Name: Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Keşfedin: Işık tabakası mikroskobu ile yaşlanan kokleanın 3D görüntülenmesi. Bu yöntem, spiral ganglion nöron kaybını hasarsız analiz ederek işitme bozukluklarının patolojisini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü, Kellogg Vakfı ve Bridget Sperl ve John McCormick'in özel bağışlarıyla desteklenmiştir. TSLIM, Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg ve Julian Wuester'in Illmenau Teknik Üniversitesi'nden mükemmel yardımlarıyla, akıl hocaları (Stefan Sinzinger ve Rene Theska) ve James Leger'in gözetiminde geliştirilmiştir.

Tüm prosedürler ve canlı hayvanların kullanımı, Minnesota Üniversitesi Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır (Protokol Kimliği #2010-38573A) ve bu hayvanları kullanan araştırmacılar, hayvan tesislerine erişmeden önce Araştırma Hayvan Kaynakları (RAR) Veteriner Hekimleri tarafından kapsamlı bir şekilde eğitilmiş ve test edilmiştir. Bu çalışmada hem erkek hem de dişi fareler kullanılmıştır.
1. Fiksasyon için koklea çıkarılması ve görüntüleme için doku işleme
<ol><li>CO2 inhalasyonunu kullanarak bir fareyi ötenazi yapın. Farenin kafasını makasla kesin ve kafatasını hemiseke etmek için beyinden dorsal-ventral bir kesi yapın. Beyni çıkarın, kafatasının bazo-ventral kısmındaki yuvarlak bullayı tanımlayın, bullayı rongeurlarla açın ve kokleayı görselleştirin ve çıkarın.</li>
	<li>Fiksasyon: Bu prosedürü bir duman başlığı altında ve 5x büyütmede bir diseksiyon mikroskobu kullanarak gerçekleştirin. Eldiven ve koruyucu kıyafet giyin. Oval pencereyi delin ve stapesleri keskin bir seçimle çıkarın. Membranı delmek için yuvarlak pencereye bir çekme yerleştirin.</li>
	<li>Açılan yuvarlak pencereyi, 2 mL formalin ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı bir infüzyon setinin kesilmiş ucuyla örtün. Formalini, kokleanın perilenfatik boşluklarından 2 dakikalık bir süre boyunca yavaşça infüze edin, formalinin kokleandan açılan oval pencereden çıktığını not edin. Fazla dokuyu kokleadan kesin ve% 10 formalin içeren bir şişeye daldırın ve gece boyunca bir rotatöre yerleştirin.</li>
	<li>Dekalsifikasyon: Kokleayı PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3x durulayın ve% 10'luk disodyum etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi içeren bir şişeye 4 gün boyunca rotasyonla daldırın ve çözeltiyi günlük olarak değiştirin.</li>
	<li>Dehidrasyon: Kokleayı PBS 3x ile perfüze edin ve değişiklikler arasında 15 dakika daldırın. Kokleanı% 10,% 50,% 70,% 95,% 95,% 100,% 100 artan etanol konsantrasyonları ile dehidrate edin; her konsantrasyonda 30 dakika boyunca. NOT: EDTA etanolde çökeldiği için dehidrasyondan önce tüm EDTA'yı çıkarmak önemlidir. Ayrıca, kokleae bir gecede %70'ten fazla herhangi bir etanol konsantrasyonunda bırakılabilir.</li>
	<li>Boyama: Rotasyonla bir gecede bir Rhodamine B izotiyosinat çözeltisine (% 100 etanol içinde 5 μg / mL) daldırarak tüm kokleayı lekeleyin. Her değişiklikte 5 dakika olmak üzere iki %100 etanol değişikliği ile kokleadaki fazla boyayı temizleyin.</li>
