Name: Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Öğrenin fare rahiminden 3D endometriyal organoid kurulumu için enzimatik ve mekanik ayrıştırma yöntemlerini. Bu teknik endometriyal sinyal ve yenilenme çalışmalarına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Stephanie Pangas ve Dr. Martin M. Matzuk'a (M.M.M.) makalemizin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Çalışmalar, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü hibeleri R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.), ve R01-HD110038 (M.M.) ve NCI- P30 Kanser Merkezi Destek Hibesi (NCI-CA125123) tarafından desteklenmiştir. Diana Monsivais, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund'dan Yeni Nesil Hamilelik Ödülü'ne sahiptir.

Fare kullanımı ve deneysel çalışmalar, Baylor College of Medicine Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından oluşturulan kılavuzlar kapsamında gerçekleştirilmiştir.
1. Uterus epitelinin enzimatik ve mekanik yöntemler kullanılarak farelerden izole edilmesi
NOT: Bu bölümde, jel matris iskelesi kullanarak farelerden epitelyal endometriyal organoidlerin kurulması, geçişi, dondurulması ve çözülmesi için gereken adımlar açıklanmaktadır. Önceki çalışmalar, fare endometriyal organoidlerinin optimal kültürlerinin, vajinal sürüntü15'in sitolojik incelemesiyle belirlenebilen östrus fazı4 sırasında farelerden kurulduğunu belirlemiştir. Tüm deneyler için yetişkin dişi WT fareleri (6-8 haftalık, hibrid C57BL / 6J ve 129S5 / SvEvBrd) kullanıldı. Fareler, IACUC onaylı kılavuzlara göre, izofluran sedasyonu ve ardından servikal dispartikülasyon kullanılarak insani olarak ötenazi yapıldı. Fareler ötenazi yapıldıktan sonra, aşağıdaki adımlar izlenmelidir. Bu protokolde kullanılan malzemeler ve çözümlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
<ol><li>Jel matrisinin kullanımdan önce yaklaşık 1-2 saat boyunca buz üzerinde çözülmesine izin verin.</li>
	<li>Fareyi diseke etmek için, karın üzerinde orta çizgide bir kesi yapmak için makas kullanın ve altta yatan periton tabakasını ortaya çıkarmak için cildi yavaşça geri soyun. Peritoneal tabakayı tutmak için forseps kullanın ve karın içeriğini ortaya çıkarmak için makasla lateral kesikler yapın.<ol><li>Karın yağ yastıklarını hafifçe bir kenara iterek uterus boynuzlarını bulun. Önce servikal kavşakta tutarak ve mezenterik yağ boyunca kesmek için makas kullanarak onları disseke edin. Fare uterusunun diseksiyonunu takiben, uterus boynuzundan yağ dokusunu küçük makasla iyice çıkarın. NOT: Kullanmadan önce tüm ameliyat aletlerini sterilize ederek hücre izolasyonu sırasında steriliteyi koruyun, fare karnına% 70 etanol püskürtün ve steril bir doku kültürü başlığı altında diseksiyonu takip eden tüm adımları uygulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Her uterus boynuzunu her biri yaklaşık 4-5 mm ölçülen küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Tüm uterus parçalarını bir uterustan 0.5 mL% 1 Tripsin içeren 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Enzimatik çözeltinin uterus lümenine girmesine izin vererek, endometriyal epitelin altta yatan stromadan enzimatik olarak ayrılmasına neden olur.</li>
	<li>24 delikli plakayı 37 °C nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe yaklaşık 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>1 saatlik inkübasyondan sonra, uterus fragmanlarını 1 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu çözeltisini (DPBS) içeren 35 mm'lik bir doku kültürü plakasına aktarın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, uterus epitelini uterus tüpünden mekanik olarak ayırmak için ince forseps ve 1 mL'lik bir pipet kullanın. Forsepslerle uterus parçasının bir ucunu tutarken, pipet ucunu yavaşça parça boyunca uzunlamasına çalıştırın ve epiteli uterus tüpünün diğer ucundan sıkın. Diseksiyon mikroskobu altında uterus fragmanından ayrılmış epitel tabakalarını gözlemleyin.</li>
	<li>Epitel tabakalarını toplamak ve nazikçe 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için 1 mL pipeti kullanın.</li>
	<li>Kalan uterus parçaları için işlemi tekrarlayın, tüm epitel tabakalarını aynı toplama tüpüne aktarın.</li>
	<li>Ayrışmış epitel tabakalarını 375 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile toplayın.</li>
	<li>Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatantı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Hücre peletini 0.5 mL 2.5 mg / mL kollajenaz + 2 mg / mL DNaz çözeltisinde yeniden askıya alın. Pipetleri yaklaşık 10 kat yukarı ve aşağı veya tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar yukarı ve aşağı doğru yapın.</li>
	<li>0.5 mL DMEM / F12 +% 10 fetal sığır serumu (FBS) + antibiyotik ekleyin ve hücreleri 375 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin. NOT: Hücre kültürü için kullanılan geniş spektrumlu antibiyotik hakkında daha fazla bilgi için, Malzeme Tablosuna bakın.</li>
