In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Geliştirdiğimiz epigenetik susturma teknolojisi, gen susturma teknolojileri olan daha geniş bir teknoloji alanına aittir. Epigenetik susturma ihtiyacını geliştirmeye başlamadan önce, sahada iki çok alternatif vardı. Biri RNA müdahalesi ile gen yıkımı, diğeri ise yapay nükleazlar tarafından gen bozulmasıydı.

Ve yapay nükleazlar tarafından gen bozulması DNA düzeyinde çalışır. Yani etkisiz hale getirmek istediğiniz hedef geniniz var ve hücreye çift sicim kopmasına neden olan bazı yapay nükleazlar veriyorsunuz. Bu tür bir çift sicim kopması, sonunda ya işlevsel olmayan proteinin dejenerasyonunu ya da aynı anda transkripsiyonel bozunmayı empoze eden dejenerasyonel toplamı, çerçeve kayması mutasyonunu gerçekleştirebilir.

Bu yüzden epigenetik susturma, tasarlanmış transkripsiyon baskılayıcıları olarak adlandırılan hücreyi ileterek çalışır. Bunlar, hedef DNA'nıza bağlanabilen ve daha sonra yalnızca epigenetik marx olarak adlandırılan hedef geninize empoze edebilen bazı küçük proteinlerdir. Bunlar, bir kez DNA üzerinde biriken ve kromatin sıkışmasına yol açabilen bazı kimyasal modifikasyonlardır.

Kromatin sıkıştırması daha sonra transkripsiyon inhibisyonuna yol açar, bu nedenle hedef geninizin ekspresyonuna daha fazla sahip olmazsınız. Ve en önemlisi, bu tür bir transkripsiyon baskılayıcı durum, hücreler tarafından uzun süre birleştirilebilir. Susturulacak hedef geni ifade eden hücre hatlarını tanımlamak için, İnsan Protein Atlası'ndaki hedef gene göz atın ve ilgilenilen somatik dokuyu temsil eden hücre hatlarını belirlemek için Hücre Hattı bölümünde gezinin.

Tanımlanan hücre hatlarından, verimli geçici gen dağıtım protokollerinin mevcut olduğu hücrelere öncelik verin. Ardından, bir gen görüntüleyici açın ve florofor ekspresyon kasetini entegre etmek için hedef genin bölgesini belirleyin. Ardından, Beta-2M geninin ilk intronunda hedef bölgeyi kesecek olan GNRA'yı tanımlamak ve seçmek için CHOPCHOP'u kullanın.

Ardından, GNRA kesim bölgesi için bir sol homoloji kolu, bir promotör serbest transgen ekspresyon kaseti ve bir sağ homoloji kolundan oluşan bir donör şablonu tasarlayın. CRISPR Cas9 nükleaz sistemini ve donör şablonunu K-562 hücre hattı içinde, üreticinin talimatlarına göre nükleofeksiyon yoluyla iletin. K-562 hücrelerini en az 14 gün boyunca kültürleyin.

Bir akış sitometresi kullanarak floresan raportörün zaman içindeki ekspresyon seviyelerini izleyin. tdTomato raportörünün floresan yoğunluğunu ölçmek için FICO etherin kanalını etkinleştirin. UCSC Genom Tarayıcısında hedef gene göz atın ve CpG adaları ve H3K27 asetilasyonu için zenginleştirilmiş bölgeler gibi transkripsiyonel aktivitesini potansiyel olarak düzenleyen bölgelerin nükleotid dizisini çıkarın.

Seçilen dizileri CHOPCHOP çevrimiçi aracına yapıştırın ve alınacak GNRA'ların amacı olarak bastırmayı seçin. CHOPCHOP, ilgilenilen genetik diziye göre haritalanan ve hedef dışı eşleşmelerin sayısını ve hedeflenen tahmini verimliliği göz önünde bulundurarak bir puana göre listelenen GNRA'ların bir listesini sağlayacaktır. Hedef dizi başına en az 10 GNRA seçin.

Genom boyunca diğer intergenik dizilerle tam eşleşme olmadan entegre edilecek tüm bölgeyi kapsayan GNRA'ları seçmeye çalışın. Kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerinde ETRS'yi kodlayan plazmitleri dönüştürdükten sonra, restriksiyon enzimi sindirimi ve Sanger dizilimi ile kolonileri ETR taşıyan plazmidin varlığı açısından tarayın. PHU6 GNRA omurgası içindeki GNRA'ları klonlamak için önce moleküler biyoloji tasarım yazılımını kullanarak oligolar oluşturun.

Proto aralayıcının yukarı akışında beş nükleotid dizisi ekleyin ve bu 25 nükleotid uzun oligoyu etiketleyin. Benzer şekilde, 25 nükleotid uzunluğunda bir oligo oluşturmak ve etiketlemek için proto aralayıcının ters tamamlayıcısının beş nükleotid dizisini ve bunun akış aşağısındaki bir sitozini ekleyin. Bu oligoları, 100 mikromolar'da suda yeniden süspanse edilmiş tuzsuz tek sarmallı DNA oligoları olarak sentezleyin.