	<li>Temizleme: Lekeli kokleayı Spalteholz12 çözeltisinin iki değişikliğine (5: 3 metil salisilat: benzil benzoat) aktarın, her değişiklik 30 dakika ve bir gecede temizleme çözeltisinde rotasyonla bırakın. Kokleae süresiz olarak Spalteholz çözeltisinde bırakılabilir.</li>
</ol>2. Kokleaların görüntülenmesi
<ol><li>Kokleae'yi oval ve yuvarlak pencere membranı ucundaki bir numune çubuğuna takın, böylece temizleme çözeltisi koklea içinde kalır ve kabarcıklar oluşmaz (Şekil 2). Koklea içinde kabarcıkların oluşmasına izin verilmemesine özen gösterilmelidir, çünkü çıkarılması zordur ve dokuda bırakılırsa görüntüleme artefaktlarına neden olurlar.</li>
	<li>Islak kokleayı kuru numune çubuğuna bağlamak için UV aktive edici bir yapıştırıcı kullanın (Şekil 2). Kokleayı oval ve yuvarlak pencere uçlarına takın. UV ışığı ile kokleanın etrafında hareket ederek UV yapıştırıcısını 10 saniye boyunca kürleyin. NOT: Kokleanın numune çubuğuna gevşek bir şekilde bağlanması görüntüleme kusurlarına neden olur. Bu çubuk özellikle bu protokol için üretilmiştir (ayrıntılar için Santi ve ark.8'e bakınız) ve ışık tabakası mikroskopumuza özgüdür.</li>
	<li>Kokleayı görüntüleme için Spalteholz çözeltisiyle doldurulmuş görüntüleme odasına askıya alın. Numune odası optik olarak berrak bir kuvars florometre hücresidir (Video 1).</li>
	<li>Numune çubuğunu, XZ çeviri aşamasına da bağlı olan döner bir tutucuya takın. Çoğu yığın, numunenin XZ düzlemlerine çevrilmesiyle elde edilir, ancak rotasyonel yığınlar da elde edilebilir.</li>
	<li>TSLIM optik bölümleme: Florokrom boyama tipine bağlı olarak uyarma için mavi veya yeşil bir lazer kullanın. Işık tabakasını odaklamak için dokunun ortasına yerleştirin ve kokleanın tam genişliğini aydınlatmak için kullanılacak büyütmeyi belirleyin. Ardından, numuneyi ışık tabakası boyunca X eksenindeki numune boyunca (görüntüyü dikerek) ve koklea boyunca 2B görüntü yığını oluşturmak için Z adımlarında hareket ettirmek için özel olarak tasarlanmış bir program kullanın.</li>
	<li>İlk görüntü için, ışık tabakasının ışın beli numunenin kenarına yerleştirilir ve program, veri sütunlarını toplayan numunenin tam genişliğini tarar (bkz. görüntü dikişi; Santi ve ark.8), numunenin genişliği boyunca maksimum çözünürlükte kompozit bir 2D görüntü üretmek için konfokal parametrenin genişliğidir (Şekil 3). Program, örnek tamamen görüntülenene kadar her Z adımı için görüntü dikişini otomatikleştirir.</li>
	<li>Görüntü işleme: Görüntü yığınını başka bir bilgisayara aktarın ve 3B yeniden yapılandırma ve niceleme için bir 3B oluşturma programına yükleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Koklear yapıların incelenmesi için ışık tabakası mikroskobu ile optik kesitleme, diğer geleneksel histolojik yöntemler gibi mekanik olarak yıkıcı değildir ve koklear yapıların birbirine göre tam bir dijital görünümünü sağlar. Corti14 organının yüzey preparatları gibi önceki yöntemler, baziler zarın uzunluğu boyunca saç hücresi kaybının bir haritasını sağladı, ancak doku Corti organını ortaya çıkarmak için diseke edildiğinden SGN kaybı değerlendirilemedi. Alternatif olarak, kokleanın orta modoiler ...

