İnsan Eklem Kıkırdak Eksplantlarında Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı Mikro Girintide Pratik Konuların Ele Alınması

Bu protokolün amacı, osteoartritin başlangıcı ve ilerlemesi sırasında eklem kıkırdağının mekanik özelliklerini incelemek için bir in vitro model oluşturmaktı. Mevcut tekniğin temel avantajı, kıkırdak eksplantlarının üretilmesinin kolay olması ve doğal yaş kıkırdağını yüksek oranda temsil etmesidir. Bu model, biyomekanik düzeyde çeşitli osteoartrit, tanısal ve terapötik yaklaşımları analiz etmek ve izlemek için kullanılabilir.

Başlamak için, bir neşter kullanarak kıkırdağı kemikten kesin. Bir biyopsi zımbası kullanarak, dört milimetre çapında diskler oluşturun. Diski özel yapım bir kesme cihazına yerleştirin.

Bir spatula kullanarak kıkırdak diskini sabitleyin ve stabilize edin. Kıkırdak diski jiletle kesin. Bir spatula kullanarak diski toplayın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Kıkırdak örneklerinde kalmak için, 96 kuyucuklu plakanın her bir oyuğuna 130 mikrolitre hücre geçirgen floresan boya ekleyin ve diski plaka üzerine oyuk başına bir disk olarak dağıtın. 96 kuyulu plakayı floresan mikroskobunun plaka tutucusuna yerleştirin. Uygun floresan filtresini ve hedefi seçin.

Hedefi, tek tek kıkırdak içeren önceden seçilmiş kuyunun altına yerleştirin. Hücresel deseni görmek için diske odaklanın. Tüm kuyuya genel bir bakış elde etmek için gezgin işlevini seçin.

Farenin sol düğmesini kullanın ve farklı bir sahne konumuna gitmek için sürükleyin. Taranacak ilgi alanını kapsayan bir kare seçin. Yazılımın odak haritası noktası seçeneğini seçin ve ardından ortasına sol tıklayarak her bir döşemeyi seçin.

Önceden seçilen tüm döşemelerle birlikte görünen pencerede odak haritası seçeneğini seçin. Görüntülemek ve uygun odağa getirmek için bir kutucuğa çift tıklayın. Ardından, odak planını kaydetmek ve bir sonraki kutucuğa geçmek için Z kümesine tıklayın.

Her bir döşeme için odak planını ayarladıktan sonra, taramayı başlat'a basarak görüntü alımına başlayın. Diskin üst, alt, sol ve sağ taraflarına yeterli biyouyumlu yapıştırıcı ekleyerek Petri kaplarında hücresel bir desen içeren önceden seçilmiş her kıkırdak diskini sabitleyin. Diskleri L-glutamin içermeyen 2,5 mililitre Leibovitz ortamı ile örtün.

Petri kabını AFM cihazları numune tutucusuna yerleştirin. AFM konsolunu kalibre etmek için, cam bloğun ortasındaki cilalı optik düzleme dayanacak şekilde cam blok konsolun yüzeyine yerleştirin. Konsolu, ortama tamamen daldırılana kadar step motor işlevini kullanarak 100 mikrometrelik adımlarla indirin.

İstenen kıkırdak ölçüm bölgesini belirlemek için, Petri kabının temiz bir numune içermeyen alanında konsol ile bir tarayıcı yaklaşımı başlatın. Ardından konsolu plakanın altından 1,5 milimetre uzağa çekin. Parlak alandan floresan görünümüne geçin ve diskin üst kısmını görsel olarak belirleyin.

AFM numune tutucuyu diskin ortasına doğru tam olarak iki milimetre hareket ettirin. Kıkırdak diskin yüzeyine ulaşmak için bir tarayıcı yaklaşımı çalıştırın ve konsolu 100 mikrometre geri çekin. Bir kuvvet mesafesi eğrisi oluşturmak için, istenen ölçüm bölgesinde konumlandırılmış hücrelere odaklanın.

Ölçümleri başlatmak ve her ölçüm bölgesinde beş kuvvet mesafesi eğrisi elde etmek için çalıştır düğmesine tıklayın. Eğrileri incelendikten sonra kaydedin. Young'ın modülünü tahmin etmek için, bir grup spektroskopi eğrisi aç seçeneğini kullanarak, analiz edilecek oluşturulan kuvvet mesafesi eğrilerini açın.

Hertz-fit modelini ve ardından elastikiyet-fit seçeneğini seçin. Ardından Young'ın modülünü görselleştirin ve belgeleyin. 0.5'lik poisson oranını ve uygun konsol ucu yarıçapını kullanarak uyarlayın.

Ardından, doğruluğu sağlamak için kuvvet mesafesi eğrisinin uygunluğunu görsel olarak kontrol edin. Girinti derinliği belirleme için, oluşturulan kuvvet mesafesi eğrilerinin her birini veri analizi yazılımında açın ve analiz işlemi olarak Hertz-fit modelini seçin. Dikey sapma eksenini sıfırlamak için taban çizgisi uzaklığını çıkar seçeneğini uygulayın ve uzaklık artı eğim işlevini seçin.

Temas noktasını otomatik olarak tanımlamak için temas noktası bul işlevini kullanın. Dikey uç konumu işlevini kullanarak, girinti sırasında ham piezo yüksekliğinden yalnızca konsol sapmasını hesaba katan mesafeyi çıkarın. İşlenmiş kuvvet mesafesi eğrisini görüntülemek için esnekliğe uygun seçeneğini seçin.

Ardından, dikey uç konumu eksenindeki en negatif değerle hizalanacak şekilde grafiğin alanını seçin. XMIN kutusundaki parametre sekmesinde girintiyi okuyun ve belgeleyin. Tek teller içeren diskler, tavizsiz, sağlıklı kıkırdak alanlarını temsil eden medyan 2.6 kilo paskal ile daha yüksek sertlik değerleri gösterdi.

Osteoartrit başlangıcı ve ilerlemesi ile AFM ölçümleri, çift sicimlerde %42, küçük kümelerde %77 ve nihayetinde büyük kümelerle temsil edilen ileri evrelerde %88'lik sertlikte güçlü bir kademeli azalma gösterdi. Dağınık bir desen içeren diskler, Young modülü tek değerlerinin önemli bir varyasyonu ile yüksek elastikiyette sergilendi. Atanmış baskın hücresel patern organizasyonuna sahip tüm kıkırdak diskleri için, kullanılan ayar noktası ile ilişkili girinti derinliğinin sertlik ile ters orantılı olduğu bulundu.

Oluşturulan kuvvet mesafesi eğrilerinde görülen artefaktlar, AFM konsolu ile kıkırdak yüzeyi arasında optimal olmayan bir temasın veya Petri kabına yanlış numune fiksasyonunun göstergesidir. Kıkırdak eksplantlarımız, eliza yoluyla protein analizi, immün etiketleme, western moding veya PCR yoluyla gen analizi gibi çeşitli moleküler biyolojik teknikler kullanılarak daha fazla işlenebilir ve analiz edilebilir. Bu yöntem, yeni tedavilerin eklem kıkırdağı üzerindeki doğrudan etkisini incelemek için kullanılabilir ve araştırmacıların osteoartritin potoma mekanizmaları hakkında önemli bilgiler edinmelerine yardımcı olabilir.