayın ve kesilen diziyi pyrosequencing astar tasarım yazılımına yapıştırın.Polimorfik tabanı vurgulayın, üzerine sağ tıklayın ve ardından analiz edilen SNP tabanını pyrosequencing testinin hedefi olarak ayarlamak için Hedef Bölgeyi Ayarla'yı seçin. Astar seçimini başlatmak için arayüzün sağ üst köşesindeki Oynat simgesine basın ve yazılımın otomatik olarak astar üçlüsünü, şablon DNA'nın ön amplifikasyonu için iki primer ve pirozanslama makinesindeki sentez ile sıralama için üçüncü astarı oluşturmasını bekleyin. Sağ tıklayın ve tüm astar setlerini korumak için Tüm Astar Setlerini Kopyala'yı seçin.Pirosequencer ile birlikte verilen çalıştırma yazılımını açın, Yeni Tahlil'i seçin, ardından alel niceleme testi şablonunu seçin. Analiz edilecek dizayı, dizileme astarının doğrudan aşağı yönündeki nükleotidleri yazarak ilgili kutuya girin. Değişken konum için, eğik çizgiyle ayrılmış iki olası tabanı belirtin.Dağıtım Sırası Oluştur'a basın ve yazılımın sentez reaksiyonu ile dizilemede dağıtılacak nükleotidler için uygun bir sırayı otomatik olarak belirlemesine izin verin. Kaydedin ve test için bir ad verin. Daha sonra, analiz edilecek DNA'yı mikrolitre başına 5 nanograma seyrelterek çalıştırmayı gerçekleştirin.İlk çalıştırmada, bilinen heteroplazmi örneklerini referans olarak ve vahşi tip örnekleri dahil ettiğinizden emin olun. Daha sonra, amplifikasyon primerlerini ve parametrelerini kullanarak 5 mikrolitre seyreltilmiş DNA ve 25 mikrolitre reaksiyondan oluşan bir ön dizileme PCR'si gerçekleştirin. Dosya kurulumunu çalıştırmak için, pirosequencer yazılımında Yeni Çalıştır'ı seçin.Pirosequencer, bir pyrosequencing diski üzerinde tek bir dizileme kuyusunu temsil eden boş bir kare ile 48 ayrı önceden güçlendirilmiş reaksiyonu aynı anda sıralayabilir. Bir kareye sağ tıklayıp Testi Yükle'yi seçerek tahlilleri yükleyin. Gerekirse, farklı sıralama primerleri ile dört adede kadar ayrı tahlil sıralayın.Çalıştırma için kullanılan her sekanslama astarı için otomatik olarak bir enjeksiyon odası atamak üzere astar dağıtım modunu otomatik olarak ayarlayın. Bir sıralama diskinde dört farklı türde tahlil çalıştırmadığınız sürece çalışma modunu standart olarak ayarlayın. Çalıştırma şablonu dosyasındaki tahlil sayısının, yükseltilen PCR reaksiyonlarının sayısıyla eşleştiğinden emin olun.Ardından çalıştırma dosyalarını bir USB sürücüsüne kaydedin. Pirosequencer'ı hazırlamak için, cihazın ana dokunmatik ekranındaki temizleme düğmesine basın ve ekrandaki talimatları izleyerek tüm enjektörleri yüksek saflıkta suyla temizleyin. Emici şeridi makineye takarken, uçların saat 9 pozisyonunda buluştuğundan emin olun.USB belleği taktıktan sonra, daha önce hazırlanan çalıştırma dosyalarını yüklemek için Sırala düğmesine basın. Reaktifleri, gerektiği gibi, makinedeki ilgili enjektörlere yüklemek ve astarlamak için cihazdaki talimatları izleyin. Kuyucuklara 3 mikrolitre boncuk yükleyin ve ardından ilgili numuneye dizilenmek üzere her PCR reaksiyonunun 10 mikrolitresini yükleyin.Numuneyi manyetik boncuklarla karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın. Astarlanmış pirosequencer'da diskin makineye yüklenebileceğine dair göstergeyi arayın. Plaka tutma somununu sökün ve yüklü numune plakasını disk bölmesindeki metal pimle hizalayın.Plaka plaka bölmesine sıkıca vidalandıktan sonra, dokunmatik ekran arayüzündeki başlat düğmesine basarak sıralama işlemini başlatın. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, USB sürücüsünü makineden çıkarın ve pirosequencer yazılımını çalıştıran bilgisayara tekrar takın. Yeni oluşturulan çalıştırma dosyası USB sürücüsünde göründükten sonra, Sonucu Çalıştır dosyasına çift tıklayın.Bu, nükleotid birleşmesi üzerine her bir kuyucuğun lusiferaz çıkışını otomatik olarak analiz eder ve ilgilenilen mitokondriyal aleli nicelleştirir. Okumaların kalitesine bağlı olarak yazılım tarafından gösterilen renk puanlarını arayın. Sonuçları kaydetmek için üst pencerede Raporlar'ı ve ardından Tam Rapor'u seçerek pirogramları ve çalıştırmanın her bir kutusundan elde edilen sonuçları içeren bir PDF dosyası oluşturun.Alternatif olarak, sonuçları Raporlar sekmesi altındaki diğer biçimlerde de indirebilirsiniz. Bu şekilde gösterildiği gibi m. 3243A>G mutasyonu için seçilen her iki setten amplifikasyon primerleri kullanılarak bir PCR amplifikasyonunun agaroz jel elektroforezi.Burada Het, analiz edilecek neredeyse homoplazmik m. 3243A>G örneğini belirtir. Kalibrasyon için molar standartlar kullanılarak her iki astar setinin performansının bir karşılaştırması bu şekilde gösterilmiştir.Ölçülen değerler dikey noktalı çizgilerle gösterilir. Test edilen iki tahlilin her birinin ideal bir ölçüme ne kadar yakın olduğunu göstermek için bir X = Y doğrusal fonksiyonu görüntülenir. X eksenindeki hücre çizgilerinin adları, bu tahlil kullanılarak genotiplendirilen çeşitli cybrid klonlarının adlarıdır.Her iki tahlil kullanılarak bilinmeyen m. 3243A>G heteroplazmisinin dört cybrid klonu üzerinde genotipleme sonuçları burada gösterilmiştir. Sıralama teknik üçlü olarak yapıldı.Mitokondriyal çinko parmak nükleazı ile tedavi edilen hücrelerin genotipleme sonuçları, tedavi edilmemiş ve alay ile tedavi edilmiş kontroller ve sonuçları üretmek için kullanılan iki MEF hücre örneği PCR replikasından elde edilen pirogramlar ve vahşi tip genotipleme kontrolü burada gösterilmiştir. Pyrosequencing, mitokondriyal DNA'daki çeşitli gen terapisi teknolojilerini değerlendirmek için gen terapisi deneyleri için bir okuma olarak kullanılabilir.