Koklea, memelilerde işitme için periferik duyu organıdır. Ses titreşimlerini tespit etmek ve işitme algısı için beyne iletmek için anatomik olarak uzmanlaşmış tekrarlayan duyusal ve destekleyici hücrelerin karmaşık bir spiral anatomisine sahiptir. Ana duyusal elementler, Rosenthal kanalında bulunan spiral ganglionu oluşturan hücre gövdeleri olan iç ve dış kıl hücreleri ve bunların sinir bozucu sinir lifleridir (Şekil 1). Bu duyusal ve nöral yapılar, yüksek frekanslı seslerin koklear tabanda ve düşük frekanslı seslerin koklea tepe2'de dönüştürüleceği şekilde tonotopik olarak düzenlenmiştir. Destekleyici baziler membranın spiral uzunluğu boyunca bu duyusal hücre dağılımının anatomik bir haritasına sitokokogram3 denir ve bir odyogramda gösterildiği gibi frekansın bir fonksiyonu olarak işitme kaybı ile karşılaştırılabilir.
Yoğun kemikle çevrili kokleanın membranöz labirenti, aynı anda birden fazla koklear yapının incelenmesini teknik olarak zorlaştırır. Bu nedenle, bir ışık tabakası mikroskobu geliştirmenin mantığı, tüm kokleanın iyi hizalanmış seri bölümlerini üretmektir, böylece tüm koklear yapılar 3D rekonstrüksiyonlarda birbirlerine göre incelenebilir. Voie et al.4 ve Voie ve Spelman5 , tüm kokleayı optik olarak bölümlemek için ortogonal düzlem floresan optik kesitleme (OPFOS) mikroskobu adı verilen ilk ışık tabakası mikroskobunu tasarladı. Bununla birlikte, bu mikroskop hiçbir zaman ticari olarak geliştirilmemiştir; Bu nedenle, amacımız ince tabaka lazer görüntüleme mikroskobu (TSLIM; Şekil 2). TSLIM için tasarım ve yapım detayları daha önce yayınlanmış8. TSLIM, görüntü toplama için düşük ışıklı bir dijital kameraya karşı bir CCD kameranın kullanılması, numunenin ışık tabakası boyunca doğru ve tekrarlanabilir hareketi için optik olarak kodlanmış mikro konumlandırıcılar, ticari olarak temin edilebilen, optik olarak berrak bir numune odasının kullanılması ve doku içinde leke çökelmesini önlemek için temizleme çözeltisi yerine etanolde Rodamin boyaması dahil olmak üzere OPFOS üzerinde çeşitli iyileştirmeler yaptı. SPIM6 gibi hafif tabaka mikroskoplarının ticari gelişimi, canlı, küçük şeffaf örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine odaklanmıştır, ancak yeterli çalışma mesafesine sahip olmadıkları için tüm koklear görüntüleme için uygun değildir. Diğer ışık tabakası mikroskoplarının gelişiminin bir incelemesi Santi7 tarafından yayınlandı. TSLIM'in kokleayı incelemek için diğer histolojik yöntemlere göre birincil avantajı, diğer histolojik yöntemlerle kullanılabilmesi için numunenin bütünlüğünü korurken, 3D rekonstrüksiyon için dokuları optik olarak kesitlemektir. TSLIM görüntülemenin bir diğer avantajı, konfokal mikroskopide olduğu gibi lazere tüm doku kalınlığının maruz kalmasıyla karşılaştırıldığında, bir lazer tarafından üretilen sadece ince bir ışık tabakasının dokuya maruz kalmasıdır. Işık saçılımını en aza indirmek için doku temizleme ve dokunun sadece küçük bir kısmının lazere maruz kalması, ışık tabakası lazer görüntüleme ile minimum florokrom solma (fotobeyazlatma) ile sonuçlanır. Bununla birlikte, fiksasyon, dehidrasyon ve temizleme işlemi, koklear yapıların morfolojisini değiştirir ve canlı dokuya kıyasla doku büzülmesine neden olur. Meydana gelen doku büzülmesinin gerçek miktarı belirlenmemiştir.
TSLIM, Shane Johnson ve sekiz Alman optik mühendisliği öğrencisi tarafından geliştirilmiştir (bkz. TSLIM inşaat detayları Santi ve ark.8 ve Schröter ve ark.9 tarafından bir tarama versiyonu (sTSLIM) sağlanmıştır. TSLIM, optik olarak kesit örnekleri için tahribatsız bir mikrotom olarak ve kokleanın tam genişliği ve kalınlığı boyunca 2D seri kesitleri toplamak için bir mikroskop olarak işlev görür. TSLIM hem küçük (mm) hem de büyük (cm), kalın örnekleri görüntüleyebilir. Lensler, diseksiyon mikroskobunda 1x ve 2x toplama hedefleriyle uzun çalışma mesafelerine izin vermek için havaya monte edilir. Diseksiyon mikroskobu ayrıca TSLIM'in hücreler üzerindeki hücre altı ve sinaptik yapıları çözmesine izin veren zoom optiklerine sahiptir. TSLIM, görüntüleme için çeşitli floresan probların kullanılmasına izin veren aydınlatma için hem mavi (473 nm) hem de yeşil (532 nm) lazer ile donatılmıştır. TSLIM'in amacı, koklear dokuların tam bir dijital rekonstrüksiyonu için bütün bir koklea aracılığıyla iyi hizalanmış 2D optik bölümler üretmektir. Bir floresan yöntemi olduğundan, spesifik koklear yapıları tanımlamak için ligandlar ve immünohistokimya da kullanılabilir.
