Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Tüm kokleayı dijitalleştirebilen bir ışık tabakası mikroskobu geliştirdik. Bu mikroskop, küçük fare koklealarını büyük bir insan temporal kemiğine kadar görüntüleyebilen uzun bir çalışma mesafesine sahip havaya monte edilmiş hedeflere sahiptir. Kokleayı herhangi bir mekanik tahribata neden olmadan bir lazer ışını ile seri olarak bölümlere ayırır.

Görüntüleme yöntemimiz, yaşlanmaya bağlı olarak saç hücrelerinin ve spiral ganglion nöronlarının kaybı gibi kokleadaki patolojik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bir fareyi ötenazi yaptıktan ve kafasını kestikten sonra, kafatasını hemiseke etmek için beyinden dorsal-ventral bir kesi yapın. Beyni çıkarın ve kafatasının bazoventral kısmındaki yuvarlak bullayı tanımlayın.

Bula'yı rongeurs ile açın. Ardından, kokleayı görselleştirin ve çıkarın. Beş kat büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, oval pencereyi delin ve stapesleri keskin bir seçimle çıkarın.

Ardından, membranı delmek için yuvarlak pencereye bir çekme yerleştirin. Sabitleme yapmak için, açılan yuvarlak pencereyi, iki mililitre formalin ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırıngaya tutturulmuş bir infüzyon setinin kesilmiş ucuyla örtün. Formalini, iki dakikalık bir süre boyunca kokleanın perilenfatik boşluklarından yavaşça demleyin ve formalinin kokleandan açılan oval pencereden çıkmasını sağlayın.

Fazla dokuyu kokleadan kesin. % 10 formalin içeren bir şişeye batırın ve gece boyunca bir rotatöre yerleştirin. Kaleksifikasyon için, kokleayı PBS'de her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın.

% 10 EDTA çözeltisi içeren bir şişeye daldırın. Çözeltiyi günlük olarak değiştirerek dört gün boyunca rotasyonla inkübe edin. Ardından, kokleayı PBS ile üç kez perfüze edin ve tüm EDTA'yı çıkarmak için değişiklikler arasında 15 dakika daldırın.

Yıkadıktan sonra, kokleayı her konsantrasyonda 30 dakika boyunca artan etanol konsantrasyonlarıyla kurutun. Rotasyonla gece boyunca rodamin B çözeltisine daldırarak tüm kokleayı lekeleyin. Her değişiklik için beş dakika boyunca inkübasyonla% 100 etanolün iki değişikliği ile kokleadan fazla boyayı kokleadan çıkarın.

Lekeli kokleayı her değişimde 30 dakika boyunca iki Spalteholz çözeltisi değişimine aktarın. Döndürme ile temizleme çözeltisinde gece boyunca bırakın. Kokleayı oval ve yuvarlak pencere membran ucundaki bir numune çubuğuna takın.

Temizleme çözeltisinin koklea içinde kaldığından ve kabarcıkların oluşmadığından emin olun. Islak kokleanın oval ve yuvarlak pencere uçlarını UV aktive edici yapıştırıcı kullanarak kuru numune çubuğuna takın. UV tutkalını kokleanın etrafında UV ışığıyla hareket ettirerek 10 saniye boyunca kürleyin.

Kokleayı, Spalteholz çözeltisi ile doldurulmuş optik olarak berrak kuvars florometre hücresinde, X/Z translasyon aşamasına da bağlı olan döner bir tutucuya tutturulmuş numune çubuğu ile görüntüleme odasına askıya alın. Ardından, numuneyi X ekseni ve Z adımlarında ışık tabakası boyunca hareket ettirmek için özel olarak tasarlanmış bir program kullanın ve koklea boyunca 2B görüntülerden oluşan bir yığın oluşturun. Görüntüyü işlemek için, görüntü yığınını başka bir bilgisayara aktarın ve 3B yeniden yapılandırma ve niceleme için bir 3B oluşturma programına yükleyin.

Bir fare kokleasının doğrudan hacim oluşturması, oval ve yuvarlak pencereleri, saç hücrelerine sahip Corti'nin organını, Rosenthal'ın kanalının bölümlere ayrıldığını ve hacminin oluşturulduğunu ve uzunluğu boyunca spiral ganglion nöronlarını veya SGN'leri gösterdiğini gösterdi. TSL kullanılarak, üç aylık genç bir farenin ve 23 aylık bir farenin kokleası görüntülendi ve SGN'ler için sayıldı. SGN hücre sayımları, doğrusal bir grafikte tasvir edilen Rosenthal'ın kanal mesafesinin bir fonksiyonu olarak, kokleanın orta ve apikal uçlarındaki genç hayvanda yaşlı hayvana kıyasla daha fazla SGN gösterdi.

SGN'lerin bu belirgin kaybı, küme analizi ve 3B işleme yazılımı kullanılarak görselleştirildi. SGN yoğunluk farklılıkları, yüksek yoğunluklu kümelerin sarı olduğu ve mavinin düşük yoğunluklu bölgeleri temsil ettiği bir renk ölçeğinde gösterilmiştir. Küme analizi, Rosenthal kanalının uzunluğu boyunca düşük hücre yoğunluğunun bölgelerini açıkça göstermiştir.

Işık tabakası mikroskopisi, yapıların 3D hacim render'larının üretilebileceği iyi hizalanmış bir görüntü yığını üretmek için tasarlanmıştır. 3D render programları, yapıların ve farklı yapılar arasındaki anatomik ilişkilerin nicel olarak değerlendirilmesine izin verir. Bununla birlikte, 3B oluşturma programları birçok farklı kullanıcı parametresi sunduğundan, bu programları etkili bir şekilde kullanmak için önemli bir öğrenme eğrisi vardır.