	<li>Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 1 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik içinde yeniden askıya alın. Hücreleri 375 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
</ol>2. Stromal bölmenin işlenmesi
NOT: Bu bölümde, fare endometriyumunun stromal bölmesini izole etmek için gerekli protokoller özetlenmektedir. Epitel / stromal ko-kültür deneylerine artan ilgi göz önüne alındığında, organoidleri üretecek epitel hücrelerine ek olarak stromal hücre popülasyonlarını da işleyebilmek önemlidir.
<ol><li>Tüm epitel uterus fragmanlarından enzimatik ve mekanik olarak ayrıldıktan sonra, kalan tüp benzeri yapılar "stromal / miyometriyel" bölmelerdir. Bu dokuyu HBSS çözeltisinde 2.5 mg / mL kollajenaz + 2 mg / mL DNaz içinde toplayın.</li>
	<li>Stromal / myometriyal numuneyi 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Kuluçkayı takiben, fare başına 500 μL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik ekleyin ve ayrışmamış parçaları 40 μm hücre filtresinden filtreleyin.</li>
	<li>Hücreleri 375 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile toplayın.</li>
	<li>Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 1 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik içinde yeniden askıya alın. Karışımı 10 cm'lik bir hücre kültürü plakasına 10 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotiklere damla damla ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Fare endometriyal epitel ve stromal hücrelerinin ortak kültürlerini oluşturmak için, iskelesiz veya kollajen matriks sistemleri kullanarak insan endometriyal organoidleri için açıklanan yöntemleri izleyin 6,8. NOT: Bu teknikler fareler için henüz yayınlanmamış olsa da, insan endometriyumu ile yayınlanan protokollere dayanarak uyarlanabilirler.</li>
</ol>3. Organoidleri oluşturmak için uterus epitelinin jel matrisine kapsüllenmesi
NOT: Jel matrisini kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
<ol><li>Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini, hücre peletinin 20 katı olan bir jel matrisi hacminde yeniden askıya alın (yani, hücre peleti 20 μL ise, hücreleri 400 μL jel matrisi ile yeniden askıya alın). Kabarcıkların ortaya çıkmasını önlemek için peleti dikkatlice askıya alın.</li>
	<li>Jel matris/hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında ~ 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin.</li>
	<li>Jel matris/hücre süspansiyonu yarı katı bir jel haline geldiğinde, jel matris/hücre süspansiyonunun 25 μL'sini nazikçe aspire etmek için geniş delikli 200 μL uçlu bir P200 mikropipet kullanın. 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğu başına üç ayrı 25 μL kubbe dağıtın ve jel matrisinin 37 ° C nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 15 dakika boyunca sertleşmesine izin verin.</li>
	<li>Jel matrisi kürlendikten sonra, jel matris kubbeleri içeren her bir kuyucuğa 750 μL organoid ortam ekleyin. Nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin. NOT: Organoid ortam formülasyonu Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Organoidler tipik olarak ilk kültürden sonraki 4 gün içinde oluşur.</li>
</ol>4. Östradiol ile tedaviyi takiben endometriyal organoidlerin gen ekspresyon analizi
NOT: Bu bölümde, östradiol ile tedaviyi takiben gerçek zamanlı qPCR kullanarak endometriyal epitel organoidlerinin gen ekspresyonunun profilini çıkarmak için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır (E2; bakınız Tablo 1). Endometriyum, yumurtalık hormonu E2'nin döngüsel kontrolü altında olduğundan, organoidlerin E2'ye duyarlılığını test etmek, fizyolojik fonksiyonun önemli bir ölçüsüdür. Yüksek kaliteli RNA elde ettik ve endometriyal epitel organoidlerimizden qPCR ve / veya RNA dizilimini kullanarak gen ekspresyonunu profillemek için yeterli mRNA ürettik. Bu bölümde, organoidlerin nasıl toplanacağı ve gen ekspresyonunun aşağı akış analizi için nasıl işleneceği açıklanmaktadır. Seçilen tedavi ortamı, kültürlenmiş endometriyal hücreleri tedavi etmek için kullanılanı yansıtır. Bununla birlikte, bu tedavi ortamının, insan endometriyal 3D kültürlerinin 8,16,17 hormonlarıyla tedavisi için yapıldığı gibi, buna göre optimize edilebileceği belirtilmelidir.
<ol><li>Kültür yukarıda tarif edildiği gibi endometriyal organoidler.</li>
	<li>Organoid ortamı çıkarın ve tohumlamadan dört gün sonra 750 μL açlık ortamı ile değiştirin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi sabah, açlık ortamını çıkarın. Araç veya 10 nM E2 içeren 750 μL arıtma ortamı ekleyin. 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kit üreticisinin protokolünü izleyerek RNA izolasyonuna devam edin.</li>
</ol>5. Endometriyal organoidlerin histolojik analizi
NOT: Endometriyal organoidlerin morfolojik özelliklerinin görüntülenmesi, büyüme faktörlerinin, genetik manipülasyonların veya küçük molekül inhibitörlerinin hücresel etkisini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. Bu bölümde histolojik boyalar ve antikor immünofloresan boyama kullanılarak endometriyal epitel organoidlerinin fiksasyonu, işlenmesi ve görüntülenmesi için kullanılan teknikler açıklanmaktadır.