Başlangıçta, iki karşıt Gauss ışık tabakası üretmek için silindirik bir lens kullanıldı, ancak absorpsiyon görüntüleme eserleri üretti. Keller ve ark.10'un çalışmaları nedeniyle, sabit silindirik lens, ışık tabakası9'u üretmek için bir tarama galvanometre aynası ile değiştirildi. Ek olarak, ışık tabakasının merkezi ışın belindeki en ince olduğu için, sTSLIM 2D görüntüler, numunenin genişliği boyunca X ekseni veri sütunlarının bir bileşimi toplanarak üretilir (Şekil 3). Bu yöntem ilk olarak Buytaert ve Dircks11 tarafından tanımlanmıştır. Görüntüleri sürmek ve toplamak için TSLIM özel yazılımı, enstrüman kontrolü için grafiksel bir program kullanılarak geliştirilmiştir. Işık tabakası numune boyunca hareket eder ve doku içindeki bir floresan düzlemi aydınlatır. Bu floresan düzlem, şeffaf numune boyunca ortogonal olarak yansıtılır ve bir diseksiyon mikroskobu ile toplanır. Optik olarak kodlanmış mikro konumlandırıcılar, tek bir kompozit 2D görüntü toplamak için X eksenindeki ışın belinden taramaya izin verir ve daha sonra, Z ekseni mikropozisyoner, seri, kesitli 2D görüntülerin bir yığınını elde etmek için numuneyi doku içinde daha derin bir düzleme taşır (Video 1, Şekil 4). Kokleanın tüm genişliği, kalınlığı ve uzunluğu boyunca bir translasyonel görüntü yığını toplanır ve görüntülerin dikilmesi gerekmez (Video 2). Görüntü yığını başka bir bilgisayara aktarılır ve 3B yeniden yapılandırma ve niceleme için bir 3B oluşturma programına yüklenir. Görüntü yığınları, mikroskop çözünürlüğünde bir kokleanın morfolojisi hakkındaki tüm dijital bilgileri içerir. Bununla birlikte, daha yüksek bir çözünürlük gerekirse, sağlam koklea mikrotom kesitleme, tarama ve transmisyon elektron mikroskobu gibi yıkıcı histolojik yöntemlerle daha fazla işlenebilir.
3B görüntüleme programı, 3B işleme ve kantitatif analiz için farklı koklear yapıları segmentlere ayırmak için kullanılır. Segmentasyon için, yığının her 2B görüntüsündeki her yapı, bir grafik tablet ve kalem tarafından farklı bir renk kullanılarak izlenir (Şekil 5). Bugüne kadar 20 farklı koklear yapı segmentlere ayrılmıştır (Şekil 6). Segmentasyondan sonra çeşitli 3D analizler yapılabilir. Örneğin, 3D render yazılımı, kokleayı yapının merkezi boyunca herhangi bir düzlemde neredeyse rezeksiyon edebilir. Video 3 , baziler zarın uzunluğu boyunca saç hücrelerini ortaya çıkaran Corti organına teğetsel kesitleri göstermektedir. Bu süreç öncelikle ilgilenilen yapının manuel olarak bölümlendirilmesini gerektirir. Daha sonra, yapının merkezcilliği, yapının merkezi boyunca tabanından tepesine kadar yerleştirilen spline noktalarının en küçük karelere uymasına dayanarak hesaplanır ve böylece yapının uzunluğunun yaklaşmasına izin verilir (Video 4). İskeletleşme adı verilen benzer bir işlem, yapının radyal genişliğini uzunluğu boyunca bir renk haritası kullanarak görselleştirmek için kullanılabilir (Video 4). Her yapının toplam hacmi, segmentasyondan sonra program tarafından hesaplanır, ancak göreceli mesafeler de bir 3B oluşturma yazılımında renk haritaları ile ölçülebilir ve görselleştirilebilir (Şekil 7). Segmentli yapılar, büyütülmüş, katı plastik model işlemeleri üretmek için de dışa aktarılabilir (Şekil 8). Ek olarak, yarı otomatik hücre sayımı 3D render yazılımı kullanılarak da gerçekleştirilebilir (Şekil 9). İmmünohistokimya ve ligand bağlanması, spesifik koklear yapıları boyamak için kullanılabilir ve bu yapılar, sitokokoleogram üretmek gibi morfometrik değerlendirme için diğer koklear yapılardan izole edilebilir (Şekil 10). Tüm koklear yapıların uzunluğu, genişliği, yüzeyi, hacmi ve sayısı 3B modellerden belirlenebilir, bu da koklear hasarı fonksiyonel bozukluklara eşlemek için idealdir. Özellikle, yaşlanma, gürültüye bağlı travma veya diğer hakaretlere bağlı koklear hasar, 2D optik bölümlerden 3D koklear rekonstrüksiyonlarda gösterilebilir ve ölçülebilir. Bir koklea sayısallaştırıldıktan sonra, anatomik kayıt defterindeki koklea içindeki herhangi bir dokunun koklear hasarı diğer koklear dokulara göre değerlendirmek için kullanılabilecek çok sayıda görüntüleme algoritması vardır.

