Name: Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Öğrenin, bitkilerde protein-protein etkileşimlerini incelemek için AirID tabanlı yakınlık etiketleme yöntemini. Bu teknik, Cucumis sativus modelinde biyotin işaretleme ve afiniti saflaştırma adımlarını içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32000197 - X.H.), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı'ndan Özel Mali Hibe (Hibe No. 2019T120467 - KH) tarafından desteklenmiştir.

1. Bitki materyalinin hazırlanması
<ol><li>Deneysel analiz için Cucumis sativus (Salatalık) kullanılır. Tohumları suya koyun, 50 °C'de 20 dakika inkübe edin ve ardından tohumları 12-16 saat boyunca bir Petri plakası üzerindeki filtre kağıdına koyun.</li>
	<li>Daha sonra, tohumları toprak içeren saksılara aktarın (ticari olarak satın alınır) ve 23 ° C sıcaklıkta ve 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık fotoperiyotta bir iklim odasında büyütün.</li>
	<li>Başarılı bir agroinfiltrasyon için bitkileri 3 veya 4 yaprak aşamasına ulaşana kadar 3-4 hafta iklim odasında tutun.</li>
</ol>2. AirID yapısının yapılması
<ol><li>APRR2'yi hedef protein olarak kullanın ve Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü (p35S: APRR2-AirID) altında APRR2-AirID oluşturun. Bunu, Ağ Geçidi uyumlu ikili vektör pEarleyGate1006'ya (Kansas Eyalet Üniversitesi'nden Dr. Kathrin Schrick tarafından sağlanmıştır) ekleyin ve PL enzimini Ek Dosya 1'de sağlanan diziye göre doğrudan sentezleyin.</li>
</ol>3. Yetkili hücrelerin hazırlanması
<ol><li>DH5α yetkin hücrelerin hazırlanması<ol><li>2 mL LB'yi (10 g/L tripton, 5 g/L maya özütü ve 10 g/L NaCl; pH = 7.0.) E.Coli DH5α hücreleri (çözülmeden doğrudan donmuş stoktan) ile aşılayın ve gece boyunca büyütün (O/N) 37 ° C'de.</li>
		<li>O / N kültüründen% 0.1 -% 0.5 inokulumu 100 mL LB Ortamına taze olarak aşılayın ve OD600 0.4-0.6 arasına ulaşana kadar hücreleri büyütün ve ardından kültürü 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Kültürü iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne alın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 2500 x g'de döndürün.</li>
		<li>Süpernatanı atın, hücreleri 10 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2'de yeniden süspanse edin ve 15 dakika boyunca buzda bekletin. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2500 x g'lık bir dönüşle peletleyin.</li>
		<li>Hücreleri 1 mL buz gibi soğuk 0.1 M CaCl2 +% 20 gliserol, her 1.5 mL tüpe 100 μL alikot içinde yeniden süspanse edin ve hemen -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>GV3101 yetkili hücrelerin hazırlanması<ol><li>2 mL LB (50 μg/mL gentamisin ve 25 μg/mL rifampisin içerir) tek bir GV3101 kolonisi ile aşılayın. 250 rpm'de çalkalarken kültür O/N'sini 28 °C'de inkübe edin.</li>
		<li>200 mL LB'yi 1 mL doymuş gece kültürü ile aşılayın. OD 600 0,5'e eşit olana kadar 28 °C'de inkübe ederken kültürü250 rpm'de çalkalayın.</li>
		<li>Kültürü dört adet önceden soğutulmuş steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 30 dakika buz üzerinde bekletin.</li>
		<li>Hücreleri 2500 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve peletleri buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri 10 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin. Hücreleri önceden soğutulmuş 50 mL'lik bir Oakridge tüpünde bir araya getirin.</li>
		<li>Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve hücreleri 10 mL buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin. 30 dakika buz üzerinde bekletin.</li>
		<li>Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve hücreleri 2 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Hücreleri önceden soğutulmuş steril polipropilen tüplerde 50 μL'lik bir alikot içine dağıtın. Hücreleri -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Agroinfiltrasyon
<ol><li>İlk olarak, plazmiti agrobacterium'a aktarın<ol><li>Adım 2.1'den üretilen plazmitin 2.5 μL'sini agrobacterium tumefaciens GV3101 suşunun yetkili hücrelerine aktarın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>Plazmidi ve yetkin hücreleri içeren tüpü 3 dakika boyunca sıvı nitrojene aktarın.</li>
		<li>Bir inkübatörde 5 dakika boyunca 37 ° C'de ısı şoku ve ardından tüpü 2 dakika boyunca buza koyun.</li>