<ol><li>1x PBS'de 1 mL% 4 paraformaldehit içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Onları buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Ortamı, organoidleri içeren 12 delikli plakanın kuyucuklarından aspire edin.</li>
	<li>Kesilmiş uçlu 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak, her bir oyuğa 500 μL% 4 paraformaldehit aktarın ve jel matris kubbelerini plakanın altından yavaşça ayırın.</li>
	<li>Tüm jel matris kubbelerini pipet ucuna nazikçe aspire edin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de bir rotatöre yerleştirerek sabitleyin.</li>
	<li>Ertesi sabah, organoidleri peletlemek için tüpü 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj edin. % 4'lük paraformaldehit çözeltisini bir pipetle nazikçe çıkarın ve atın. Organoidleri% 70 etanol ile 2 kat yıkayın.</li>
	<li>Son yıkamadan sonra, tüpten 50-100 μL etanol hariç hepsini çıkarın. Tüpü bir kenara koyun.</li>
	<li>Jeli eritmek için bir su banyosuna ve mikrodalgaya bir numune işleme jeli tüpü yerleştirin. Jelin kıvamını izleyerek numune işleme jelinin kaynamadığından emin olun. NOT: Numune işleme jeli eritildikten sonra, ancak sıcak kaynatılmadığında, organoidleri kapsüllemek için hızlı bir şekilde çalışın.</li>
	<li>Kalıbın tüm yüzeyini (yaklaşık 250 μL) kaplayacak kadar numune işleme jeli aktarın.</li>
	<li>Numune işleme jeli hala erimiş durumdayken, organoidleri içeren 50 μL% 70 etanol çözeltisini hızlı bir şekilde aktarın. Organoidlerin kalıbın alt kısmına batırıldığından veya itildiğinden emin olun.</li>
	<li>Histoloji kalıbını bir kova buz üzerine yerleştirin ve numune işleme jelinin soğumasını ve katılaşmasını bekleyin.</li>
	<li>Numune işleme jeli tamamen kuruduktan sonra, numune işleme jeli karesini dikkatlice bir numune torbasına aktarın ve organoidlerin bulunduğu düzlemi takip edin.</li>
	<li>Torbayı bir histoloji kasetine yerleştirin ve formalin fiksasyonu ve dokuların parafin gömülmesi için kullanılan standart yöntemleri kullanarak işlemyapın 18.</li>
	<li>Fiksasyon ve parafine gömülmeyi takiben, bir mikrotom19 kullanarak 5 μm kesitlere bölün. Aşağıda belirtildiği gibi standart hematoksilin ve eozin (H & E) boyama veya immün boyama prosedürlerine devam edin.</li>
</ol>6. Hematoksilin ve eozin boyama
<ol><li>Bölümleri aşağıdaki gibi deparaffinize edin: ksilen, 2 x 10 dakika; %100 etanol, 2 x 3 dakika; % 80 etanol, 3 dakika; % 60 etanol, 3 dakika; dH 2 O,2x 3 dakika; Hematoksilinde 1 dakika; musluk suyu (3 x 5 s); Eozin'de 1 dakika.</li>
	<li>Bölümleri aşağıdaki gibi kurutun:% 60 etanol, 3 dakika; % 80 etanol, 3 dakika; % 95 etanol, 3 dakika; %100 etanol, 2 x 3 dakika; ksilen, 2 x 15 dk.</li>
	<li>Montaj ortamı kullanarak monte edin.</li>
</ol>7. İmmünofloresan boyama
<ol><li>Bölümleri adım 6.1'de açıklandığı gibi ayrıştırın.</li>
	<li>Antijen alımı gerçekleştirin<ol><li>Slaytları antijen alma çözeltisine mikrodalgada güvenli bir kaba batırın.</li>
		<li>Mikrodalgayı 20 dakika boyunca yüksek ısıda, çözeltinin kaynamamasını sağlamak için 5 dakikalık aralıklarla kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>20 dakikalık antijen alma adımı tamamlandıktan sonra, slaytların 40 dakika boyunca buz üzerinde soğumasına izin verirken, antijen alma tamponuna batırılmış halde bırakın.</li>
	<li>Slaytları 3 dakika boyunca 1x TBST ile yıkayın</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de% 3 BSA'da inkübe ederek slaytları bloke edin.</li>
	<li>Birincil antikor inkübasyonu<ol><li>TBST'de antikoru% 3 BSA ile seyreltin (Ab'ye bağlı olarak 1:50-1:1,000).</li>
		<li>Nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.</li>
		<li>TBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>İkincil antikor inkübasyonu<ol><li>Antikoru% 3 BSA (TBST'de) (1:250) veya% 5 normal eşek serumunda seyreltin.</li>
		<li>Antikor bir florofora konjuge edildiğinden, karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Nükleer boyama<ol><li>TBST'de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1,000 seyreltin.</li>
		<li>RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>TBST ile 2 x 5 dakika yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaj<ol><li>Kapak kapağını monte etmek için bir damla montaj ortamı kullanın.</li>
		<li>Ertesi gün oje kullanarak kapak kapağını kapatın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Burada, fare endometriyumundan endometriyal epitel organoidleri üretme yöntemlerini ve bunların aşağı akış analizi için rutin olarak kullanılan protokolleri açıklıyoruz. Endometriyal organoidler, endometriozis, endometriyal kanser ve implantasyon başarısızlığı gibi endometriyal ilişkili hastalıkları kontrol eden mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır. 2017 yılında yayınlanan dönüm noktası çalışmaları, fare ve insan epitelinden endometriyal organoidlerin uzun vadeli ve yenilenebilir kültürlerini kültüre<sup class=...

