Caenorhabditis elegans'ta Mikrobiyom Araştırmaları için Mikrobiyal Çeşitliliğe Sahip, Doğal Benzeri Ortamlar Olarak Kompost Mikrokozmoslar

Bu protokol, solucanların ve kompost mikrokozmoslarının nasıl yetiştirileceğini açıklar ve konakçı-mikrobiyom etkileşimlerinin doğal benzeri bir bağlamda laboratuvar içinde araştırılmasını sağlar. Bu yöntem, yabani solucanları doğadan izole etmeye veya sınırlı mikrobiyal çeşitliliğe sahip sentetik mikrobiyal toplulukları kullanmaya bir alternatif sunar. Bu protokol basittir ve herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir ve yeni başlayanlar için bile uygundur.

Başlamak için, uygun herhangi bir kaynaktan kompost veya bahçe toprağı elde edin ve havalandırma için kapakta kesilmiş delikler bulunan standart bir mutfak plastik kabında laboratuvarın içinde saklayın. Meyve sineklerini ve diğer omurgasızları dışarıda tutmak için delikleri pamuk yünü ile tıkayın. Kompostu veya toprağı, kütlece ikiye bir oranında üretmek için doğranmış ürünlerle veya topraktaki farklı ürünlerin bir karışımıyla zenginleştirin.

Kompostu günde bir kez karıştırın ve nemi çamurlu hale getirmeden korumak için gerektiği gibi M9 ortamı ekleyin. Her mikrokozmos için, infoil ile kaplı 30 mililitrelik bir cam behere 10 gram zenginleştirilmiş kompost ekleyin. Her 50 mililitrelik tüpe 30 gram zenginleştirilmiş kompost ekleyin.

Tüpü M9 ve vorteks ile doldurun. Tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 560 G'de santrifüj yapın. Serolojik bir pipet kullanarak, süpernatantları peleti rahatsız etmeden çıkarın ve bunları yeni bir 50 mililitrelik tüpte birleştirin.

Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj ederek bakteri ekstraktını konsantre edin. Peletleri, her bir mikrokozmos için 200 mikrolitreye ve mikrokozmoslar için görünür bir vekil görevi görecek bir plaka için 200 mikrolitreye sahip olacak kadar M9'da yeniden askıya alın. Otoklavlanmış kompost kabına ve görünür proxy NGM plakasına 200 mikrolitre konsantre mikrobiyal ekstrakt ekleyin.

Her mikrokozmosa ve proxy plakasına 500 ila 1000 L1 larva ekleyin. Silindirik bir PVC boruyu kağıt mendille hizalayın. Bu silindir, hunideki dibine yapıştırılmış bir milimetre naylon ağa sahip olmalıdır.

Silindiri bir şişede oturan Baermann hunisine yerleştirin. Solucan mikrokozmosuna 20 mililitre M9 ekleyin. Karışımı çalkalayın ve ardından karışımı beherden Baermann huni kurulumundaki kağıt mendilli silindire dökün.

Daha fazla M9 ekleyerek kompostu tamamen huniye batırın. Hasat edilen solucanları içeren filtradı 50 mililitrelik bir tüpe bırakmak için kelepçeyi açın. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca 560 G'de santrifüj ederek solucanları konsantre edin. Bu adımları tekrarlayın ve daha fazla solucan istenirse filtratları farklı turlardan çekin.

Tüpte 15 mililitre bırakırken süpernatantı serolojik bir pipetle çıkarın. Kalan sıvıyı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve solucanları daha da konsantre etmek için bir dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Süpernatantın 14 mililitresini serolojik bir pipetle çıkarın.

Aynı zamanda, kalan mikrokozmos toprağının bir gramını 1,5 mililitrelik bir tüpe toplayın ve el yazmasında açıklandığı gibi çevresel bakteri topluluğunu içeren toprak örneklerini işleyin. Konsantre hasat edilen solucanların bir mililitresini cam pipet kullanarak 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Solucanların tüpün dibine yerleşmesine izin vermek için iki dakika boyunca kuluçkaya yatırın.

Tüpün dibinde 100 mikrolitre pelet bozulmadan bırakırken süpernatantı çıkarın. Peleti 1,5 mililitre M9 artı Triton X ile yıkayın, böylece solucanların her seferinde dibe çökmesine izin verin. Yıkanmış solucanları 100 mikrolitrelik bir hacimde, bir cam pipet kullanarak yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın.

Solucanları felç etmek için, 100 mikrolitre 25 milimolar levamisol hidroklorür ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. 200 mikrolitre% 4 ağartıcı çözeltisi ekleyin ve iki dakika boyunca inkübe edin. En alttaki 150 mikrolitreyi bozulmadan bırakarak süpernatantı çıkarın ve solucan peletini M9 artı Triton X ile üç kez yıkayın.Bu yüzey sterilize edilmiş solucanlar, kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir ve daha sonra aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Solucan bağırsağı mikrobiyomlarını ve çevresel toplulukları, ağırlıksız veya ağırlıklı UniFrac mesafesine dayanan ilke koordinat analizini kullanarak karşılaştırmak, solucan bağırsağı mikrobiyomlarının kendi çevrelerindekilerden uzakta farklı kümelendiğini göstermiştir. Ağırlıksız UniFrac mesafelerine dayanan prensip koordinat analizi, toprak ve solucan mikrobiyomları arasında ayrım yapmazken, ağırlıklı mesafelere dayalı kümeleme, solucan bağırsağı ve kompost mikrobiyomlarının net bir şekilde ayrıldığını ortaya koymuştur. Bu çalışmada, kompost mikrokozmoslarında yetiştirilen solucanlar 16S dizilimi için kullanılmıştır, ancak farklı çevresel mikrobiyomların olumsuz koşullara karşı konakçı direnci üzerindeki etkilerini test etmek için de kullanılabilir.

Alternatif olarak, yeni bakteri taksonları, solucan bağırsağı kommensallerinin bilinen taksonomik ve fonksiyonel çeşitliliğini genişletmek için kompost mikrokozmoslarından toplanan solucanlardan izole edilebilir. Geliştirilmesinden sonra, mikrokozmoslar boru hattı, bağırsak mikrobiyomunu şekillendirmede çevresel ve konakçı genetik faktörlerin katkılarının değerlendirilmesini kolaylaştırdı.