Ölçeklenebilir 3D Mühendislik Kas Dokularında Preklinik İlaç Testi
7 Nisan 2023
Bu protokol, 3D mühendislik ürünü kalp ve iskelet kası dokularının oluşturulması için yöntemler sağlar ve klinik öncesi ilaç tarama modalitelerinde kullanımlarını açıklar. Açıklanan yöntemler, 24 dokunun paralel olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesini kolaylaştırmak için manyetik bir algılama sistemi kullanır.
Platformumuz, aynı anda 24 kuyucukta kontraktiliteyi ölçmek için 3D mühendislik kas dokuları ve manyetik algılama donanımı kullanır. Bu, insan kas dokularını kullanarak in vitro olarak yeni terapötikleri değerlendirmek için daha yüksek bir verim yöntemi sağlar. Döküm yöntemimiz, 3D mühendislik kas dokularının imalatında tutarlılığı ve tekrarlanabilirliği artırır.
Platformumuzda kontraktilite ölçümleri ve analizleri için manyetik algılama donanımı ile donatılmış 24 delikli bir sarf malzemesi döküm plakası tasarladık. Bu yöntem, kontraktiliteyi etkileyen herhangi bir kas hastalığı için in vitro hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve gen terapisi hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Şu anda nöromüsküler bir bağlantı modeli oluşturmak için motor nöronları 3D yapılarımıza dahil ediyoruz.
Başlamak için, önceden soğutulmuş bir doku döküm kitini, hücre kültürü başlığının içindeki soğuk bir bloğa veya buza yerleştirin. Döküm plakasını buz üzerine düz bir şekilde yerleştirin. Trombin çözeltisini yapmak için taban ortamına trombin ekleyin ve post kafesi döküm plakasından yeni bir steril 24 delikli plakaya taşıyın.
Pipet, döküm plakasının önceden soğutulmuş her bir kuyucuğuna 50 mikrolitre trombin çözeltisi yerleştirin ve kafesi tekrar kit üzerine yerleştirin. Döküm kitini buz üzerinde bir kenara koyun. Daha sonra, kardiyak EMT ortamını hazırlamak için 500 mililitre RPMI ortamı, 10 mililitre B27 ve 2.5 gram aminokaproik asit veya ACA ekleyin.
Dokuları dökmek için kullanılacak EMT ortamını çıkarın ve üzerine 10 mikromolar ROCK inhibitörü ekleyin. Primer miyoblastlar için 50 mililitre F10 ortamı ve 0.25 gram aminokaproik asit veya ACA ekleyerek iskelet EMT ortamını hazırlayın. IPSC kaynaklı miyoblastlar için 0.1 gram ACA kullanın.
Ardından, ACA içeren döküm ortamını steril olarak filtreleyin. Hücre kültürü sınıfı ayrışma reaktifini ve eşit hacimli EMT ortamını 37 santigrat dereceye ısıtın. Bu ısıtılmış EMT ortamı, ayrışma reaktifini seyreltmek için kullanılacaktır.
Hücreleri PBS ile yıkayın ve hücreleri kaldırmak için ısıtılmış ayrışma reaktifini ekleyin. Beş dakika boyunca veya hücreler kalkıncaya kadar 37 santigrat derecede inkübe edin ve plakanın yan tarafına dokunarak kültürleri her iki ila üç dakikada bir kontrol edin. Hücreler kalktıktan sonra, onları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için P-1000 pipetle tritüre edin. Kalan hücreleri toplamak ve konik tüpe eklemek için plakayı ve şişeyi ek bir EMT ortamı ile yıkayın. Yine, tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için hücreleri tritüre edin.
Ayrışma işlemini sonlandırmak için EMT ortamı ekleyin ve ardından hücre sayımları için hücre süspansiyonlarının örneklerini alın. Otomatik bir hücre sayacı veya tripan mavisi renkte bir hemositometre kullanarak hücre sayımları gerçekleştirin. Hücreleri dört dakika boyunca 200 G'de döndürün, süpernatanı aspire edin ve artık ayrışma reaktifini çıkarmak için hücreleri EMT baz ortamının beş mililitresinde yeniden askıya alın.
Dört dakika boyunca tekrar santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı aspire edin ve hücre süspansiyonlarını uygun yoğunluklarda hazırlayın. İstenilen doku sayısını oluşturmak için gereken her hücre çözeltisinin hacimlerini hesaplayın ve hesaplanan hücre hacimlerini 15 mililitrelik bir konik tüpe pipetleyin. EMT başına hücre süspansiyonuna 10 mikrolitre fibrinojen ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
Her EMT'nin son doku yapısında 90 mikrolitre hücre süspansiyonu, 10 mikrolitre fibrinojen ve 50 mikrolitre trombin çözeltisi olduğundan emin olun. Bir hücre kültürü başlığında, doku döküm kitinin kapağını çıkarın ve döküm plakasını, buzun üzerinde düz duran post kafesi ile yerleştirin. Hücre fibrinojen karışımını karıştırın ve bir P-200 pipet ile 100 mikrolitre çekin.