		<li>Agrobakteriye 1.000 μLof LB ortamı (10 g / L tripton, 5 g / L maya özü ve 10 g / L NaCl; pH = 7.0) ekleyin ve 30 ° C ve 118 rpm'de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>4 °C'de 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Çözeltinin üst 800 μL'sini atın ve kalan çözeltiyi karıştırın. Daha sonra, LB üzerine kaplayın (adım 4.1.4'te belirtildiği gibi, acar ve plazmit için 50 μg/mL Kanamisin ve GV3010 yetkin hücreler için 50 μg/mL gentamisin ve 25 μg/mL rifampisin ile eklenmiştir). Plakaları 30 °C'de 48 saat inkübe edin. NOT: İlgilenilen geni doğrulamak için bazı kolonileri seçmek ve PCR yapmakdaha iyidir 7.</li>
	</ol></li>
	<li>Plakalardan bazı bakteri kolonilerini alın ve bunları LB ortamına ve uygun antibiyotiklere koyun (bkz. adım 4.1.6). 30 °C ve 218 rpm'de 36-48 saat inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri 2 dakika 4 ° C'de 3.000 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri Agroinfiltrasyon tamponunda (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5.6, 250 μM asetosiringon) OD600 = 1.0'a yeniden süspanse edin.</li>
	<li>1 mL iğnesiz bir şırınga kullanarak (abaksiyal) epidermisteki aşıya (adım 4.3'ten üretilen) sızın. NOT: Tüm yaprağın içine sızmak ve çoğaltmayı seçmek daha iyidir. 4-5 bitki için bir yapı kullanın. Her yaprak için 1.5 mL yeniden süspanse edilmiş agrobakteri yeterlidir.</li>
	<li>Bitkileri iklim odasında 36 saat boyunca 16 saat ışık (yaklaşık 75 μmol·m-2·s-1) ve 8 ° C'de 23 saat karanlık fotoperiyot ile koruyun.</li>
	<li>36 saatlik yapı sızmasından sonra, yapının zaten filtrelenmiş yapraklarına 1 mL 5 μM Biotin (10 mM MgCl2 çözeltisi içinde) sızın.</li>
	<li>Yaprak dokusunu hasat etmeden önce işlenmiş bitkileri 4-12 saat daha koruyun. NOT: Önceki çalışmaya göre, hedef protein 36 saatte zirve yapar, bu nedenle 36 hpi biyotin infiltrasyonunuseçin 4,6. Biyotin için inkübasyon süresi hedef çalışmaya bağlıdır, ancak mevcut deneye göre, proteinlerin etiketlenmesi için 8 saatlik bir inkübasyon süresi daha uygundur.</li>
</ol>5. Örneklerin toplanması
NOT: Keratin kontaminasyonunu önlemek için numune toplama için tüm malzemeler steril olmalı ve tüm protokol adımları kontaminasyonsuz bir ortamda gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Sızan yaprakları kesin ve protein bozulmasını önlemek için bunları hızla sıvı nitrojene aktarın.</li>
	<li>İmmünoblot analizleri ile proteinin ön tespitini gerçekleştirin6; bu, Ko-immünopresipitasyondan (Co-IP) önce şiddetle tavsiye edilir.</li>
</ol>6. Yapraktan toplam protein ekstraksiyonu
<ol><li>Yaprakları havanda ve havanda öğütün, hızlıca 2 mL 1x PBS-BSA PH 7.4 ekleyin ve yavaşça öğütün.</li>
	<li>15 mL'lik konik bir tüp alın, konik tüpün üzerine hızlı bir filtrasyon malzemesi filtresi yerleştirin, numune karışımını hızlı filtrasyon malzemesi filtresinden tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Numuneleri 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve% 1 protein inhibitörü kokteyli ekleyin.</li>
	<li>İçeriği 7-8 kez yukarı ve aşağı çevirerek karıştırın ve 1,000 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Numunelerin üst çözücüsünü yeni 2 mL'lik tüplere aktarın,% 10 β-D-maltosit (β-DM) ekleyin ve 5 dakika boyunca buz üzerine koyun. 20.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
</ol>7. Tuzdan arındırma kolonunu dengeleyin
<ol><li>Kolonu 1,000 °C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. NOT: Tüm santrifüj işlemleri sırasında kolonun bir tarafını işaretleyin ve işaretli tarafın dışa baktığından emin olun.</li>
	<li>Kolonun üst ve alt kapağını çıkarın ve 1,000 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Sıvı çözeltiyi kolonun toplama tüpünden atın ve yıkama için 5 mL 1x PBS tamponu ekleyin.</li>
	<li>Kolonu 1,000 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>7.3 ve 7.4 adımlarını en az beş kez tekrarlayın.</li>
</ol>8. Manyetik boncuk yıkama
<ol><li>1.5 mL'lik bir tüp alın ve 50 μL streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuk ekleyin.</li>
	<li>Yıkamak için 1 mL 1x PBS-BSA ekleyin, iyice karıştırın ve 3 dakika boyunca mıknatıs standına koyun. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Adım 8.2'yi en az üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Her yıkamadan sonra, yıkama tamponunu çıkarmak için boncukları tüpün bir tarafına doğru adsorbe etmek için tüpü manyetik rafa yerleştirin.</li>
