2D Hücre Kültürü Modelinde Verteporfin Sitotoksisitesini Arttırmak için Şirket İçi İnşa Edilmiş ve Işık Yayan Diyot Tabanlı Fotodinamik Terapi Cihazı

Fotodinamik terapi, PDT, kanser tedavisine çeşitli avantajlar sunar ve etkinliği, bir fotosensitizörü aktive etmek için bir ışık kaynağına bağlıdır. Alandaki son gelişmelere rağmen, in vitro modeller için PTD için pahalı ve tekrarlanabilir bir cihaza erişim eksikliği vardır. Bu talebi karşılamak için, bu çalışma PhotoAct adlı hücre kültürleri üzerinde PDT testleri yapmak için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı tanımlamaktadır.

İnşaata başlamak için, aşağıdaki boyutlarda parçalar elde etmek için üç milimetre kalınlığında orta yoğunluklu fiber levhalar, MDF gördü. Aşağıdaki boyutlara sahip iki kutu oluşturun. Bir namlu jakı konektörü takmak için daha büyük kutunun arkasını delin.

Ayrıca, elektrik kabloları için bir geçiş sağlamak için daha büyük kutunun üst kısmını, daha küçük kutunun üstünü ve altını delin. Homojen ışık insidansını teşvik etmek için tüm iç yüzeyleri siyah mürekkeple boyayın. Küçük kutunun üst iç yüzeyine her biri 10 LED'li üç LED bandı paralel olarak takın.

Ek olarak, daha küçük kutunun alt iç yüzeyinin ortasına bir parlaklık sensörü takın. Ek 3D baskı dosyasını kullanarak kontrol ünitesinin yapısını yazdırın. Tüm bileşenleri, güç düğmesini, potansiyometreleri, zaman başlatma dokunmatik yüzeyini, LED'leri, parlaklık sensörünü, LCD'yi, zil sesini ve güç kaynağını ve kontrol ünitesinin iç kısmına monte edilmiş bir ESP-32 kontrol kartının parçalarını takın.

Ek dosyada bulunan programlama kodunu yükleyin ve tüm bağlantıların çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için bir test çalıştırın. Kutuları monte edin ve boşlukları ve dolayısıyla harici aydınlatma parazitini ve anında ışık kaybını önlemek için bunları birbirine sabitleyin. Monte edilmiş kontrol ünitesini prototipin üst kısmındaki delinmiş alana takın.

Aynı malzemeden aşağıdaki boyutlarda bir ön kapı inşa edin ve haznenin kapanmasını ve kesintisiz tahlilleri sağlamak için menteşeler ve Velcro bantlarla dış kutuya sabitleyin. Ayrıca ön kapıyı kolaylıkla ve hassasiyetle manipüle etmek için bir tutamak takın. İşlemler sırasında daha fazla stabilite sağlamak için prototipin altına dört lastik ayak yastığı takın.

HeLa hücre hattını Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta düşük glikozunda% 10 fetal sığır serumu ve% 1 gentamisin ile geliştirin. Kültür şişelerini karbondioksitin% 5'inde ve 37 santigrat derecede tutun. Hücre kültürünü, birleşmenin% 80 ila% 90'ına ulaşana kadar yönetin ve inceleyin.

Tohumlama işlemi ile hücre canlılığı protokolünü başlatın. Ortamın şişeden akıcı HeLa hücre kültürü ile çıkarılmasını sağlayın. Şişeyi fosfat tampon salin, PBS ile yıkayın ve vurgulanan ayrıntıları izleyerek kültürü tripsin ile ayırın.

Bir hemositometre ile askıya alınan hücreleri sayın ve bunları kuyu başına 20.000 hücre konsantrasyonunda çok kuyucuklu bir mikro plakaya tohumlayın. Karanlık ve aydınlık tedavi koşulları için iki plaka hazırlayın ve hücre tutturmak için 24 saat boyunca inkübe edin. Bir fotosensitizör ile tedaviye devam etmek için, ortamı her iki plakadan da çıkarın ve hücreleri 100 mikrolitre artan Verteporfin konsantrasyonları ile tedavi edin.

Verteporfinin içselleşmesine izin vermek için hücreleri 24 saat boyunca tedavide tutun. Kuluçkadan sonra, tedaviyi çıkarın, hücreleri PBS ile yıkayın ve ilaçsız ortam ekleyin. Işığa maruz kalmaktan korumak için bir mikro plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 24 saat boyunca inkübe edin.

Bu mikro plaka, PDT sonuçlarının daha fazla analizi için kontrol verileri sunacaktır. Diğer mikroplaka, PhotoAct'teki ışığa maruz kalma koşullarında kullanılacaktır. Ekipmanı çalıştırmak için, prize takın ve güç düğmesine basarak açın.