Endometriyum - uterus boşluğunun iç astar mukozal dokusu - bir kadının üreme sağlığında kritik rol oynayan benzersiz ve oldukça dinamik bir dokudur. Üreme ömrü boyunca, endometriyum, yumurtalık hormonlarının - östrojen ve progesteronun uyumlu etkisiyle koordine edilen yüzlerce proliferasyon, farklılaşma ve parçalanma döngüsüne girme potansiyeline sahiptir. Genetiği değiştirilmiş fareler üzerinde yapılan çalışmalar, hormonlara endometriyal yanıtı ve embriyo implantasyonunun, stromal hücre desidualizasyonunun ve gebeliğin kontrolünü destekleyen temel biyolojik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır1. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, geleneksel 2D hücre kültürlerinde transforme edilmemiş primer fare endometriyal dokularının korunmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlandırılmıştır 2,3. 3D organ sistemleri veya organoidler olarak endometriyal dokuların kültüründeki son gelişmeler, endometriyal hücre rejenerasyonunu ve farklılaşmasını kontrol eden biyolojik yolları araştırmak için yeni bir fırsat sunmaktadır. Fare ve insan endometriyal organoid sistemleri, çeşitli matrislerde kapsüllenmiş saf endometriyal epiteldengeliştirilmiştir 4,5, insan endometriyumu ise iskelesiz epitel / stromal ko-kültürler 6,7 ve daha yakın zamanda kollajen kapsüllü epitel / stromal assembloidler8 olarak kültürlenmiştir. . Epitelyal organoid kültürlerin büyüme ve rejeneratif potansiyeli, organoidlerin büyümesini ve rejenerasyonunu en üst düzeye çıkarmak için ampirik olarak belirlenmiş büyüme faktörleri ve küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmış bir kokteyli ile desteklenmektedir 4,5,9. Ayrıca, endometriyal organoidleri dondurma ve çözme yeteneği, endometriyal organoidlerin farelerden ve insanlardan gelecekteki çalışmalar için uzun vadeli bankacılığına izin verir.
Genetiği değiştirilmiş fareler, erken gebelik ve desidualizasyonu kontrol eden karmaşık sinyal yollarını ortaya çıkarmış ve gebelik kaybı, endometriyal kanser ve endometriozis modelleri olarak kullanılmıştır. Bu genetik çalışmalar, özellikle kadın üreme dokularında aktif olan cre rekombinazları kullanılarak loxP yan alellerinin ("floksed") hücreye özgü delesyonuyla büyük ölçüde elde edilmiştir. Bu fare modelleri, endometriyal epitel ve stromal dokularda güçlü rekombinaz aktivitesine sahip olan yaygın olarak kullanılan progesteron reseptörü-cre10'u, yetişkin farelerde endometriyal epitel rekombinasyonunu indükleyen laktoferrin i-cre11'i veya Müllerian türevi dokularda epitelyal spesifik delesyonu tetikleyen Wnt7a-cre'yi içerir12 . Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal dokuların 3D organoidler olarak kültürlenmesi, endometriyal biyolojiyi araştırmak ve endometriyal hücre yenilenmesini ve farklılaşmasını kontrol eden büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için mükemmel bir fırsat sağlamıştır13,14. Literatürde fare endometriyal dokusunun izolasyonu ve kültürü için yöntemler tanımlanmış ve endometriyal epitel organoidlerinin daha sonraki kültürlenmesi için uterus epitelinin izolasyonu için çeşitli enzimatik stratejilerin kullanımı bildirilmiştir4. Önceki literatür endometriyal epitel organoid kültür protokolleri 4,5,6 için eleştirel bir çerçeve sağlarken, bu makale bu organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi, işlenmesi ve analiz edilmesi için açık ve kapsamlı bir yöntem sunmaktadır. Bu tekniklerin standardizasyonu, kadın üreme biyolojisi alanındaki ilerlemeleri hızlandırmak için önemlidir. Burada, bir jel matriks iskelesinde endometriyal organoidlerin sonraki kültürü için fare endometriyal epitel dokusunun enzimatik ve mekanik saflaştırılması için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Ayrıca, jel matriks kapsüllü fare endometriyal epitel organoidlerinin aşağı akış histolojik ve moleküler analizleri için metodolojileri de açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Organoid Medya Formülasyonu< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Şirket< / güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü</td> <td>> < güçlü > nihai konsantrasyon< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran Matrisi, *LDEV içermeyen</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>%100</td></tr><tr><td>Sığır Pankreasından Tripsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>%1</td></tr> <tr><td>Gelişmiş DMEM/F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27 