</ol>9. Biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesi
<ol><li>Kolona 2 mL numune ekleyin ve 4 °C'de 8 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Dengelemek için 50 μL streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklara 1 mL tuzdan arındırılmış protein özü ekleyin.</li>
	<li>Tüpü döndürücüye normal hızda yerleştirin, böylece çözelti iyice karışır ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe eder.</li>
	<li>Süpernatanı nazikçe çıkarmak için boncukları RT'de 3 dakika veya tüpün bir tarafında toplanana kadar manyetik rafa yerleştirin.</li>
	<li>1 mL yıkama tamponu I (suda% 2 SDS) ekleyin, bir döndürücüde 2 dakika boyunca RT'de döndürün ve 9.4 adımını tekrarlayın.</li>
	<li>1 mL yıkama tamponu II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolik asit [a/h] ve %1 Triton X-100) ekledikten sonra tüpü RT'de 2 dakika döndürücüye yerleştirin. Adım 9.4'ü tekrarlayın.</li>
	<li>1 mL yıkama tamponu III (10 mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolik asit [a/h], %1 NP40 [v/v]) ekleyin ve RT'de 2 dakika çalkalayıcı kullanarak döndürün. Ardından, 9.4 adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Deterjanı çıkarmak için 1,7 mL 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) ekleyin ve 9.4 adımını tekrarlayın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Boncukları RT'de 1 mL 50 mM amonyum bikarbonat tamponunda her biri 2 dakika boyunca altı kez yıkayın ve 9.4 adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Boncuklara 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), %12 (a/h) sükroz (Suc), %2 (a/h) lityum lauril sülfat ve %1.5 (a/h) ditiotreitol içeren 50 μL protein özütü ekleyin, inkübatörde 100 °C'de 5 dakika boyunca ısı şoku uygulayın ve 9.4 adımını izleyin. Süpernatanı LC-MS/MS analizi için -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+novel+protein-protein+interactions+in+liver+that+affect+glucagon+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity.</a> PloS One. 10 (6), 0129226(2015).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+identification+of+host+proteins+interacting+with+Theileria+annulata+cysteine+proteinase+%28TaCP%29+by+yeast-two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+agrobacterium-mediated+method+for+transient+gene+expression+and+functional+studies+in+multiple+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Communications%22%5BJournal%5D)">A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species.</a> Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurboID-based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).</li>
<li>Kido, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AirID%2C+a+novel+proximity+biotinylation+enzyme%2C+for+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions.</a> eLife. 9, 54983(2020).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+7-hydroxymethyl+chlorophyll+a+reductase+alleviates+non-programmed+cell+death+during+dark-induced+senescence+in+intact+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants.</a> Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).</li>
<li>Ammiraju, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oryza+bacterial+artificial+chromosome+library+resource%3A+construction+and+analysis+of+12+deep-coverage+large-insert+BAC+libraries+that+represent+the+10+genome+types+of+the+genus+Oryza%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza.</a> Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albino+Leaf+2+is+involved+in+the+splicing+of+chloroplast+group+I+and+II+introns+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+evolutionary+track+of+a+highly+specific+l-Arginine+oxidase+by+reconstruction+and+biochemical+analysis+of+ancestral+and+native+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).</li>
<li>Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li>
<li>Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO-specific+isopeptidase+SENP2+is+targeted+to+intracellular+membranes+via+a+predicted+N-terminal+amphipathic+%CE%B1-helix%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).</li>
<li>Motani, K., Kosako, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+stimulator+of+interferon+genes+%28STING%29+induces+ADAM17-mediated+shedding+of+the+immune+semaphorin+SEMA4D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemişlerdir.