genotyping-single-nucleotide-polymorphisms-mitochondrial-genome

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Pyrosequencing (R) polimorfizmleri analiz için kullanılan, bugüne kadarki en kapsamlı ama basit yöntemlerle biridir. Bu yöntem, birçok klinik olarak ilgili polimorfizmleri dahil olmak üzere, hızlı ve verimli bir tek nükleotid polimorfizmi değerlendirme yol açmıştır. Pyrosequencing tekniği ve metodoloji açıklanmıştır.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Erken yaşam stresinin üzerine DNA metilasyon ve gen ekspresyon değişiklikleri incelemek için bir iş akışı gösterilir. Yeni doğmuş farelerin ve ayrık beyin dokularında izolasyonu anneden ayrılma başlayarak, eş zamanlı olarak izleyen bisülfit sıralama ve RT-PCR analizi için beyin dokusu yumruklar DNA ve RNA izole etmek için bir protokol temsil eder.

Beyin Küçük, Anatomik tanımlı alanları DNA metilasyon ve Gen İfade Optimize Analizi

Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Bu videoda, mikrobiyal amplikon üretimi, amplikon pyrosequencing ve DNA dizi analizi için prosedür gösterilecektir.

Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing

Yüksek çözünürlüklü erime analizi heterojen nüfus içinde tek nükleotid polimorfizmlerinin ayırt yeteneği sunarken, mutant alel amplifikasyon önyargı, bir numune içinde nispeten düşük oranlarda bulunan allel tespit kabiliyetini artırabilir. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü erime analizinin duyarlılığını artırmak geliştirmeleri açıklanır.

Yöntemler sıtma Tek Nükleotid Polimorfizm Genotipleme Erime Yüksek Çözünürlük Duyarlılığının Artırma

Burada tarif biz aynı anda quantitate için müsait bir yöntem ve genomik DNA'ın enzimatik bölünme onun alkalin hidroliz ve sonraki 5´ uç ile birleştirerek tek nükleotid çözünürlükte son derece sağlam DNA genom geniş harita ribonucleotides sıralama.

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Burada, mitokondriyal DNA (mtDNA) metilasyon doğru miktar bir iletişim kuralını mevcut. Bu protokol için bir enzimatik sindirim DNA BamHI tahmindi mtDNA metilasyon düzeyi mtDNA ikincil yapı tarafından neden önlemek için kullanılan bioinformatic analiz boru hattı ile birleştiğinde ile açıklanmaktadır.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Transmitokondrial sibridler, mitokondriyal DNA (mtDNA) tükenmiş hücrelerin (rho0 hücreleri) mitokondriyal bozukluklardan etkilenen hastalardan türetilen sitoplastlarla (enüklee hücreler) kaynaştırılmasıyla elde edilen melez hücrelerdir. Hastalığın nükleer veya mitokondriyal kökeninin belirlenmesine, biyokimyasal aktivitenin değerlendirilmesine ve mtDNA ile ilişkili varyantların patogenetik rolünün doğrulanmasına izin verir.

Mitokondriyal Disfonksiyonu Incelemek İçin In Vitro Bir Yaklaşım: Bir Cybrid Modeli

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Bu protokol, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden cybrid üretimi için bir tekniği, mitokondrinin tümörojenik süreçteki rolünü incelemek için bir araç olarak tanımlamaktadır.

Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi

mtDNA sentezini ve dağılımını tespit etmek ve ölçmek için çok kuyucuklu bir plaka formatı ve otomatik immünofloresan görüntüleme kullanarak hücrelerdeki mitokondriyal DNA (mtDNA) metabolizmasının dinamiklerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu, çeşitli inhibitörlerin, hücresel streslerin ve gen susturmanın mtDNA metabolizması üzerindeki etkilerini araştırmak için de kullanılabilir.

Mitokondriyal DNA Sentezi ve Dağılımının Yüksek Verimli Görüntü Tabanlı Nicelleştirilmesi

Öğrenin, pirosekanslama ile mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin genotiplenmesini. Bu yöntem, patojenik varyantların heteroplazmi düzeylerini belirleyerek mitokondriyal hastalıkların tanısını kolaylaştırır ve maliyet etkin bir yaklaşım sunar.

Mitokondriyal Genomdaki Tek Nükleotid Polimorfizmlerinin Pirosequencing ile Genotiplenmesi

Daha fazla video keşfet