ve ticaret; Takviye (50X), eksi A vitamini</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primosin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 & mikro; g/mL</td></tr><tr><td>N-Asetil-L-sistein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, -7 inhibitörü, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Rekombinant insan EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinant insan Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinant insan Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinant insan FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinant insan HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& D sistemleri</td><td>5036-WN</td><td>200 ng / mL</td></tr> <tr><td>< güçlü > Diğer malzemeler ve reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > İsim< / güçlü > <</td> <td>güçlü > Şirket< güçlü ></td> <td>< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü ></td> <td>< güçlü > nihai konsantrasyon < / güçlü ></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg / Sığır</td></tr><tr><td>pankreasından mL Deoksiribonükleaz</td><td>I Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Polistiren Mikroplakalar (24 Kuyulu)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Polistiren Mikroplakalar (12 Kuyulu)</td><td>Fisher Scientific</td> <td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeçleri, 40 & mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td> <td># 08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Doğrudan-zol RNA MiniPrep (50 & mikro; g)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12, HEPES, fenol içermez</td><td>kırmızı ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Kömür soyulmuş</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td>% <td>2</td></tr> <tr><td>Estratiol (E2)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Formaldehit sulu% 16 çözüm, EM Sınıfı</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>%4</td></tr> <tr><td>Epredia Kaset 1 Oluklu Doku Kasetleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Paslanmaz Çelik Gömme Taban Kalıpları</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 kanıt (% 100)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601 &</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount Montaj Ortamı</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Naylon Biyopsi Torbaları</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Numune İşleme Jeli</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen çözeltisi Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y (sarımsı) çözelti Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS Tampon, 20X, pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>Sitrik asit&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum sitrat tribazik dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>% 3</td></tr> <tr><td>DAPI Çözeltisi (1 mg / mL)</td> <td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>1:1000 seyreltme</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı Vector</td><td>Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Oje</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>VWR Mikro Kapak Camları</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master</td><td>Mix ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 Antikoru (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp;</td><td>1:50 seyreltme</td></tr><tr><td>Vimentin Antobody</td><td>Hücre Sinyali</td><td>5741S</td><td>1:200 seyreltme</td></tr><tr><td>Eşek anti-sıçan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>Eşek anti-Rabbin IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikoru, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 Stereo Mikroskop</td><td>ZEISS ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Vert.A1 dijital kameralı ters çevrilmiş rutin mikroskop</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>güçlü>Primer Sırası</güçlü></td><td>güçlü<güçlü>İleri (5'-3')</güçlü></td><td>güçlü<güçlü>Ters (5'-3')</güçlü></td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>Laktoferrin (Ltf)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCT</td><td>ACCCACTTTTCATCTCGTTC</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron (Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>Gliseraldehit 3 fosfat dehidrojenaz (Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