Mevcut deneyde, Kido ve ark. büyük bir genom veri seti ve beş geleneksel BirA enzimi5 kullanarak atalardan kalma enzim rekonstrüksiyonu algoritması aracılığıyla geliştirdi. Rastgele mutasyonlar dinamik dizi değişiklikleri üretemediğinden, geleneksel evrimsel protein mühendisliğindeaktivite 9,10'u geliştirmek için rastgele mutasyonlar kullanıldı. Diğer PL enzimleriyle karşılaştırıldığında, AirID'nin çeşitli avantajları vardır. Daha önce bu ...

Çeşitli hücresel proteinler biyolojik olarak düzenleyici sistem altında çalışır ve protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) bu sistemin bir parçasıdır ve birçok hücresel sürecin temelidir. ÜFE'lerin yanı sıra, doğal proteinlerin işlevi, kompleks oluşumu, ubikitinasyon ve fosforilasyon gibi çeşitli modifikasyonlar yoluyla translasyon sonrası olarak desteklenir. Bu nedenle, ÜFE'leri incelemek, hedef proteinlerin olası işlevini anlamak için önemlidir. PPI'lar, immünopresipitasyon sonrası kütle spektrometrisi analizi (IP-MS analizi)1, maya iki hibrit sistemi (Y2H)2 ve ayrıca hücresiz tabanlı diziler3 gibi çeşitli teknolojiler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemler, araştırma alanındaki çeşitli hayati bulguları araştırdı. Ancak bu yöntemlerin bazı sakıncaları vardır; örneğin, Y2H, hedef türün Y2H kitaplığını oluşturmayı gerektiren zaman alıcı, pahalı bir stratejidir.
Ek olarak, Y2H tekniği, daha yüksek ökaryotik hücrelerin hücresel durumunu doğru bir şekilde yansıtamayan heterolog tek hücreli ökaryotik bir organizma olan mayayı kullanır. IP-MS, yüksek hidrofobikliğe sahip proteinler için uygun değildir ve zayıf ÜFE'leri yakalamada düşük verimlilik gösterir. Bitkilerde nükleotid bağlama alanı ve lösin açısından zengin tekrar içeren (NLR) proteinler ve reseptör benzeri kinazlar (RLK'ler) gibi çeşitli temel proteinler düşük bir seviyede eksprese edilir ve çoğunlukla diğer proteinlerle geçici olarak etkileşime girer; Bu nedenle, bu yöntemlerin kullanılması, bu proteinlerin düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için yetersizdir3.
Yakınlık biyotinilasyonu (PB) adı verilen yeni bir teknik, araştırmacıların ÜFE'leri tanımlamasına yardımcı olur. PB, ilgilenilen proteine (POI) bağlanan PL enzimlerine bağlıdır ve ortak protein POI'ye yaklaştığında, PL, ortak proteine kimyasal bir biyotin etiketi ekler. Ayrıca, etiketli protein tanımlanabilir ve hangi ortak proteinin hedef proteine5 bağlandığını hızlı bir şekilde bilebilir. Önceki çalışmalar, BioID ve TurboID'nin özellikle bitkilerde ÜFE'ler için başarılı araçlar olduğunu kanıtladı, ancak belirli sınırlamaları var4. BioID, ortak proteinleri etiketlemek için yüksek düzeyde biyotine ihtiyaç duyar ve bu da 16 saatten fazla sürer. BioID ile karşılaştırıldığında, TurboID, proteini 10 dakikada etiketlediği ve ortak proteini oda sıcaklığında (RT) etiketleyebildiği için daha faydalıdır. Aynı zamanda belirli koşullarda hücreler için toksiktir ve ilgilenilen protein ile etkileşim göstermeyen proteinleri etiketler.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, Kido ve arkadaşları tarafından geliştirilen AirID, BioID ve AirID5 arasındaki dizi benzerliği% 82 olmasına rağmen, etiketleme enzimlerinin geri kalanından daha verimlidir. AirID'nin verimliliğini kontrol etmek için, bilinen ortaklarla bir POI kullanarak bir deney yaptık. Bu deney, AirID'nin şüphesiz bitki hücrelerindeki ilişkili proteinleri etiketleyebileceğini doğruladı. AirID, in vitro ve hücrelerde ÜFE'leri analiz etmek için değerli bir enzimdir. Daha az toksisite yaratır ve ortak olmayanları etiketlemek için TurboID'den daha az zaman alan işlemlerde daha az hatalıdır ve hücrenin öldürülmesine yol açar. AirID'nin yakınlık biyotinilasyonu için diğer etiketleme enzimlerinden daha rekabetçi olduğunu göstermektedir. Daha doğrudur, zaman alan süreçlerde daha fazla potansiyele sahiptir ve in vitro ve canlı hücrelerde daha az toksiktir. Mevcut protokol, AirID'yi bir PL enzimi olarak kullanarak APRR2'nin etkileşimli proteinlerinin tanımlanmasını açıklar; ayrıca yöntem, bitki türlerinde ÜFE'leri araştırmak için diğer proteinlere de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Asetosiringon</td><td>Pekin solaribo bilim ve teknoloji Co.Ltd</td><td>S1519</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik / Bis% 30 çözelti</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td>1510KA4528</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioFroxx GmbH</td><td>D64683</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>tsingke (Şangay) Co.Ltd</td><td>TSJ001</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G313BA0018</tr><tr><td>Biotin</td><td>BBI yaşam Bilimleri</td><td>G908BA0012</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI yaşam Bilimleri</td><td>E209BA0008</td><td></td></tr><tr><td>Yetkili hücreler GV3101</td><td>Mevcut deneyde</td><td></td><td></td>yapılmıştır</tr><tr><td>Tuzdan arındırma sütunu</td><td>Termo bilimsel</td><td>WC321753</td><td></td></tr><tr><td>Deoksikolik asit</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G818BA0029</tr><tr><td>DH5 & alfa; yetkin hücreler</td><td>Mevcut deneyde</td><td></td> yapılan <td>E.coli DH5 & alpha;</td></tr><tr><td>&beta;-D-maltoside</td><td>Pekin Scolario Bilim ve Teknoloji Co.Ltd</td><td>S818</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td>E104BA0029</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td>161BA0031</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Pekin solaribo bilim ve teknoloji Co.Ltd</td><td>H8090</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td>H209BA0003</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Pekin solaribo bilim ve teknoloji Co.Ltd</td><td>M8019</td><td></td></tr><tr><td>MiraCloth</td><td>EMD Milipore Corp / MERCK kgAa Darmstadt, Germenay</td><td>3429963</td><td>Hızlı filtrasyon malzeme filtresi</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Pekin solaribo bilim ve teknoloji Co.Ltd</td><td>20200819</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd H324BA0003</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td>N8030</td><td></td></tr><tr><td>Protein inhibitörü kokteyli</td><td>Beijing Scolario Bilim ve Teknoloji Co.Ltd</td><td>S3450</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr> 5820172 <tr><td>SDS</td><td>Beijing Scolario Bilim ve Teknoloji Co.Ltd</td><td>S1015</td><td></td></tr><tr><td>Silwet</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-C1-konjuge manyetik boncuklar</td><td>Zenginleştirici Biyoteknoloji</td><td>7E511E1</td><td>Manyetik boncuklar</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Servicebio</td><td>G2056</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td>GB03BA007</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sangon Biotech (Şangay) Co.Ltd</td><td>F828BA0020</td><td></td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Termo bilimsel</td><td>LP0042</td><td></td></tr></tbody></table>