<table><tbody><tr><td>Amira 3D Render Yazılımı</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td></td><td>Adres: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>benzil benzoat (W213810)</td> <td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Adres: Posta Kutusu, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Bondic&nbsp;</td><td>Bondic&nbsp;</td><td></td><td>Adres: 235 Industrial Parkway S., Birim 18 Aurora, ON L4G 3V5 Kanada</td></tr><tr><td>Etanol %95 ve %100&nbsp;</td><td>Minnesota</td><td></td> Üniversitesi <td>Adres: Genel Depo, Minneapolis, MN 55455</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA)&nbsp; (E5134)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. &nbsp;</td><td></td><td>Adres: Posta Kutusu, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>LabVIEW grafik programı ve Vision</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Adres: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504</td></tr><tr><td>metil salisilat (M6742)</td> <td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Adres: Posta Kutusu, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Olympus MVX10 diseksiyon mikroskobu</td><td>Olympus Corp</td><td></td><td>Adres: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>Rhodamine B izotiyosinat, (283924)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc. &nbsp;</td><td></td><td>Adres: Posta Kutusu, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Starna Flurometre Hücresi (3-G-20)</td><td>Starna Hücreleri</td><td></td><td>Adres: Posta Kutusu 1919, Atascadero, CA 82423</td></tr></tbody></table>