fare rahiminden 3d endometriyal organoidlerin kurulması

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Endometriyal doku uterusun iç boşluğunu kaplar ve östrojen ve progesteronun döngüsel kontrolü altındadır. Luminal ve glandüler epitel, stromal kompartman, vasküler ağ ve kompleks immün hücre popülasyonundan oluşan bir dokudur. Fare modelleri, endometriyumu incelemek için güçlü bir araç olmuştur ve implantasyonu, plasentasyonu ve kanseri kontrol eden kritik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. 3D endometriyal organoid kültürlerin son zamanlardaki gelişimi, endometriyal biyolojinin altında yatan sinyal yollarını incelemek için son teknoloji ürünü bir model sunmaktadır. Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal organoidler oluşturmak, transkriptomlarını analiz etmek ve morfolojilerini tek hücreli bir çözünürlükte görselleştirmek, endometriyal hastalıkların incelenmesi için çok önemli araçlardır. Bu makale, farelerden endometriyal epitelin 3D kültürlerini oluşturma yöntemlerini özetlemekte ve gen ekspresyonunu ölçmek ve organoidlerin histolojisini analiz etmek için teknikleri açıklamaktadır. Amaç, endometriyal epitel organoidlerinin gen ekspresyonunu ve morfolojik özelliklerini oluşturmak, kültürlemek ve incelemek için kullanılabilecek bir kaynak sağlamaktır.

Fare endometriyal organoidlerinin faz kontrast görüntüleri Ekli protokolde açıklandığı gibi WT fare endometriyal epitelinden organoidler oluşturduk ( Şekil 1'deki şemaya bakınız). Fare endometriyal epitelinin enzimatik ayrışmasını takiben, epitel tabakaları uterus stromal hücrelerinden mekanik olarak ayrıldı ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kollajenaz ile ayrıştı. Doğru yapılırsa, bu epitel ve stromal hücre ayırma yöntemi, karşı hücre tipinin% 10-15'inden da...

Bu protokol, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için fare endometriyal epitel organoidlerini oluşturma metodolojilerini açıklamaktadır.