bitkilerde protein-protein etkileşimi için airid tabanlı yakınlık etiketlemesi

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

Memeli hücrelerinde ve bitkilerinde, modifiye askorbat peroksidaz (APEX) veya Escherichia coli biotin ligaz BirA (BioID olarak bilinir) kullanan yakınlık etiketleme (PL) yaklaşımlarının, protein-protein etkileşimlerini (PPI'ler) tanımlamada başarılı olduğu kanıtlanmıştır. BioID'nin revize edilmiş bir versiyonu olan APEX, BioID ve TurboID, değerli teknolojiler olmalarının yanı sıra bazı kısıtlamalara sahiptir. Protein-protein etkileşimlerinde yakınlık tanımlaması için BioID'nin yeni bir versiyonu olan yakın zamanda geliştirilen AirID, bu kısıtlamaların üstesinden geldi. Daha önce, AirID hayvan modellerinde kullanılmışken, mevcut çalışma AirID'nin bitkilerde kullanıldığını göstermektedir ve sonuçlar, AirID'nin bitki sistemlerinde, protein etiketlemesi için BioID ve TurboID gibi diğer PL enzimlerine kıyasla daha iyi performans gösterdiğini doğrulamıştır. İşte model olarak AT4G18020 (APRR2) proteini kullanarak protein etkileşim ortaklarını belirlemek için adım adım bir protokol. Yöntemler, vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla yapının dönüşümünü, biyotin dönüşümünü, proteinlerin ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin zenginleştirilmesini tanımlar. Sonuçlar, AirID'nin bitkilerdeki ÜFE'leri analiz etmek için yeni ve ideal bir enzim olduğu sonucuna varmıştır. Yöntem, bitkilerdeki diğer proteinleri incelemek için uygulanabilir.

Önceki araştırmalara göre, salatalık geni APRR2 , beyaz olgunlaşmamış meyve rengini kontrol eden aday gendir8. Burada, salatalıkta APRR2'nin etkileşimli ortak proteinini bulmak için yakınlık etiketleme enzimi olarak AirID kullanılarak bir protokol geliştirildi. Yapı salatalık yapraklarına aktarıldı ve infiltrasyondan 36 saat sonra biyotin aktarıldı. 48 saat sonra, başarılı dönüşümü doğrulamak için western blot analizi için örnekler alındı. Proteinler, western blot protokolünde yu...

Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

AirID, protein-protein etkileşimi için değerli bir enzimdir ve diğer yakınlık etiketleme enzimlerine göre zaman alan işlemlerde daha az toksisite ve daha az hata yaratır. Model olarak bir APRR2-AirID proteini kullanılarak salatalık veya Cucumis sativus'ta yakınlık etiketleme deneyini gerçekleştirmek için adım adım AT4G18020 protokol sunulmaktadır. Prosedürü laboratuvarımdan Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng ve Min Zhang gösterecek.Cucumis sativus veya salatalık tohumlarını suya aktararak, 50 santigrat derecede 20 dakika inkübe ederek ve ardından tohumları 12 ila 16 saat boyunca bir Petri plakası üzerindeki filtre kağıdına yerleştirerek başlayın. Daha sonra tohumları toprak içeren saksılara aktarın ve üç ila dört hafta boyunca 16 saat aydınlık ve 18 saat karanlık fotoğraf periyodunda 23 santigrat derecede bir iklim odasında büyütün. 2.5 mikrolitre plazmid EarleyGate 100'ü agrobacterium tumefaciens GV3101 suşunun yetkili hücrelerine aktarın.Tüpü üç dakika boyunca sıvı nitrojene aktarmadan önce 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Isı şoku vermek için, tüpü beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübatöre aktarın. Ardından tüpü iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.Isı şoklu agrobacterium hücrelerine 1.000 mikrolitre Luria Bertani veya LB ortamı ekleyin. Hücreleri 30 santigrat derecede ve 118 RPM'de bir saat inkübe ettikten sonra, 3000 G'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüjleyin. Ardından 800 mikrolitrelik süpernatanı atın ve kalan çözeltiyi karıştırın.Her biri mililitre başına 50 mikrogram kanamisin ve gentamisin ve mililitre başına 25 mikrogram rifampisin ile takviye edilmiş LB ortamına yerleştirin. Plakaları 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Plakalardan bazı bakteri kolonileri alın.Bunları uygun antibiyotiklerle desteklenmiş LB sıvı ortamına koyun ve sıvı LB'yi 30 santigrat derece ve 218 RPM'de 36 ila 48 saat inkübe edin. Dört santigrat derecede 3.000 G'de iki dakikalık santrifüjlemeden sonra, optik yoğunluğu 600 nanometre dalga boyunda bir olarak ayarlamak için peleti bir agroinfiltrasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Bir mililitrelik iğnesiz bir şırınga kullanarak, abaksiyal yüzeyin tüm epidermisine 1.5 mililitre resüspanse edilmiş agrobakteriyel inokülum ile sızın.İklim odasındaki bitkileri 23 santigrat derecede tutun ve saniyede metrekare başına 75 mikromol ışık ile 16 saat boyunca karanlık koşullarda sekiz saat 36 saat sonra, bir mililitre beş mikrogram biyotini önceden filtrelenmiş yapraklara sızdırın. Dört ila 12 saatlik biyotin infiltrasyonundan sonra, yaprakları kesin ve protein bozulmasını önlemek için hızla sıvı nitrojene aktarın. Yaprakları bir havaneli ve havan kullanarak öğütün ve hızlı bir şekilde pH 7.4'te iki mililitre PBS BSA ekleyin, ardından yavaş öğütün.Numune karışımını, üzerine yerleştirilmiş hızlı bir filtrasyon malzemesi filtresinden 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü buz üzerinde tutun. Numuneleri iki mililitrelik bir tüpe aktarın. % 1'lik bir protein inhibitörü kokteyli ekleyin ve santrifüjlemeden önce tüpü yedi ila sekiz kez yukarı ve aşağı çevirerek içeriği karıştırın.Bittiğinde, süpernatanı iki mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve% 10 beta-D-maltosid ekleyin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjlemeden önce tüpü beş dakika boyunca buza yerleştirin. Tuz giderme kolonunu dengelemek için, kolonun bir tarafını işaretleyin ve işaretli tarafı dışa bakacak şekilde santrifüjleyin.Kolonun üst ve alt kapağını çıkarın ve dört santigrat derecede iki dakika boyunca 1.000 G'de tekrar santrifüjleyin. Sıvı çözeltiyi kolonun toplama tüpünden atın ve tüpü daha önce gösterildiği gibi santrifüjleme ile en az beş kez beş mililitre PBS tamponu ile yıkayın. 