İki mikrolitre tavlama tamponuna ve 16 mikrolitre suya her oligodan bir mikrolitre ekleyin. Çözeltiyi 10 dakika boyunca 95 santigrat derecede bir termodöngüleyiciye yerleştirerek oligo tavlama işlemini gerçekleştirin. Daha sonra 45 dakika boyunca kademeli olarak 25 santigrat dereceye soğutun.

Tavlanmış oligoların bir mikrolitresini 99 mikrolitre nükleaz içermeyen su ile seyreltin. Daha sonra bu seyreltmenin bir mikrolitresini, daha önce Bsa1 kısıtlama enzimi ile sindirilmiş olan 50 nanogram phU6 GNRA plazmidi ile bağlayın. 20 mikrolitre kimyasal olarak yetkin E.coli hücresini iki mikrolitre ligasyon ürünü ile dönüştürdü.

Plazmid DNA üretimi için birden fazla koloni seçin ve Proto Aralayıcının Sanger dizilimi ile başarılı bir şekilde klonlandığını onaylayın. GNRA'ları ve CRISPR dCas9 tabanlı DTR'leri raportör hücre hattında dizi halinde iletmek için, önce plazmitlerin her birinin 500 nanogramını içeren ayrı tüpler hazırlayın ve test edilecek 125 nanogram farklı GNRA kodlama plazmitlerini ekleyin. Sahte muamele edilmiş numune olarak GNRA ve ETR içermeyen bir nükleofeksiyon koşulu ekleyin.

Numune başına en az üç teknik kopya hazırlayın. Tüp başına beş kez 10 ila beşinci Beta-2M tdTomato K-562 hücrelerini pelet edin ve bunları plazmid karışımı ile çekirdeklendirin. Hücreleri, önceden ısıtılmış RPMI 1640 memeli hücre kültürü ortamının 200 mikrolitresinde yeniden süspanse edin ve inkübatöre yerleştirin.

ETR'lerin verilmesinden sonra farklı zaman noktalarında susturulmuş hücrelerin yüzdesini ölçmek için akış sitometrisini kullanın. Flora 4 kaplama dizisi olmayan vahşi tip hücreler kullanın. Raportör negatif hücrelerinin eşiğini ayarlamak için.

Raportör pozitif hücreler için kapıyı ayarlamak için sahte işlenmiş numuneyi kullanın. Uzun vadeli susturma verimliliği açısından ilk üç GNRA'yı belirleyin. Bu örneklerde kararlı bir şekilde tutulan raportör negatif alt popülasyonlarını seçmek için gerçekleri kullanın.

Ayrıca, sonraki analizlerde uygun karşılaştırmaya izin vermek için aynı işlem altında sahte muamele görmüş numunelerin gerçeklerini gerçekleştirin. CRISPR Cas9 ile indüklenen tomolojiye yönelik onarım ile insan Beta-2M geninin ilk intronuna bir tdTomato floresan raportörü entegre edildi. Raportör pozitif K-562 hücreleri, entegrasyondan sonra tedavi edilen numunede görünür.

Üçlü ETR kombinasyonunun GNRA'larla birlikte geçici olarak verilmesi üzerine, floresan raportörün ekspresyonunu değerlendirmek için uzunlamasına akış sitometrisi analizi yapıldı. Akut analizlerde muhabir baskısında, ETR kodlayan plazmitlerin zaman içinde mitotik seyreltilmesi nedeniyle kısmen yeniden emilen bir pik gözlendi. ETR'nin GNRA kombinasyonu ile hedef lokus üzerinde CpG metilasyonunun etkili bir şekilde birikmesi, tedavi edilen hücrelerin oldukça büyük bir kısmında raportörün kalıcı olarak baskılanmasıyla belirgindi.

Farklı GNRA'lar değişken uzun vadeli susturma verimliliği gösterdi. Kalıcı ve verimli epigenom susturmanın sağlanmasındaki en önemli adımlardan biri, etkili tek gRNA'nın tanımlanmasıdır. Bunu yapmak için, her türlü uygulamanın, transkripsiyonel düzenleyiciler için diğer sitelerde promotör ve cevap da dahil olmak üzere en duyarlı dizilerin tanımlanmasıyla başlaması gerekir.

Hangisinin en duyarlı ve etkili bölge olabileceği belirlendikten sonra, herkes tek bir gRNA'nın bireysel veya tek bir gRNA kombinasyonu olarak farklı türde tek bir gRNA testi tasarlamalıdır. Epigenom düzenlemenin en belirgin uygulamalarından biri, bu genin susturulmasının belirli hastalıkları tedavi etmek için yararlı olabileceği herhangi bir fonksiyonel mutasyon kazanımındaki klinik öncesi translasyondur. Alternatif olarak, belirli bir promotörün epigenetik düzenlemesini spesifik olarak değiştirme yeteneğinin hem klinik hem de temel çeviri bilimi için süper yararlı bir araç olabileceğini aklımızda tutmalıyız.