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Bu protokol, endometriyal organoidlerin kültürü için fare uterusundan oldukça saf uterus epitelini izole etmek için adım adım bir metodoloji gösterdiği için önemlidir. Bu yöntem, uterus epitelini izole etmek için enzimatik ve mekanik ayrışmayı verimli bir şekilde kullanır. Teknikler, izole epitelden türetilen endometriyal epitel organoidlerini oluşturmak, tedavi etmek ve analiz etmek için kolaylaştırılmıştır.Jel matrisini kullanımdan yaklaşık bir ila iki saat önce buz üzerinde çözerek başlayın. Daha sonra makas kullanarak karın üzerinde bir orta hat kesisi yaparak ötenazi fareyi disseke edin ve altta yatan periton tabakasını ortaya çıkarmak için cildi yavaşça geri soyun. Karın yağ pedlerini hafifçe bir kenara iterek uterus boynuzlarını bulun ve mezenterik yağ boyunca kesmeden önce uterus boynuzlarını servikal kavşakta tutun.Fare uterusunun diseksiyonunu takiben, uterus boynuzundan yağ dokusunu küçük makasla iyice çıkarın. Bir kez bittiğinde, her uterus boynuzunu her biri yaklaşık dört ila beş milimetre ölçülen küçük parçalara ayırın. Tüm uterus parçalarını bir uterustan 0.5 mililitre% 1 tripsin içeren 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin.Daha sonra, endometriyal epitelin altta yatan stromadan enzimatik olarak ayrılması için 24 kuyucuk plakasını 37 santigrat derece nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe yaklaşık bir saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, uterus parçalarını bir mililitre Dulbecco'nun fosfat tamponlu çözeltisi veya DPBS içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü plakasına aktarın. Daha sonra, uterus epitelini bir diseksiyon mikroskobu altında uterus tüpünden ayırın, bir uterus parçasının bir ucunu forseps ile tutarak ve pipet ucunu parça boyunca uzunlamasına yavaşça çalıştırarak epiteli uterus tüpünün diğer ucundan sıkın.Daha sonra diseksiyon mikroskobu altında uterus fragmanından ayrılmış epitel tabakalarını gözlemleyin. Daha sonra, bir mililitrelik pipeti kullanarak tüm epitel tabakalarını nazikçe aynı 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Ve ayrışmış epitel tabakalarını beş dakika boyunca 375 x g'de santrifüjleme ile pelet edin.Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini mililitre kollajenaz başına 0.5 mililitre 2.5 miligram artı mililitre DNA çözeltisi başına iki miligram içinde yeniden askıya alın. Pipetleri yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı veya tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar yukarı ve aşağı doğru yapın. Daha sonra, 0.5 mililitre DMEM F / 12 artı% 10 fetal sığır serumu veya FBS artı antibiyotik ekleyin ve hücreleri 375 x g'de beş dakika boyunca santrifüj edin.Süper nantantı çıkarın, hücreleri bir mililitre DMEM / F12 artı% 10 FBS artı antibiyotiklerle yeniden askıya alın ve hücreleri santrifüj edin. Jel matrisini hazır olana kadar buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, süpernatantı santrifüj hücrelerinden çıkarın ve kabarcıkları sokmadan jel matrisinin hacminin 20 katını kullanarak hücre peletini yeniden askıya alın.Jel matris hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Jel matris hücresi süspansiyonu yarı katı bir jel haline geldiğinde, geniş delikli 200 mikrolitre uçlu bir P200 mikropipet kullanın ve jel matris hücresi süspansiyonunun 25 mikrolitresini nazikçe aspire edin. 12 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına üç ayrı 25 mikrolitre kubbe dağıtın ve jel matrisinin 15 dakika boyunca kürlenmesini ve 37 santigrat derece nemlendirilmiş doku kültürü inkübatörünü bırakın.Jel matrisi kürlendikten sonra, jel matris kubbesi içeren her bir kuyucuğa 750 mikrolitre organoid ortam ve nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübatör ekleyin. Fare endometriyal organoidlerinin faz kontrast görüntüleri, epitel ve stromal hücre ayrımının, karşı hücre tipinin% 10 ila% 15'inden fazla kontaminasyonu olmayan örnekler verdiğini göstermiştir. Endometriyal epitel hücreleri üç ila dört gün içinde organoidlere birleştirildi.Kesitli formalin sabit parafin gömülü endometriyal organoidler, tek bir epitel tabakası ve içi boş merkezleri, organoidlerin lümenlerini gösteren hematoksilin ve eozin lekeleri ile görselleştirildi. Floresan mikroskop görüntülemesi, organoidlerdeki tüm hücrelerin Sitokeratin 8-pozitif olduğunu ve DAPI içerdiğini, endometriyal organoidlerin fiksasyonunun, gömülmesinin ve işlenmesinin antikor bazlı immünoboyama ile uyumlu olduğunu göstermiştir. Gerçek zamanlı kantitatif PCR, 10 nanomolar estradiol ile stimülasyonun, epitel organoidlerinde lipokalin 2, laktoferrin ve progesteron reseptörü ekspresyonunu arttırdığını gösterdi ve endometriyal epitel organoidlerinin, östradiol'e yanıt olarak gen ekspresyon değişikliklerini ölçmek için başarıyla kullanılabileceğini gösterdi.Mekanik ayrışma adımı sırasında endometriyal epitelin net bir şekilde ayrılmasını sağlamak önemlidir. Rahim tüpünden çıkan epitel gözlemlenebilmelidir. Diğer yöntemler, epitel organoidlerinin bir jel matrisine kapsüllenerek oluşturulmasını içerir.İstenirse, stromal bölme 3D epitelyal stromal ko-kültürler oluşturmak için daha da sindirilebilir. Yöntem, endometriyumun yenilenmesini kontrol eden sinyallerle ilgili soruları cevaplamaya yardımcı olabilir. Endometriozis, hamilelik kaybı ve kanser gibi kadınlarda hastalığın tedavisine yardımcı olabilir.