1.5 mililitrelik bir tüpte 50 mikrolitre Streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklara bir mililitre PBS BSA ekleyin ve iyice karıştırın.Boncukları tüpün bir tarafına doğru emmek için tüpü üç dakika boyunca manyetik bir standa yerleştirin. Süpernatanı diğer taraftan atın ve bu PBS BSA yıkamasını üç kez tekrarlayın. Biyotinillenmiş proteini zenginleştirmek için, kolona iki mililitre numune ekleyin.Kolonun dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 1000 G'de santrifüjlenmesinden sonra, 50 mikrolitre Streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklara bir mililitre tuzdan arındırılmış protein özü ekleyin. Manyetik boncuklar içeren tüpü döndürücüye normal hızda ve oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirerek çözeltiyi iyice karıştırın. Ardından, boncukları oda sıcaklığında veya tüpün bir tarafında toplanana kadar üç dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin.Süpernatanı yavaşça çıkarın ve bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Tüpü bir döndürücü üzerinde iki dakika döndürün ve süpernatanı çıkarmak için manyetik rafta gerçekleştirilen adımı tekrarlayın. Benzer şekilde, yıkamaları daha önce gösterildiği gibi bir mililitre yıkama tamponu iki ve üç ile gerçekleştirin.Ardından, 1,7 mililitre 50 milimolar tris hidroklorür ekleyerek ve manyetik rafta gerçekleştirilen adımı tekrarlayarak yıkama tamponlarındaki deterjanı çıkarın. Bir mililitre 50 milimolar amonyum bikarbonat tamponu kullanarak her biri iki dakikalık altı yıkama yapın. Bittiğinde, boncuklara 50 milimolar tris hidroklorür,% 12 sakaroz,% 2 lityum lauril sülfat ve% 1.5 ditiyotreitol içeren 50 mikrolitre protein özü ekleyin ve tüpü inkübatöre 100 santigrat derecede yerleştirin ısı şoku vermek için beş dakika.Adımı manyetik bir rafta tekrarladıktan sonra, LCMS/MS analizi için süpernatanı eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ekstrakte edilen proteinlerin western blot analizi, sızan salatalık yapraklarında başarılı protein ekspresyonu ve biyotinilasyon gösterdi. Kontrole kıyasla etiketli proteinlerin ve ekstra bantların daha yüksek ekspresyon seviyesi, ilgilenilen genin hedef proteinlerinin AirID tarafından başarılı bir şekilde etiketlendiğini doğruladı.Sonuçlar, dönüştürülen tüm örneklerde Anti-Flag antikoru ile hedef bandı gösteren Anti-Flag ve Anti-Mass antikorları kullanılarak doğrulandı. Biyotinillenmiş proteinler Streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklarla zenginleştirildikten sonra, farklı boyutlarda çoklu proteinler gözlendi. Tüm sonuçlardan, AirID'nin bitkilerde protein-protein etkileşimlerini analiz etmek için yeni ve ideal bir enzim olduğu sonucuna varıldı.Yakınlık etiketleme deneyi sırasında, beş mikromolar biyotin ve HR süresinin ideal olduğunu hatırlamak önemlidir. Protokol, yaprak örneğinin hazırlanması, ön biyotinin çıkarılması, ekstrakt proteininin miktarının belirlenmesi ve biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesi dahil olmak üzere tesiste AirID tabanlı yakınlık etiketlemesinin adım adım kurulumunu özetlemektedir. AirID'nin kombinasyon halinde ÜFE'den bağımsız biyotinilasyon doğruluğunu iyileştirmesi bekleniyor.AirID'nin tesislerde ÜFE analizi için ideal olduğu sonucuna varılmıştır.