Çok kuyulu mikro plakayı PDT odasına yerleştirin ve ön kapıyı yan Velcro bantlarla sabitleyerek ekipmanı kapatın. Ekipmanı kurmak için, ışık emisyonunun RGB konfigürasyonunu ayarlamak üzere potansiyometreleri kullanın. Zaman yapılandırmasını ayarlamak ve tahlil süresini ayarlamak için artı/eksi dokunmatik yüzeye basın.

Tahlille ilgili doğru bilgilerin ekranda gösterilip gösterilmediğini kontrol edin ve gerekirse son ayarlamaları yapın. Testi başlatmak için başlat dokunmatik yüzeyine basın. Deneyin başında tek bip sesi duyulmalıdır.

Deney sırasında, ışık ve kalan süre gibi ilerleme bilgileri ekranda gözlemlenebilir. PDT testi sırasında ön kapıyı açmayın veya herhangi bir konfigürasyonu değiştirmeyin. Tahlilin sonunda, dört bip sesi duyulmalıdır ve elektronik sistem tüm LED'leri kapatacaktır.

Bitmiş bir mesaj ve deney sırasında genişleyen son enerji miktarı ekranda gözlemlenebilir. Akıcılık nihai değeri, vurgulanan denkleme göre hesaplanır. Işığa maruz kalan mikro plakayı örtün ve 24 saatlik inkübasyona devam edin.

Kuluçka süresinden sonra, her iki plakadan da ortamı çıkarın, hücrelerin tek katmanını PBS ile yıkayın ve MTT çözeltisi ekleyin. Formazan kristallerinin oluşumuna izin vermek için her iki plakayı da karanlık ve aydınlık koşulları dört saat boyunca inkübe edin. MTT çözeltisini dikkatlice çıkarın ve mor kristalleri bir DMSO ve etanol çözeltisi ile çözün.

Kristallerin tamamen çözünmesinden sonra, 595 nanometrede bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbans ölçümünü gerçekleştirin. Nihai ürün, üst iç yüzeyi 30 dağınık ışık yayan diyotlar, LED'ler seti ile donatılmış, görünür ışığın farklı spektrumlarını yaymak üzere programlanmış karanlık bir odadan oluşur. İç yüzeylerin düşük yansıtıcılığı ve LED konfigürasyonunun düzgün dağılımı nedeniyle homojen bir ışık insidansı tespit edilmiştir.

Kurulum arayüzü kullanıcı dostudur ve yerleşmiş deneysel koşul yeniden üretilebilirdi. Kavramın bir kanıtı olarak, cihaz ışığa maruz kaldıktan sonra 2D HeLa hücre kültüründe Verteporfin'in sitotoksik etkisini arttırmak için kullanıldı. Şekilde gösterildiği gibi, GI50 değeri ışık durumu için 3.1 mikromolar idi.

ve karanlık durum için 13.8 mikromolar Bu nedenle, koşulları karşılaştıran verimlilikte dört kattan fazla artış, Verteporfin'in bir fotosensitizör olarak kullanımını ve PhotoAct'in PDT tahlillerine uygulanabilirliğini doğrulamaktadır. Bu çalışmada açıklanan prototipin kullanımını doğrulamak için, fotosensitizör, hücreler ve akıcılık da dahil olmak üzere aynı deneysel koşullar altında ticari bir PDT cihazı kullanılmış ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Şekilde gösterildiği gibi, her iki cihaz da Verteporfin'i eşit şekilde fotoaktif hale getirerek sitotoksik etkiyi arttırır.

Son olarak, ışığa maruz kaldıktan sonra Verteporfin tarafından tetiklenen ROS aracılı hücre ölümü, DCFDA testi kullanılarak akış sitometrisi ile doğrulandı. Özetle, cihaz toplam maliyeti 50'den az olan ticari olarak temin edilebilen düşük maliyetli bileşenlerle kolayca inşa edildi. Cihazın diğer başlıca avantajı arasında taşınabilirlik, düşük bakım talebi, birden fazla kültür plakası türünü ışınlama kapasitesi, tahlil başına dört üniteye kadar aynı anda kullanım, doğru ve tekrarlanabilir ışınlama, bilgisayarlara veya diğer makinelere bağlantı gerektirmeyen kullanıcı dostu ve basit kurulum arayüzü bulunmaktadır.

Ek olarak, operasyon sırasında problemleri veya hataları bulmak ve düzeltmek için sistematik bir problem çözme yaklaşımı sağlamak için bir karar akış şeması sunulmaktadır. Bu bulgular, PhotoAct'in PDT'yi bilimsel araştırmalara kolaylaştırmak için faydalarını genişletmeye, fotosensitizörlerin etki mekanizmasını ve klinik uygulamalarını keşfetmeye izin vermektedir.