establishing-3d-endometrial-organoids-from-the-mouse-uterus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Fare ve sıçanlarda barsak mezenter arter kaskad rahim dokusundaki otomatik nakli endometriozis cerrahi indüksiyon açıklaması.

Uterus Doku Otomatik nakli Cerrahi indüklenen Endometriozis Fare Modeli

Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

Endometriozisin birçok kemirgen modeli teknik karmaşıklık, tekrarlanabilirlik ve / veya bağışıklığı baskılanmış hayvanlara veya özel muhabir farelere ihtiyaç duyma ile sınırlıdır. Bağımsız olarak doğrulanabilir, objektif puanlama sistemine sahip ve ovaerektomi veya sağkalım ameliyatı için gereklilik olmayan herhangi bir deneysel fare kullanarak basitleştirilmiş bir lezyon indüksiyon sistemi sunuyoruz.

Doğal Bisiklet Fareleri Kullanarak Endometriozis Bir Syngeneic Murine Modeli

Bu çalışma, endometriozisin klinik olarak anlamlı bir alt tipi olan endometrioma'yı simüle etmek için özel olarak tasarlanmış yeni bir fare modelini tanıtmaktadır. Model, C57BL / 6J farelerini kullanarak, endometrioma ile ilişkili infertilitenin altında yatan patofizyolojik mekanizmaları aydınlatmayı ve üreme tıbbındaki mevcut bilgi boşluğunu kapatmak için rafine bir araç sunmayı amaçlamaktadır.

Endometrioma ile İlgili İnfertiliteyi İncelemek için Deneysel Bir Fare Modelinin Kurulması

Burada, sıçan endometriyal epitelyal kök hücrelerini (reESC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol sunuyoruz, bu da sıçan endometriyal organoidleri üretiyor. Bu yöntem, endometriyal hastalıkların in vitro çalışmalarını kolaylaştırarak gen düzenlemesini ve diğer hücresel manipülasyonları mümkün kılar.

Sıçan Endometriyal Epitel Kök Hücrelerinden Sıçan Uterus Organoidlerinin Üretimi ve Karakterizasyonu

Bu makale, fare rahmine 1-3 dakika içinde %95 etanol enjekte ederek çok düşük mortalite oranı ve minimal intrauterin adezyonlara sahip güvenilir ve tekrarlanabilir bir ince endometriyum üretmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır.

İnce Endometriyumun Fare Modelinin Oluşturulması

Bu protokol, in vitro ve in vivo olarak yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomu (HGSOC) fare modellerinin geliştirilmesini detaylandırır. Murin fallop tüpü organoidlerinin türetilmesinden, insan HGSOC genetiğini özetlemek için genetik modifikasyonlarından ve in vivo tümörlerin gelişimi için sinjeneik farelerin yumurtalık bursasına sokulmasından.

Yüksek Dereceli Seröz Over Karsinomu Modellemesi için Fallop Tüpü Epitel Hücrelerinden Fare Kaynaklı Organoid Hatların Geliştirilmesi

Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.

Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem

Intravitreal enjeksiyon, göz hastalıkları veya lokal tedavi doğrudan uygulama olarak görsel bilimler araştırma yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu video cam pipet yardımıyla 1 ml şırınga kullanarak intravitreal enjeksiyon için bir protokol gösterdi. Masif kanama ve lens hasarı önlemek konusunda yararlı ipuçları verilmiştir.

Oküler Hastalıkları Model kurulması için intravitreal enjeksiyon

Bu makalede, izolasyon ve bakım, cilt ve akciğer dokusunda yaban kemirgenler birincil fibroblast kültürlerinin için bir protokol tanımlamaktadır.

Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

Öğrenin fare rahiminden 3D endometriyal organoid kurulumu için enzimatik ve mekanik ayrıştırma yöntemlerini. Bu teknik endometriyal sinyal ve yenilenme çalışmalarına olanak tanır.

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Daha fazla video keşfet