airid-based-proximity-labeling-for-protein-protein-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma...

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Bu video, nematod hücrelerinde in situ protein-protein etkileşimlerini incelemek için yakınlık ligasyon testini açıklar. İlgilenilen proteinlerin yakınlığı, ikincil bir antikora bağlı bir PLA probu yardımıyla dairesel DNA şablonunu oluşturur. Prob, hücrelerde protein-protein etkileşimlerinin lokalizasyonunu sağlayan uzun tek sarmallı bir DNA ve ardından dedektör probunun hibridizasyonunu üreten amplifikasyon çözeltisi kullanılarak daha da büyütülür.

Yerinde Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Yakınlık Ligasyon Testi

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Böl-BioID, BioID yakınlık etiketleme tekniğine dayalı bir protein parçaları-uluslara tahlil için adım adım bir protokol sağlar. İki verilen protein etkileşimi harekete geçirmek, o kendi yerel hücresel ortamlarında içerik bağımlı protein kompleksleri proteomik analiz sağlar. Yöntemi basit, uygun maliyetli ve yalnızca standart Laboratuar donanımları gerektirir.

Split-BioID — Proteomik analiz onların yerel hücresel ortamında içeriğe özel Protein kompleksleri

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Bu çalışmada, D. melanogaster yumurtalıkta TurboID tabanlı yakınlık etiketlemesi (PL) için, biyotin takviyesi ve yumurtalık diseksiyonundan transgen ekspresyonunun doğrulanmasına ve kütle spektrometresi için biyotinile peptitlerin zenginleştirilmesine kadar olan adımları kapsayan ayrıntılı bir protokol oluşturuyoruz.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketleme Uygulaması

Öğrenin, bitkilerde protein-protein etkileşimlerini incelemek için AirID tabanlı yakınlık etiketleme yöntemini. Bu teknik, Cucumis sativus modelinde biyotin işaretleme ve afiniti saflaştırma adımlarını içerir.

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

Daha fazla video keşfet