50 mikrolitre trombin çözeltisi ile hazırlanan kuyucuklara 100 mikrolitre karışım ekleyin ve iyice karıştırmak için beş kez tritüre edin. Pipetin ilk durağın ötesine itilmemesi ve herhangi bir kabarcık oluşmasını önlemek için tritürasyondan sonra ucu çıkarmayın. Her dokuyu dökmeden önce hücre süspansiyonunu konik tüpte karıştırın.
Kafesin herhangi bir hareketini önlemek için hem kafesi hem de döküm kuyusu plakasını aynı anda bir elinizin işaretçi parmağını ve başparmağını kullanarak tutun veya plakayı buz üzerinde düz bırakın ve döküm plakasını görmek için buz kovasını sallayın. Tüm dokular dökülene kadar her doku için taze bir P-200 ucu ile tekrarlayın. Tohumlanmış kiti dikkatlice inkübatöre aktarın ve 80 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, kalp dokuları için EMT ortamının kuyucuğu başına iki mililitre içeren taze bir 24 delikli plaka hazırlayın ve ortamı ısıtmak için plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. 80 dakikalık inkübasyondan sonra, döküm kuyularının kenarına yavaşça bir mililitre EMT ortamı ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, post kafesi dikkatlice kaldırın ve dokuları döküm plakasından ısıtılmış ortamla hazırlanmış 24 delikli bir plakaya aktarın.
Son olarak, dokulu plakaları hücre kültürü inkübatörüne 37 santigrat derecede geri getirin. Başarısız EMT üretimi, direklerden doku ayrılması gibi yıkıcı başarısızlıklardan, hava kabarcıkları ve her iki direğin etrafında eşit olmayan doku birikimi gibi daha ince yapısal kusurlara kadar değişebilir. Dökümden bir gün sonra EMT yapısı burada gösterilmektedir.
İskelet kası dokuları, hücre füzyonu ve hidrojel sıkıştırmasının sıfır gününden itibaren bir farklılaşma ortamına transfer edildi. Yedinci günden 28. güne kadar, aynı EMT, iki direk arasında biraz daha kısa bir toplam uzunluk ve EMT'nin orta bölümünden ölçüldüğünde daha küçük bir genişlik gösterdi. Sıkıştırma boyunca EMT çapı karşılaştırılarak 21 gün boyunca dört doku plakası izlendi.
Zaman noktaları, plakalar arasında tutarlı EMT boyutu gösterir. Matris yeniden şekillenmesi stabilize edildiğinden maksimum sıkıştırmaya 21. günde ulaşılır. EMT'lerin immünohistokimyası burada tasvir edilmiştir.
EMT'ler kültürün 10. gününde sabitlendi ve parafine gömüldü. İnce kesitler görüntüleme öncesinde miyozin ağır zincir ve distrofine karşı antikorlarla boyandı. Bu grafik görüntüler, zaman içinde kardiyak EMT'lerden ve iskelet EMT'lerinden ölçülen ortalama mutlak seğirme kuvvetini temsil eder.
Mühendislik kalp dokularında akut ve kronik doksorubisin tedavisi burada gösterilmiştir. Dox'un üç farklı doz konsantrasyonu bolus içinde verildi veya 27 gün boyunca mühendislik kalp dokularına sürekli olarak uygulandı. Mühendislik iskelet kası dokularında BDM'ye doz yanıtı bu şekilde sunulmuştur.
Kardiyak atış hızı veya seğirme sıklığı, EMT'ler bu bileşiğe maruz kaldığında kardiyotoksisiteyi gösteren kontraktil kuvvetin kesilmesiyle birlikte doza bağımlı bir şekilde durur. Doku dökümü sırasında hatırlanması gereken en önemli şey, hücre süspansiyonunuz ve reaktifleriniz de dahil olmak üzere her zaman her şeyi soğuk tutmak ve döküm başladıktan sonra post kafesi tamamen sabit tutmaktır.
Genel Bakış
Bu protokol, ilaç taraması için manyetik bir algılama sistemi kullanan, 3 boyutlu mühendislik ürünü kardiyak ve iskelet kas dokularının oluşturulmasını özetlemektedir. Uygulanan yöntemler, 24 dokunun eş zamanlı olarak değerlendirilmesine olanak tanıyarak preklinik çalışmalarda verimliliği artırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak ve iskelet kası mühendisliği
- Preklinik ilaç taraması
- Doku modelleme
Arka Plan
- 3D mühendislik ürünü kas dokuları, kas hastalıklarını incelemek için uygun bir in vitro model sağlar.
- Manyetik algılama teknolojisi, yüksek kapasiteli kontraktilite ölçümlerine olanak tanır.
- Doku üretimindeki tutarlılığın artırılması, güvenilir deneysel sonuçlar için kritik öneme sahiptir.
- Motor nöronların dahil edilmesi, bir nöromusküler kavşak modeli oluşturmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Tutarlı 3D kas dokuları üretmek için bir yöntem geliştirmek.