yaşlanan kokleanın işık tabakası floresan mikroskobu ile görüntülenmesi

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Sağırlık, Dünya Sağlık Örgütü1'e göre dünya çapında yaklaşık% 5 veya 430 milyon insanı etkileyen en yaygın duyusal bozukluktur. Yaşlanma veya presbycusis, sensörinöral işitme kaybının birincil nedenidir ve saç hücrelerine, spiral ganglion nöronlarına (SGN'ler) ve stria vascularis'e verilen hasar ile karakterizedir. Bu yapılar, sıvı içinde asılı duran ve kemikle çevrili membranöz dokuların karmaşık, spiral şekilli bir anatomisine sahip olan kokleanın içinde bulunur. Bu özellikler, histopatolojik değişikliklerin araştırılmasını ve ölçülmesini teknik olarak zorlaştırmaktadır. Bu ihtiyacı karşılamak için, iç kulaktaki yapı-fonksiyon ilişkilerinin incelenmesini kolaylaştırmak için tüm kokleayı görüntüleyebilen ve dijitalleştirebilen bir ışık tabakası mikroskobu (TSLIM) geliştirdik. Tüm kokleanın iyi hizalanmış seri bölümleri, üç boyutlu (3B) hacim oluşturma ve 3B görselleştirme ve nicel analiz (yani uzunluk, genişlik, yüzey, hacim ve sayı) için ayrı ayrı yapıların segmentasyonu için bir görüntü yığını oluşturur. Kokleae, minimum işlem adımlarına (fiksasyon, kireç giderme, dehidrasyon, boyama ve optik temizleme) ihtiyaç duyar ve bunların hepsi tarama ve iletim elektron mikroskobu ile sonraki yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile uyumludur. Tüm dokular yığınlarda bulunduğundan, her yapı ayrı ayrı veya diğer yapılara göre değerlendirilebilir. Ek olarak, görüntüleme floresan problar kullandığından, immünohistokimya ve ligand bağlama, spesifik yapıları ve bunların koklea içindeki 3D hacmini veya dağılımını tanımlamak için kullanılabilir. Burada, saç hücrelerinin ve spiral ganglion nöronlarının kaybını ölçmek için yaşlı farelerden kokleaları incelemek için TSLIM'i kullandık. Ek olarak, Rosenthal kanalındaki spiral ganglion nöronlarının 3D hacmi boyunca lokal olarak azalmalarını görselleştirmek için gelişmiş analizler (örneğin, küme analizi) kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar, TSLIM mikroskopisinin koklea içindeki ve arasındaki yapı-fonksiyon ilişkilerini ölçme yeteneğini göstermektedir.

Bu özel sayının teması kokleade yaşlanmanın etkilerini görüntülemek olduğundan, genç (3 aylık, HS2479, CBA suş faresi) ve yaşlı (23 aylık, HS2521, C57 suşlu fare) koklealar örnek olarak kullanılacaktır. TSLIM'in insanlardan, memelilerden, diğer kemirgenlerden ve balıklardan kokleaların yanı sıra beyin gibi diğer organlardan gelen koklealar da dahil olmak üzere çeşitli örnekleri görüntüleyebildiği belirtilmelidir.
Johnson ve ark. 13 , TML kullanan genç (3 haftalık) CBA f...

Tüm kokleayı görüntülemek ve dijitalleştirmek için bir ışık tabakası mikroskobu geliştirilmiştir.

Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Tüm kokleayı dijitalleştirebilen bir ışık tabakası mikroskobu geliştirdik. Bu mikroskop, küçük fare koklealarını büyük bir insan temporal kemiğine kadar görüntüleyebilen uzun bir çalışma mesafesine sahip havaya monte edilmiş hedeflere sahiptir. Kokleayı herhangi bir mekanik tahribata neden olmadan bir lazer ışını ile seri olarak bölümlere ayırır.Görüntüleme yöntemimiz, yaşlanmaya bağlı olarak saç hücrelerinin ve spiral ganglion nöronlarının kaybı gibi kokleadaki patolojik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bir fareyi ötenazi yaptıktan ve kafasını kestikten sonra, kafatasını hemiseke etmek için beyinden dorsal-ventral bir kesi yapın. Beyni çıkarın ve kafatasının bazoventral kısmındaki yuvarlak bullayı tanımlayın.Bula'yı rongeurs ile açın. Ardından, kokleayı görselleştirin ve çıkarın. Beş kat büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, oval pencereyi delin ve stapesleri keskin bir seçimle çıkarın.Ardından, membranı delmek için yuvarlak pencereye bir çekme yerleştirin. Sabitleme yapmak için, açılan yuvarlak pencereyi, iki mililitre formalin ile doldurulmuş bir mililitrelik bir şırıngaya tutturulmuş bir infüzyon setinin kesilmiş ucuyla örtün. Formalini, iki dakikalık bir süre boyunca kokleanın perilenfatik boşluklarından yavaşça demleyin ve formalinin kokleandan açılan oval pencereden çıkmasını sağlayın.Fazla dokuyu kokleadan kesin. % 10 formalin içeren bir şişeye batırın ve gece boyunca bir rotatöre yerleştirin. Kaleksifikasyon için, kokleayı PBS'de her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın.% 10 EDTA çözeltisi içeren bir şişeye daldırın. Çözeltiyi günlük olarak değiştirerek dört gün boyunca rotasyonla inkübe edin. Ardından, kokleayı PBS ile üç kez perfüze edin ve tüm EDTA'yı çıkarmak için değişiklikler arasında 15 dakika daldırın.Yıkadıktan sonra, kokleayı her konsantrasyonda 30 dakika boyunca artan etanol konsantrasyonlarıyla kurutun. Rotasyonla gece boyunca rodamin B çözeltisine daldırarak tüm kokleayı lekeleyin. Her değişiklik için beş dakika boyunca inkübasyonla% 100 etanolün iki değişikliği ile kokleadan fazla boyayı kokleadan çıkarın.Lekeli kokleayı her değişimde 30 dakika boyunca iki Spalteholz çözeltisi değişimine aktarın. Döndürme ile temizleme çözeltisinde gece boyunca bırakın. Kokleayı oval ve yuvarlak pencere membran ucundaki bir numune çubuğuna takın.Temizleme çözeltisinin koklea içinde kaldığından ve kabarcıkların oluşmadığından emin olun. Islak kokleanın oval ve yuvarlak pencere uçlarını UV aktive edici yapıştırıcı kullanarak kuru numune çubuğuna takın. UV tutkalını kokleanın etrafında UV ışığıyla hareket ettirerek 10 saniye boyunca kürleyin.Kokleayı, Spalteholz çözeltisi ile doldurulmuş optik olarak berrak kuvars florometre hücresinde, X/Z translasyon aşamasına da bağlı olan döner bir tutucuya tutturulmuş numune çubuğu ile görüntüleme odasına askıya alın. Ardından, numuneyi X ekseni ve Z adımlarında ışık tabakası boyunca hareket ettirmek için özel olarak tasarlanmış bir program kullanın ve koklea boyunca 2B görüntülerden oluşan bir yığın oluşturun. Görüntüyü işlemek için, görüntü yığınını başka bir bilgisayara aktarın ve 3B yeniden yapılandırma ve niceleme için bir 3B oluşturma programına yükleyin.Bir fare kokleasının doğrudan hacim oluşturması, oval ve yuvarlak pencereleri, saç hücrelerine sahip Corti'nin organını, Rosenthal'ın kanalının bölümlere ayrıldığını ve hacminin oluşturulduğunu ve uzunluğu boyunca spiral ganglion nöronlarını veya SGN'leri gösterdiğini gösterdi. TSL kullanılarak, üç aylık genç bir farenin ve 23 aylık bir farenin kokleası görüntülendi ve SGN'ler için sayıldı. SGN hücre sayımları, doğrusal bir grafikte tasvir edilen Rosenthal'ın kanal mesafesinin bir fonksiyonu olarak, kokleanın orta ve apikal uçlarındaki genç hayvanda yaşlı hayvana kıyasla daha fazla SGN gösterdi.SGN'lerin bu belirgin kaybı, küme analizi ve 3B işleme yazılımı kullanılarak görselleştirildi. SGN yoğunluk farklılıkları, yüksek yoğunluklu kümelerin sarı olduğu ve mavinin düşük yoğunluklu bölgeleri temsil ettiği bir renk ölçeğinde gösterilmiştir. Küme analizi, Rosenthal kanalının uzunluğu boyunca düşük hücre yoğunluğunun bölgelerini açıkça göstermiştir.Işık tabakası mikroskopisi, yapıların 3D hacim render'larının üretilebileceği iyi hizalanmış bir görüntü yığını üretmek için tasarlanmıştır. 3D render programları, yapıların ve farklı yapılar arasındaki anatomik ilişkilerin nicel olarak değerlendirilmesine izin verir. Bununla birlikte, 3B oluşturma programları birçok farklı kullanıcı parametresi sunduğundan, bu programları etkili bir şekilde kullanmak için önemli bir öğrenme eğrisi vardır.