- İnsan kas dokularını kullanarak ilaç keşfini ve hastalık modellemesini kolaylaştırmak.
- In vitro kontraktilite değerlendirmelerinin verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Doku oluşumu için döküm plakalarının ve trombin çözeltilerinin hazırlanması.
- Uygun hücre yoğunluğunu sağlamak için hücrelerin disosyasyonu ve sayımı.
- Fibrinojen ve trombin çözeltileri kullanılarak kas dokularının dökümü.
- Dokuların inkübasyonu ve diferansiyasyon medyumuna transferi.
Temel Sonuçlar
- Tutarlı kontraktiliteye sahip 3D mühendislik ürünü kas dokularının başarılı bir şekilde üretilmesi.
- Dokuların maksimum kompaktlaşmasının 21. güne kadar gözlemlenmesi.
- İmmünohistokimyasal analizin kasa özgü proteinlerin varlığını doğrulaması.
- Birden fazla doku genelinde kontraktilitenin yüksek kapasiteli değerlendirmesinin gerçekleştirilmesi.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, kas dokularının verimli bir şekilde üretilmesine ve değerlendirilmesine olanak tanır.
- Bu yöntem, ilaç keşfi ve kas hastalıklarının modellenmesinde önemli ölçüde yardımcı olabilir.
- Gelecekteki çalışmalar, motor nöronların yapılara entegre edilmesine odaklanacaktır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Ölçeklenebilir 3D mühendislik ürünü kas dokusu platformları, hem sağlıklı hem de hastalık modellerinde kontraktil fonksiyonun tekrarlanabilir ve kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak preklinik ilaç testlerindeki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Bu teknoloji, kardiyotoksisite ve miyotoksisite için öngörü güvenilirliğini artırarak daha erken risk azaltımını ve daha bilinçli portföy kararlarını destekler. Yüksek kapasiteli, etiketsiz kontraktilite analizlerinin entegrasyonu, bu modelleri keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan translasyonel süreklilik için temel araçlar haline getirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hastalıkla ilişkili kas sistemlerinde terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Aday bileşiklere verilen kontraktil yanıtların nicelleştirilmesi yoluyla mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Kas kuvveti ve kinetiğinin doğrudan ölçümü aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bileşik tarama iş akışları için standartlaştırılmış, yeniden üretilebilir 3D kas yapıları sağlar.
- 24 doku genelinde eş zamanlı olarak kantitatif, yüksek verimli kontraktilite çıktıları sunar.
- Deney değişkenliğini azaltır ve kardiyotoksik ile miyotoksik riskler için ölçeklenebilir taramaları destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- In vitro kontraktilite metriklerini, kardiyak ve iskelet kası güvenliği için translasyonel biyobelirteçlerle uyumlu hale getirir.
- Mühendislik ürünü dokularda akut ve kronik ilaç etkilerinin boylamsal analizine olanak tanır.
- BMS-986094 ile görülenler gibi klinik olarak ilgili toksisite durumlarını modelleyerek, riske göre ayarlanmış ilerlemeyi destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu platform, fonksiyonel kas değerlendirmesi için birleştirilmiş ve ölçeklenebilir bir sistem sağlayarak erken keşif, öncü bileşik tanımlama ve preklinik güvenlik değerlendirmesi arasında bir köprü kurar.
- Keşif Biyolojisi: Mühendislik ürünü kas modellerinde hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturmalarını destekler.
- Tarama: Bileşik ön elemesi için tekrarlanabilir, kantitatif kontraktilite verileri sağlar.
- Analitik: Kuvvet ve kinetiğin doz-yanıt ve boylamsal ölçümüne olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Kas fonksiyonu için klinik güvenlik son noktalarıyla uyumu kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli hücre kaynaklarına ve hastalık modellerine uyarlanabilen, yeniden kullanılabilir ve otomasyon dostu bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kasla ilgili ilaç güvenliği ve etkinliği için öngörüsel güveni artırır.
- Operasyonel Değer: Doku üretimini ve ölçümünü standartlaştırarak başarısızlık oranlarını ve manuel müdahaleyi azaltır.
- Stratejik Değer: Erken ve nicel güvenlik verileri sağlayarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Riski ayarlanmış önceliklendirmeyi mümkün kılar ve öngörülemeyen kas toksisiteleri nedeniyle geç aşamalarda yaşanan kayıpları azaltır.
Uygulama Hususları
- 3D doku kültürü ve kontraktilite deneyi uygulamalarında uzmanlık gerektirir.
- Manyetik algılama donanımına ve uyumlu 24 kuyucuklu döküm plakalarına erişim gereklidir.
- Veri analizi ve doku üretim protokolleri için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- iPSC kaynaklı ve primer miyoblastlar dahil olmak üzere çeşitli hücre kaynaklarına uyarlanabilir.
- Sınırlamalar arasında, protokollerin titizlikle takip edilmemesi durumunda doku kopması, hava kabarcıkları ve yapısal tutarsızlıklar oluşma potansiyeli yer almaktadır.