imaging-the-aging-cochlea-with-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Birincil kirpikler çeşitli sinyal yollarını etkiler. Memeli kokleası, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalini incelemek için idealdir. Kirpikler disfonksiyonu koklear büyümeyi, hücresel paternlenmeyi ve saç hücresi oryantasyonunu, PCP okumalarını etkiler. Amacımız, fare kokleasında PCP sinyalizasyonunu fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etmektir.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Biz üç bozulmamış koklear döner (apeks, orta ve üs) olarak Corti yetişkin organı izole etmek için bir yöntem mevcut. Biz de floresan levhası 'antikorlar ile immün için bir prosedür ortaya koymaktadır. Birlikte bu teknikler kokleadaki bulunan saç hücreleri, destek hücreler ve diğer hücre türleri çalışma sağlar.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

Burada, motor nöron projeksiyon ve transgenik Hb9::GFP fare embriyo axon arborization görüntülenmesi için bir protokol açıklayın. Motor nöronlar için immunostaining sonra hafif levha Floresans mikroskobu Image embriyolar için sonraki kantitatif analiz için kullanılan. Bu iletişim kuralı diğer nöron gezinti süreçlerinde merkezi sinir sistemi için geçerlidir.

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar

Zebra balığı optik netlik, hızlı harici diller, dahil olmak üzere birçok değerli özellikleri ve işitme ve denge için belirli önemini, dışarıdan duyu saç hücreleri bulunan bir modeli sistemidir. Bu makalede nasıl transgenik zebra balığı özetlenmektedir saç hücreli mechanosensation ve presynaptic fonksiyonu toto tahlil için kullanılabilir.

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

Burada, canlı işitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin nano ölçekli görüntülenmesini sağlayan temassız tarama probu tekniği olan Zıplayan Prob İyon İletkenliği Mikroskopisi (HPICM) için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme

Genç erişkin ve yaşlı gerbil kokleae'lerin afferent sinaptik yapıların ve saç hücrelerinin immüno-etiketlenmesi, yaşlı dokudaki otofloresansın söndürülmesi, kokleae'nin uzunluğunun diseksiyonu ve tahmin edilmesi ve konfokal görüntüleme ile elde edilen görüntü yığınlarındaki sinapsların nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Genç Yetişkin ve Yaşlı Gerbil Cochleae'de İmmünoetiketleme ve Şerit Sinapslarının Sayılması

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Burada, gürültüye bağlı işitme kaybının (NIHL) bir fare modeli için bir protokol sunuyoruz. NIHL'yi teşvik etmek için oluklu plastik, bir fare kapanı kafesi ve bir hoparlör kullanarak yeni ve basit bir cihaz geliştirdik. İşitme fonksiyonunu değerlendirmek için sırasıyla işitsel beyin sapı yanıtı ve immünofloresan görüntüleme ve dış tüylü hücre hasarı kullanıldı.

Farelerde Gürültüye Bağlı İşitme Kaybı için Değiştirilmiş Deneysel Koşullar ve İşitme Fonksiyonu ve Dış Tüylü Hücre Hasarının Değerlendirilmesi

Keşfedin: Işık tabakası mikroskobu ile yaşlanan kokleanın 3D görüntülenmesi. Bu yöntem, spiral ganglion nöron kaybını hasarsız analiz ederek işitme bozukluklarının patolojisini anlamaya yardımcı olur.

Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet