Name: Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobu ile Hızlandırılmış Canlı Hücre Görüntüleme için Esnek Bir Oda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntülemesi için esnek bir çevresel oda tasarlama yöntemini. SKOV3 hücrelerinde lipid damlacıklarının dinamiklerini 24 saat boyunca gözlemleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Binghamton Üniversitesi'ndeki 2019 Lisans Kıdemli Tasarım Ekibine (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza ve James Walsh) mikroskop muhafaza kutusunun tasarımı, üretimi ve testi için teşekkür etmek istiyoruz. Binghamton Üniversitesi'nden Scott Hancock, Olga Petrova ve Fabiola Moreno Olivas'a yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından R15GM140444 Ödül Numarası altında desteklenmiştir.

1. Mikroskop çevre muhafazasını inşa edin
NOT: Bu büyük mikroskop çevresel muhafazası, mikroskop gövdesinin sıcaklığını ve 37 ° C'de stabilize edilecek görüntüleme ortamını kontrol etmek için kullanılır (Şekil 1A).
<ol><li>SRS mikroskop çerçevesinin ayaklarının yerlerini ve motorlu sahneyi optik masadaki bir işaretleyici kalem kullanarak işaretleyin. Mikroskobun Galvanometre tarayıcısının önüne iki İris Diyaframı monte edin ve pompanın ve Stokes lazer ışınlarının İris Diyaframlarının ortasından geçmesini sağlamak için ayarlayın.</li>
	<li>Mikroskop çerçevesini ve sahne alanını optik tablodan çıkarın.</li>
	<li>Silikon kauçuk levhayı (boyut: 31 x 29 inç, kalınlık: 1/8 inç) optik tablanın üzerine yerleştirin (Şekil 1B).</li>
	<li>Silikon kauçuğu bir bıçak kullanarak işaretler boyunca kesin, küçük kauçuk parçalarını çıkarın ve kare MICA seramik levhaları (boyut: 6 x 6 inç, kalınlık: 1/4 inç) aynı yerlere yerleştirin. NOT: MICA seramik, işlenmesi kolay bir malzemedir15. Alüminyum kadar serttir ancak mükemmel bir ısı yalıtkanıdır. MICA seramik levhalar, metal mikroskop çerçevesinden ve sahneden paslanmaz çelik optik masaya ısı transferini durdurmak için kullanıldı. Çerçevenin ve sahnenin ayaklarını monte etmek için 1/4-20 vidanın kullanılmasına izin vermek için MICA levhaları üzerinde birkaç geçiş deliği açılmalıdır.</li>
	<li>Mikroskop çerçevesini ve sahneyi optik masaya geri getirin ve ayakları işaretleyici çizgileri boyunca MICA seramik levhalara dikkatlice hizalayın. Çerçeveyi ve sahneyi masaya monte etmek için 1/4-20 vida kullanın.</li>
	<li>SRS optik yolunu yeniden hizalayın. Lazer ışınının önceden monte edilmiş iki İris Diyaframının ortasından geçmesini sağlamak için Ayna 1 ve Ayna 2'nin ayna yuvalarını ayarlayın (Şekil 2). NOT: Mevcut canlı hücre görüntüleme çalışmaları için kullanılan laboratuvar yapımı SRS mikroskobunun teknik detayları daha önceaçıklanmıştır 16. Pompanın ve Stokes kirişlerinin darbe genişliği, cam çubuk dağılımı ile ~ 3-4 ps'dir. Sistem ScanImage17 yazılımı kullanılarak kontrol edilir.</li>
	<li>Bu ısı yalıtım temelinin üzerine, beş parça büyük polikarbonat levha (boyut: 31 x 29 x 28 inç, kalınlık: 0,25 inç) kullanarak tüm mikroskop çerçevesini kaplayacak şekilde çevre muhafazasını monte edin. NOT: Kasa kutusunun boyutu, mikroskop çerçevesinin ve sahne alanının boyutlarına göre belirlenir. Esnek odayı takmak ve hücre kültürü kabını yüklemek için mikroskop muhafaza kutusunun ön panelinin geçici olarak çıkarılması gerekecektir.<ol><li>Muhafazayı monte etmek için, polikarbonat levhaların her bir kenarındaki vida deliklerini kesme, delme ve kılavuz çekme dahil olmak üzere basit işleme işleri yapın. Giriş ve çıkış borusuna uyacak şekilde sırasıyla muhafazanın sağında ve solunda 2,6 inç çapında iki büyük delik açın. Lazer ışınlarının muhafazaya girmesine izin vermek için arka tabakada 5 mm çapında küçük bir delik açın.</li>
	</ol></li>
	<li>Alüminyum folyo bant kullanarak kutunun kenarlarını ve arayüzlerini kapatın.</li>
	<li>Isıtıcı modülü tarafından pompalanan ve kontrol edilen sirkülasyonlu sıcak hava akışına izin vermek için esnek kanal hortumunu muhafaza kutusunun giriş ve çıkış portlarına bağlayın. Isıtıcı modülünün termal sensörünü, hücrelerin kültürlendiği ve görüntülendiği esnek odaya yerleştirin. Hedeflenen sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın. NOT: Çevresel muhafazada daha düzgün bir hava akışı dağılımı elde etmek için bir difüzör kullanılabilir.</li>
</ol>2. Esnek odayı monte edin
<ol><li>İşlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 1'i (malzeme: alüminyum 6061) üç set vida kullanarak hedefin burun parçasına monte edin (Şekil 2).</li>
	<li>İşlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 2'yi dört 1/4-20 vida kullanarak numune tutucuya monte edin (Şekil 2). NOT: Numune tutucu, 50 mm'lik cam tabanlı hücre kültürü kabını tutacak şekilde değiştirilmelidir. 1-7/8 inçlik bir delik testeresi kullanarak numune tutucunun ortasına bir delik açın. 50 mm'lik bir delik testeresi kullanarak deliği karşı delik açın ve geçiş deliğinin derinliğini ~1 mm olarak tutun.</li>
	<li>Numune tutucuyu alüminyum parça 2 ile motorlu aşamaya takın ve vidalar kullanarak monte edin.</li>
	<li>Doğal kauçuk film manşonunu (kalınlık: 0.01 inç; siyanoakrilat yapıştırıcı ile yapıştırılmış) işlenmiş iki alüminyum parça arasına yerleştirin ve her iki ucunda lastik bantlar kullanarak monte edin.</li>
	<li>Sıkıştırılmış CO2 silindirini uygun boru ve konektörleri kullanarak gaz karıştırıcı modülüne bağlayın. CO2 giriş basıncını 20-25 psi'ye ayarlayın. Hava karıştırıcı modülünün %5 CO 2'yi düzenleyebilmesini ve hava akışına karıştırabilmesini sağlamak için dahili bir CO2 sensörü ve bir kontrolör kullanın. Hava akışını temizlemek için hat içi filtreler kullanın.</li>
	<li>Uygun boru ve konektörleri kullanarak, karışık havayı (% 5 CO2 ile) sıcak plakaya yerleştirilen önceden sterilize edilmiş su şişesine yönlendirin ve ardından nemlendirilmiş havayı esnek odaya yönlendirin. Sıcak plakayı 37 °C'ye ayarlayın. Hava akışının nemini artırmak için ılık sudaki hava akışını kabarcıklandırın.</li>
</ol>3. Hızlandırılmış canlı hücre SRS görüntüleme deneylerine hazırlık
<ol><li>Burun parçası, suya daldırma hedefi ve numune tutucu dahil olmak üzere esnek haznenin tüm kısımlarını %70 etanol ile silin.</li>
	<li>Muhafazaya yerleştirilmiş bir UV lambası kullanarak tüm muhafaza sistemini 20 ila 30 dakika boyunca dekontamine edin. NOT: Güvenlik nedeniyle UV dezenfeksiyon işlemi sırasında laboratuvar odasında kalmayın.</li>
	<li>Kültür SKOV3 hücreleri, normal bir inkübatörde normal fizyolojik koşullar altında 12 saat boyunca 50 mm'lik cam tabanlı bir Petri kabında. NOT: SKOV3 hücre kültürü18'i standart bir biyogüvenlik kabininde başlatın.</li>
	<li>Vidaları sökerek işlenmiş alüminyum parça 2'yi numune tutucudan ayırın. NOT: Bu, hücre kültürü kabını yüklemek için esnek odayı açmanın yoludur.</li>
	<li>Hücre kültürü kabını yükleyin. Hücre kültürü kabını yerleştirmeden önce kondenserin üstüne daldırma yağı eklemeyi unutmayın. Çanağın kapağını çıkarın ve kelepçeleri kullanarak çanağı hareketsiz hale getirin. NOT: Kontaminasyonu önlemek için, tüm işlemler eldivenlerle yapılmalıdır.</li>
	<li>Kaba odaklama için hedefi hücre kültürü ortamına indirin. Esnek hazneyi kapatmak için alüminyum parça 2'yi indirin ve vidaları kullanarak numune tutucuya monte edin. NOT: Boşluğu sıkıca kapatmak için alüminyum parça 2'nin tabanına 2 mm'lik bir silikon kauçuk yastık pedi tutturulmuştur.</li>
	<li>Hava beslemesini, 200 cc/dak hava akış hızına sahip normal hücre kültürü için %5 CO2 ve %19O2 ile ayarlar. NOT: Daha düşük bir hava akış hızı kullanılabilir. Esnek odanın ne kadar iyi kapatıldığına bağlıdır.</li>
</ol>4. Hızlandırılmış canlı hücre SRS görüntüleme deneyleri yapın
<ol><li>CH2 kimyasal bağlarının titreşimine atfedilen 2854 cm-1 Raman kaymasını hedeflemek için lazer dalga boyunu 805 nm'ye ayarlayın. Hücrelere verilen fotohasarı azaltmak için düşük lazer gücü kullanın. Bu protokolü takip etmek için, uzun süreli canlı hücre görüntülemesi için pompa lazerinin ~ 15 mW ortalama gücünü ve ~ 7,5 mW Stokes lazerini (1.045 nm'de sabitlenmiş) kullanın. NOT: Daha yüksek lazer gücü, daha iyi SRS görüntüleme kalitesi sağlayacaktır. Bununla birlikte, çok yüksek lazer gücü canlı hücrelere fotohasara neden olacaktır. Görüntü kalitesi ve fotohasar arasında bir denge vardır.</li>
	<li>Yazılımın ANA KONTROLLER panelindeki FOCUS düğmesini kullanarak hücrelerin iyi SRS görüntülemesini elde etmek için hedefi ayarlayın ve odaklayın. Hızlı netleme gerçekleştirmek için YAPILANDIRMA panelinde piksel sayısını 512 × 512 piksel olacak şekilde ayarlayın ve piksel bekleme süresi 4,8 μsn olarak ayarlayın.</li>
	<li>Kilitli amplifikatör giriş aralığını (tipik olarak 5 mV) maksimum sinyal voltajının iki katı olacak şekilde ayarlayın. Düşük geçirgen filtreyi, piksel bekleme süresiyle (4,8 μs) aynı olacak şekilde ayarlayın. NOT: Laboratuvarda oluşturulan farklı SRS sistemleri farklı veri toplama ayarları kullanabilir.</li>
	<li>İyi odaklama elde ettikten sonra, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için görüntüleme çözünürlüğünü 175μm2 görüş alanı için 2.048 × 2.048 piksel olarak ayarlayın. ANA KONTROLLER panelindeki KAYDET işlevini ve KANALLAR panelindeki SRS kanalını kontrol edin. İki kare arasındaki aralık süresini MAIN CONTROLS kanalında 180 s (3 dakika) olarak ayarlayın. 24 saatten uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için edinme sayısını 480 olarak ayarlayın. NOT: Deneylerin amacına bağlı olarak daha düşük bir görüntüleme çözünürlüğü kullanılabilir.</li>
	<li>ANA KONTROLLER panelindeki LOOP işlevini kullanarak otomatik görüntüleme alımını başlatın. NOT: Görüntülemenin ilk saatinde sıcaklık kararsızlığı nedeniyle fokal kayma olup olmadığını kontrol edin. İlk saat görüntüleme stabil olmayabilir. Hızlandırılmış görüntüleme seansı sırasında her 2-3 saatte bir odaklanmayı kontrol edin.</li>
	<li>ImageJ19 kullanarak toplanan görüntüleri işleyin. LD ölçümü için aşağıdaki iki yöntemi kullanın: (i) LD / hücre gövdesi alan oranı ve (ii) toplam LD'lerin ortalama SRS yoğunluğu. SRS görüntülerindeki hücresel olmayan pikselleri 2.854 cm-1'de eşik ve sıfırlayarak hücre gövdesi alanını ölçün. SRS görüntülerindeki LD olmayan pikselleri eşik oluşturup sıfırlayarak LD alanını ve yoğunluğunu ölçün. NOT: SRS görüntü işleme hakkında daha fazla ayrıntı daha önce16 olarak bildirilmişti.</li>
</ol>

<ol><li>Mertz, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMertz%2C+J+%22Introduction+to+Optical+Microscopy%22">Introduction to Optical Microscopy</a>. , Cambridge University Press. (2019).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nature Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li>
<li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).</li>
<li>lamo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dye+labeling+changes+the+biodistribution+of+tumor-targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1004(2020).</li>
<li>Cheng, J. X., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+spectroscopic+imaging+of+living+systems%3A+An+emerging+platform+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine.</a> Science. 350 (6264), aaa870(2015).</li>
<li>Lu, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+DNA+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).</li>
<li>Hill, A. H., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).</li>
<li>Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBu%C4%91a%2C+R+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. (139), Elsevier. 81-101 (2017).</li>
<li>Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+forward+genetic+approach+to+identify+and+isolate+developmental+mutants+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61365(2020).</li>
<li>Lemon, W. C., McDole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+in+the+era+of+too+many+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging in the era of too many microscopes.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).</li>
<li>Birk, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+oral+biofilms+by+nisin+delivery+in+adhesive+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).</li>
<li>Watanabe, I., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+growth+rate+of+cultured+mammalian+cells+%28L5178Y%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y).</a> Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).</li>
<li>Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLac%2C+A+%22Fluorescent+Microscopy%22">Fluorescent Microscopy</a>. , Springer. 57-73 (2022).</li>
<li>Grossman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machinable+glass-ceramics+based+on+tetrasilicic+mica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Ceramic+Society%22%5BJournal%5D)">Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica.</a> Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).</li>
<li>Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+fatty+acid-induced+lipotoxicity+and+its+therapeutic+potential+in+glioblastoma+using+stimulated+Raman+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).</li>
<li>Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+factors+that+influence+the+biocompatibility+of+cationic+liposomes+and+their+ability+to+deliver+DNA+to+the+nuclei+of+ovarian+cancer+SK-OV-3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells.</a> Materials. 14 (2), 416(2021).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Ozeki, Y., Itoh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+microscopy+for+live-cell+imaging+with+high+contrast+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Laser+Physics%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity.</a> Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+live-cell+imaging+of+nucleic+acids+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy.</a> ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).</li>
<li>Stiebing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+Raman+and+SRS+imaging+of+living+human+macrophages+reveals+cell-to-cell+heterogeneity+and+dynamics+of+lipid+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake.</a> Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).</li>
<li>Miao, K., Wei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+quantification+of+PolyQ+aggregates+by+stimulated+Raman+scattering+of+selective+deuterium+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling.</a> ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).</li>
<li>Brzozowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+microscopy+in+chemistry+and+life+science+-Development%2C+innovation%2C+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives.</a> Biotechnology Advances. 60, 108003(2022).</li>
<li>Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+lipid+droplets+in+prostate+cells+using+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+multivariate+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis.</a> Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).</li>
<li>Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+lipid+droplet+biology+with+coherent+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy.</a> Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353(2022).</li>
<li>Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+digital+quantification+of+lipid+droplets+in+single+cells+by+stimulated+Raman+microscopy+on+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform.</a> Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+Raman+scattering+flow+cytometry+for+label-free+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis.</a> Optica. 4 (1), 103-109 (2017).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+chemical+imaging+flow+cytometry+by+high-speed+multicolor+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).</li>
<li>Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Raman+flow+cytometry+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput Raman flow cytometry and beyond.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).</li>
<li>Cole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging%3A+the+cell%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging: the cell's perspective.</a> Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 452-459 (2014).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).</li>
<li>Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+autofocus+methods+for+automated+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Comparison of autofocus methods for automated microscopy.</a> Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).</li>
<li>Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoreciprocity+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanoreciprocity in cell migration.</a> Nature Cell Biology. 20 (1), 8-20 (2018).</li>
<li>Zong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon-enhanced+stimulated+Raman+scattering+microscopy+with+single-molecule+detection+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-multiplex+vibrational+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Super-multiplex vibrational imaging.</a> Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Hızlandırılmış canlı hücreli SRS mikroskopisi, molekül takibi için etiketsiz bir şekilde alternatif bir görüntüleme tekniğidir. Floresan etiketleme ile karşılaştırıldığında, SRS görüntüleme fotobeyazlatma içermez ve moleküllerin uzun süreli izlenmesini sağlar. Bununla birlikte, bugüne kadar, dik SRS mikroskobu üzerindeki canlı hücre görüntüleme sistemi ticari olarak mevcut değildir. Bu çalışmada, iletilen SRS hızlandırılmış görüntülemeyi sağlamak için kararlı bir termal yalıtımlı mikroskop muhafaza kutusu ve esnek bir iç...

Optik mikroskopi, örneklerin mikroyapılarını gözlemlemek için kullanılır. Optik görüntüleme hızlı, daha az invaziv ve diğer teknolojilerden daha az yıkıcıdır1. Optik mikroskopi ile canlı hücre görüntüleme, kültürlenmiş canlı hücrelerin dinamiklerini uzun bir süre boyunca yakalamak için geliştirilmiştir2. Farklı optik kontrast türleri, biyolojik örnekler hakkında farklı bilgiler sağlar. Örneğin, optik faz mikroskobu, örnek3 boyunca kırılma indekslerindeki ince farkı gösterir. Floresan mikroskopi, spesifik biyomolekülleri veya hücresel organelleri görüntülemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, floresanın geniş bant uyarımı ve emisyon spektrumları genellikle çok renkli görüntüleme yapıldığında spektral örtüşmeye neden olur4. Floresan molekülleri ışığa duyarlıdır ve uzun süreli, periyodik ışığa maruz kaldıktan sonra ağartılabilir. Ek olarak, floresan etiketleme, hücrelerdeki moleküllerin biyolojik dağılımını değiştirebilir5. SRS mikroskopisi etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir6. SRS'nin kontrastı, belirli kimyasal bağların titreşimsel geçişine dayanır. Bir kimyasal bağın titreşim frekansı genellikle dar bir spektral bant genişliği sergiler ve bu da aynı örneklerde birden fazla Raman bandının görüntülenmesini mümkün kılar7. SRS mikroskopisi, canlı hücre görüntülemesi için benzersiz bir araçtır ve etiketsiz bir şekilde çoklu kimyasal kontrastlar sağlar8.
Boyanmamış hücrelerin SRS görüntülemesi birçok çalışma için kullanılmış olsa da, canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi yaygın olarak benimsenmemiştir. Bunun bir nedeni, ticari açık odaların 9,10,11,12 kalınlıkları nedeniyle SRS görüntüleme için doğrudan kullanılamamasıdır. Cam kapaklı bu odalar çoğunlukla geriye doğru algılama şemasına sahip tek bir yüksek NA hedefi kullanılarak parlak alan veya floresan görüntüleme için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, SRS görüntüleme, hem yüksek NA hedefi hem de yüksek NA kondenseri kullanılarak iletilen algılamayı tercih eder, bu da amaç ile kondenser arasında sadece çok kısa bir boşluk (tipik olarak birkaç milimetre) bırakır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, dik bir mikroskop çerçevesi kullanarak canlı hücrelerin hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağlamak için yumuşak bir malzeme kullanarak esnek bir oda tasarladık. Bu tasarımda, suya daldırma hedefi yumuşak odaya yerleştirilmiştir ve odaklama ve görüntüleme amacıyla üç boyutta serbestçe hareket edebilir.
Çoğu memeli hücresinin kültürlenmesi için en uygun sıcaklık 37 ° C'dir, oda sıcaklığı ise her zaman bundan 10 ° daha düşüktür. 37 ° C'den yüksek veya daha düşük sıcaklık, hücre büyüme hızı üzerinde dramatik bir etkiye sahiptir13. Bu nedenle canlı hücre görüntüleme sisteminde hücre kültürü ortamının sıcaklık kontrolü gereklidir. Sıcaklık kararsızlığının uzun süreli görüntüleme sırasında bulanıklaştırma sorunlarına yol açacağı bilinmektedir14. Kararlı bir 37 °C ortam elde etmek için, mikroskopun altında bir ısı yalıtım tabakası da dahil olmak üzere tüm mikroskop çerçevesini kaplayacak büyük bir muhafaza odası inşa ettik (Şekil 1). Büyük sıcaklık kontrol odası içindeki küçük esnek oda, %5 CO 2 ile desteklenen düzenlenmiş hava akışı yoluyla fizyolojik nemin ve pH'ın doğru bir şekilde korunmasına yardımcı olur (Şekil 2). Odaların sıcaklığı ve nemi, çift odacıklı tasarımın uzun süreli, periyodik SRS görüntüleme altında hücre büyümesi için en uygun hücre kültürü koşulunu sağladığını doğrulamak için ölçülmüştür (Şekil 3). Daha sonra sistemin SKOV3 kanser hücrelerinde hızlandırılmış görüntüleme ve lipit damlacıklarının (LD'ler) izlenmesi için uygulanmasını gösterdik (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6).

<table><tbody><tr><td><güçlü>Laboratuvar yapımı bir SRS mikroskobu</güçlü></td><td></td><td></td><td>https://rdcu.be/cP6ve</td></tr><tr><td>HF2LI 50 MHz kilitli amplifikatör</td><td>Zürih Aletleri</td><td>HF2LI</td><td></td></tr><tr><td>İris diyaframı</td><td>Thorlabs Inc</td><td>SM1D12</td><td></td></tr><tr><td>Kinematik ayna montajı</td><td>Thorlabs Inc</td><td>KM100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop çerçevesi</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-1</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu mikroskopi aşaması</td><td>Önceki Bilimsel</td><td>Z-Deck</td><td></td></tr><tr><td>Yağa daldırma kondansatörü (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4)</td><td>Nikon Inc</td><td>MBL71405</td><td></td></tr><tr><td>Suya daldırma objektifi (CFI75 Apo 25XC W 1300)</td><td>Nikon Inc</td><td>MRD77225</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Mikroskop muhafazası için malzemeler ve parçalar (31 '' x 29" x 28 '' U x G x Y)</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airtherm ısıtıcı modülü</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>AIRTHERM-SAT-1W</td><td></td></tr><tr><td>Airtherm ısıtıcı kontrol cihazı, CO2 ve nem monitörü</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>AIRTHERM-SMT-1W</td><td></td></tr><tr><td>Hava/CO2 mikser modülü</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>ECU-HOC-W</td><td></td></tr><tr><td>Esnek kanal hortumu (2-1/2'' ID, 2-3/4" OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>56675K71</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek sıcaklık cam-mika seramik, işlemesi kolay (6 inç x 6 inç, 1/4 inç kalınlık)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8489K62</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat levhalar (kalınlık 0,25 inç)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8574K286</td><td></td></tr><tr><td>Silikon kauçuk levhalar (36 '' x 36 '', kalınlık 1/8 '')</td><td>McMaster-Carr</td><td>5827T43</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Esnek hazne için malzemeler ve parçalar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıcak plaka</td><td>McMaster-Carr</td><td>31745K11</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek saflıkta hat içi filtre, 1/4 NPT</td><td>McMaster-Carr</td><td>6645T18</td><td></td></tr><tr><td>Delik testeresi (kesme çapı 1-7/8 inç)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4066A34</td><td></td></tr><tr><td>Delik testeresi (kesme çapı 50 mm)</td><td>McMaster-Carr</td><td>4556A19</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek sıcaklık silikon kauçuk boru, yumuşak, 2 mm ID, 5 mm OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5054K313</td><td></td></tr><tr><td>Sıralı filtre (1/4 NPT, 40 mikron)</td><td>McMaster-Carr</td><td>98385K843</td><td></td></tr><tr><td>Çok Amaçlı 6061 Alüminyum yuvarlak boru (1/8 '' duvar kalınlığı, 4' ' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9056K42</td><td></td></tr><tr><td>Çok Amaçlı 6061 Alüminyum yuvarlak boru (3/4 '' duvar kalınlığı, 3-3 / 4 '' OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>9056K47</td><td></td></tr><tr><td>Çok Amaçlı 6061 Alüminyum çubuk (12 '' x 12 '', kalınlık 1/4 '')</td><td>McMaster-Carr</td><td>8975K142</td><td></td></tr><tr><td>Çok Amaçlı 6061 Alüminyum çubuk (8 '' x 8 '', kalınlık 3/8" ')</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K21</td><td></td></tr><tr><td>Objektif burunluk (tek)</td><td>Nikon Inc</td><td>FN-MN-H</td><td></td></tr><tr><td>Numune tutucu (değiştirilmiş)</td><td>Önceki Bilimsel</td><td>HZ202</td><td></td></tr><tr><td>Ultra ince doğal kauçuk film (kalınlık 0,01 inç)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8611K13</td><td></td></tr><tr><td>Vakumla kapatılabilir cam kavanoz</td><td>McMaster-Carr</td><td>3231T44</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (Fiji)</td><td></td><td>imagej.net</td><td></td></tr><tr><td>ScanImage</td><td>Vidrio Technologies, LLC</td><td></td><td>SRS görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>Canlı hücre görüntüleme malzemeleri</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kapaklı cam tabanlı steril kültür kapları (Dia.x H, 50 x 7 mm)</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri (EMS)</td><td>70674-02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM hücre kültürü ortamı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>LysoSensor floresan boya DND-189</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7535 (Invitrogen)</td><td></td></tr><tr><td>Oleik asit</td><td>MilliporeSigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>SKOV3 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr></tbody></table>

uyarılmış raman saçılma mikroskobu ile hızlandırılmış canlı hücre görüntüleme için esnek bir oda

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir. SRS ile canlı hücre görüntüleme, birçok biyolojik ve biyomedikal uygulama için gösterilmiştir. Bununla birlikte, canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi yaygın olarak benimsenmemiştir. SRS mikroskopisi genellikle yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için yüksek sayısal açıklıklı (NA) suya daldırma hedefi ve yüksek NA yağ daldırma kondenseri kullanır. Bu durumda, amaç ile kondenser arasındaki boşluk sadece birkaç milimetredir. Bu nedenle, çoğu ticari sahne üstü çevre odası, sert bir cam kapaklı büyük kalınlıkları nedeniyle SRS görüntüleme için kullanılamaz. Bu makalede, dik bir mikroskop çerçevesi üzerinde iletilen SRS sinyal tespiti ile hızlandırılmış canlı hücre görüntülemesi için kullanılabilecek esnek bir odanın tasarımı ve üretimi açıklanmaktadır. Odanın esnekliği, yumuşak bir malzeme kullanılarak elde edilir - ince bir doğal kauçuk film. Yeni muhafaza ve bölme tasarımı, mevcut bir SRS görüntüleme kurulumuna kolayca eklenebilir. Test ve ön sonuçlar, esnek oda sisteminin, gelecekte çeşitli biyogörüntüleme uygulamaları için kullanılabilecek canlı hücrelerin kararlı, uzun vadeli, hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağladığını göstermektedir.

Hızlandırılmış SRS görüntüleme için esnek oda sistemini ürettik ve monte ettik (Şekil 1 ve Şekil 2) ve ardından sistemin performansını değerlendirdik. Mikroskop çevre muhafazası içindeki sıcaklık, 1 saat içinde beklenen 37 ° C'ye ulaştı ve bu da oda sıcaklığını önemli ölçüde etkilemedi (Şekil 3A). Esnek odadaki sıcaklık 1,5 saatte 37 ° C'ye ulaştı ve en az 24 saat boyunca 37 ° C'de sabit bir şekilde korundu (Şek...

İletilen sinyal algılamalı dik uyarılmış Raman saçılma mikroskobu kullanılarak canlı hücrelerin hızlandırılmış görüntülenmesi için sahne üstü, esnek bir çevre odası sunuyoruz. Lipid damlacıkları, oleik asit ile muamele edilen SKOV3 hücrelerinde, 3 dakikalık bir zaman aralığıyla 24 saate kadar görüntülendi.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobu ile Hızlandırılmış Canlı Hücre Görüntüleme için Esnek Bir Oda

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Esnek çevre odası tekniği, bir çalışma mikroskobu çerçevesi üzerinde iletilen sinyal algılama ile SRS görüntüleme olarak hızlandırılmış çekim sağlar. SRS mikroskopisi, yüksek sayısal açıklıklı bir hedef ve yüksek uçlu bir kondenser kullandı ve geleneksel bir odanın sığamayacağı yerlerde sadece birkaç milimetre boşluk bıraktı. Esnek bir oda bu sorunu çözer.SRS mikroskobu kullanan araştırmacılar bu tekniği kolayca benimseyebilirler. Esnek oda, numuneyi optimum fizyolojik koşullar altında tutmak için diseksiyon veya steril mikroskopta da kullanılabilir. Başlamak için, SRS mikroskop çerçevesinin ayaklarının yerlerini ve motorlu sahneyi optik masadaki bir işaretleyici kalem kullanarak işaretleyin.Mikroskop çerçevesini ve aşamasını optik masadan çıkardıktan sonra, silikon kauçuk tabakayı masanın üzerine yerleştirin. Silikon kauçuğu bir bıçak kullanarak işaretler boyunca kesin. Küçük kauçuk parçaları çıkarın ve kare mika seramik levhaları aynı yerlere yerleştirin.Ardından mikroskop çerçevesini ve sahneyi optik masaya geri getirin ve ayakları işaretleyici çizgileri boyunca mika seramik tabakalara dikkatlice hizalayın. SRS optik yolunu yeniden hizaladıktan sonra, beş parça büyük polikarbonat levha kullanarak, tüm mikroskop çerçevesini kaplamak için çevresel muhafazayı ısı yalıtım temelinin üzerine monte edin. Alüminyum folyo bant kullanarak kutunun kenarlarını ve arayüzlerini kapatın.Isıtıcı modülü tarafından pompalanan ve kontrol edilen sirkülasyonlu, sıcak hava akışına izin vermek için esnek kanal hortumunu muhafaza kutusunun giriş ve çıkış portlarına bağlayın. İşlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 1'i, üç set vidası kullanarak hedefin burun parçasına monte edin. Daha sonra, işlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 2'yi dört vida kullanarak numune tutucuya monte edin.Alüminyum parça 2'li numune tutucuyu motorlu sahneye takın ve vidalar kullanarak monte edin. Doğal kauçuk film manşonunu işlenmiş iki alüminyum parça arasına yerleştirin ve her iki ucunda lastik bantlar kullanarak monte edin. Sıkıştırılmış CO2 tüpünü uygun boru ve konektörleri kullanarak gaz karıştırıcı modülüne bağlayın.CO2 giriş basıncını 20 ila 25 psi olarak ayarlayın. Hava karıştırıcı modülünün %5 CO2'yi düzenleyebildiğinden ve hava akışına karıştırabildiğinden emin olmak için dahili CO2 sensörünü ve bir kontrolörü kullanın. Hava akışını temizlemek için hat içi filtreler kullanın.Uygun boru ve konektörleri kullanarak, karışık havayı ocak plakasına yerleştirilen önceden sterilize edilmiş su şişesine yönlendirin ve ardından nemlendirilmiş havayı esnek odaya yönlendirin. Ocakçığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Hava akışının nemini artırmak için ılık sudaki hava akışını kabarcıklandırın.Vidaları sökerek makinenin alüminyum parça 2'sini numune tutucudan ayırın. Burun parçası, numune tutucu ve suya daldırma hedefi dahil olmak üzere esnek haznenin tüm parçalarını %70 etanol ile silin. Muhafazaya yerleştirilmiş bir UV lambası kullanarak 20 ila 30 dakika boyunca tüm muhafaza sistemini dekontamine edin.Sonra hücre kültürü kabını yükleyin. Çanağın kapağını çıkarın ve kelepçeleri kullanarak hareketsiz hale getirin. Kaba odaklama için hedefi hücre kültürü ortamına indirin.Esnek hazneyi kapatmak için alüminyum parça 2'yi indirin ve vidaları kullanarak numune tutucuya monte edin. Ardından sensörü takın. Normal hücre kültürü için hava beslemesini% 5 CO2 ve% 19 O2 ile dakikada 200 santimetreküp hava akış hızına ve sıcaklığa 37 santigrat dereceye kadar ayarlayın.CH2 kimyasal bağlarının titreşimine atfedilen 2.854 santimetre ters Raman kaymasını hedeflemek için lazer dalga boyunu 805 nanometreye ayarlayın. Hücrelere verilen fotoğraf hasarını azaltmak için düşük lazer gücü kullanın. Yazılımın ana kontrol panelindeki odak düğmesini kullanarak hücrelerin iyi SRS görüntülemesini elde etmek için hedefi ayarlayın ve odaklayın.Hızlı odaklama gerçekleştirmek için yapılandırma panelinde piksel bekleme süresi 4,8 mikrosaniye olacak şekilde piksel sayısını 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. İyi odaklama elde ettikten sonra, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için görüntüleme çözünürlüğünü 175 mikrometre karelik bir görüş alanı için 2048 x 2048 piksel olarak ayarlayın. Ana kontroller panelindeki kaydet işlevini kontrol edin ve kanallar panelindeki SRS kanalını kontrol edin.İki kare arasındaki aralık süresini ana kontroller kanalında 180 saniye olarak ayarlayın. 24 saat boyunca hızlandırılmış görüntüleme için edinme numarasını 480 olarak ayarlayın. Ana kontrol panelindeki döngü işlevini kullanarak otomatik görüntüleme alımını başlatın.Esnek kamara sisteminin hızlandırılmış SRS görüntüleme için performansı değerlendirildi. Mikroskop çevre muhafazasının içindeki sıcaklık beklenen 37 santigrat dereceye ulaştı ve oda sıcaklığını önemli ölçüde etkilemedi. Esnek odadaki sıcaklık 1,5 saatte 37 santigrat dereceye ulaştı ve en az 24 saat boyunca istikrarlı bir şekilde muhafaza edildi.Esnek odadaki bağıl nem bir saat içinde% 85'e ulaştı ve en az 24 saat boyunca korunabildi. Canlı SKOV3 hücrelerinin hızlandırılmış SRS görüntülemesi, hücre içi lipit damlacıklarının hızlı ve aktif hareketini üç dakikalık bir zamansal çözünürlükle gösterdi. 24 saatlik görüntüleme seansının sonunda, hücreler hala normal morfoloji ve yoğunluk gösterdi ve bu da hücrelerin sağlıklı olduğunu gösterdi.Daha sonra, oleik asit ile tedavi edilen SKOV3 hücreleri görüntülendi ve lipit damlacık birikimi 10 saat boyunca izlendi. Lipid damlacık miktarları, lipid damlacığı / hücre vücut alanı oranı ve lipid damlacıklarının toplam SRS yoğunluğu kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, lipit damlacıklarının miktarının 10 saat boyunca artmaya devam ettiğini göstermektedir.Lipid damlacıklarının eşzamanlı ileri SRS görüntülemesi ve floresan boya DND-189 ile etiketlenmiş lizozomların geriye doğru iki foton floresan görüntülemesi de gösterilmiştir. Lipid damlacıklarının ve lizozomların çok düşük derecede kolokalizasyonu gözlendi. Bu protokolü denerken, fokal sürüklenmenin canlı hücre görüntülemede yaygın bir sorun olduğunu unutmayın.Yaklaşık iki saatlik hızlandırılmış görüntülemeden sonra yeniden odaklama gerekebilir. Geliştirilmesinden sonra, hızlandırılmış SRS görüntüleme, canlı hücrelerde etiketsiz molekülleri veya Raman metni ile etiketlenmiş molekülleri izlemek için çeşitli çalışmalar için kullanılmıştır.

a-flexible-chamber-for-time-lapse-live-cell-imaging-with-stimulated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Zhang, M. ve ark., Tek bir bakteride deuteryum dahil edilmesinin uyarılmış raman saçma görüntülemesi ile hızlı antimikrobiyal duyarlılık testi. J. Vis. Exp. (2022)Bu video, sömürücü etiketli metabolik aktiviteyi takip ederek antibiyotiklere karşı hassasiyeti değerlendirmek için uyarılmış Raman saçılma mikroskobunun uygulanmasını göstermektedir. Karbon–döteryum sinyallerini izleyerek yöntem, dirençli ve hassas bakteri popülasyonlarının hızlı tespitini sağlar.

Uyarılı Raman Saçılma Mikroskobu Kullanılarak Bakteriyel Antibiyotik Duyarlılığının Tespiti

Source: Espinoza, R., et al. Doku teşhisi için fare beyninin gerçek zamanlı, iki renkli uyarılmış Raman saçılma görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2022). Video, fare beyin dokusu bölümlerinin iki renkli uyarılmış Raman saçılması (SRS) görüntülemesini gösterir. İki senkronize lazer ışını, moleküler titreşimleri uyarmak için doku bölümüne yönlendirilir ve bu da ışınlarda nispi bir yoğunluk değişikliğine neden olur. Dokudaki lipitler ve proteinler, lazer ışınlarının farklı frekans çiftleri kullanılarak...

Fare Beyin Dokusunun İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılması Görüntülemesi

Bu makale, dinamik biyolojik süreçleri birden çok renkte optik süper çözünürlükle görüntülemek için toplam iç yansıma floresan aydınlatması (TIRF-SIM) ile çalışan yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobunun montajı ve çalıştırılması için derinlemesine bir kılavuz sağlar.

Çoklu Renkler Yüksek hızında Yapısal Aydınlatma TIRF Mikroskopi A Guide

Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

Bu yazıda, SRS deneysel kurma işleminin lazer tarama mikroskobu ile entegrasyonu ile elde edilen, stimüle edilen Raman saçılma (SRS) mikroskobu uygulaması açıklanmıştır. SRS mikroskobu iki femtosaniye (FS) lazer kaynakları, bir TI-safir (TI: sa) ve senkronize optik parametrik osilör (OPO) dayanmaktadır.

Stimululated Raman saçılma dayalı doğrusal olmayan mikroskop uygulanması

Uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskopisi, spesifik kimyasal moieties'in seçici, etiketsiz görüntülenmesini sağlar ve lipit moleküllerini in vivo olarak görüntülemek için etkili bir şekilde sunulmuştır. Burada, SRS mikroskopi prensibine kısa bir giriş sağlıyoruz ve Caenorhabditis elegans'talipid depolama görüntülemede kullanımı için yöntemleri açıklıyoruz.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyomoleküllerin spesifik kimyasal bağların içsel titreşimine dayanarak etiketsiz görüntülenmesini sağlar. Bu protokolde, canlı farelerin omuriliğindeki hücresel yapıları görselleştirmek için entegre bir SRS ve iki fotonlu floresan mikroskobun enstrümantal kurulumu açıklanmaktadır.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskobu güçlü, tahribatsız ve etiketsiz bir görüntüleme tekniğidir. Ortaya çıkan bir uygulama, protein ve lipit Raman geçişlerinde iki renkli SRS görüntülemenin psödo-hematoksilin ve eozin görüntüleri üretmek için kullanıldığı uyarılmış Raman histolojisidir. Burada, doku teşhisi için gerçek zamanlı, iki renkli SRS görüntüleme için bir protokol gösteriyoruz.

Doku Teşhisi için Fare Beyninin Gerçek Zamanlı, İki Renkli Uyarılmış Raman Saçılma Görüntülemesi

Bu makale, aynı mikroskop platformuna entegre edilmiş uyarılmış Raman saçılmasının (SRS) ve tutarlı anti-Stokes Raman saçılmasının (CARS) çözünürlüğünü, hassasiyetini ve görüntüleme kontrastlarını doğrudan karşılaştırmaktadır. Sonuçlar, CARS'ın daha iyi bir uzamsal çözünürlüğe sahip olduğunu, SRS'nin daha iyi kontrastlar ve spektral çözünürlük sağladığını ve her iki yöntemin de benzer hassasiyete sahip olduğunu göstermektedir.

Kimyasal Görüntüleme için Hiperspektral Uyarılmış Raman Saçılması ve Tutarlı Anti-Stokes Raman Saçılma Mikroskobunun Doğrudan Karşılaştırılması

Geniş bant uyarılmış Raman saçılma (SRS) mikroskobu ile kimyasal görüntüler elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Diferansiyel çok kanallı kilitleme tespiti ile çalışan bir SRS mikroskobuna dayanan protokol, numune hazırlamayı, SRS cihazının ayarlanmasını ve kimyasal olarak heterojen numunelerin farklı bileşenlerini çözmek için kemometriyi açıklar.

Geniş Bant Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobuna Dayalı Multipleks Kimyasal Görüntüleme

Öğrenin, uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile canlı hücrelerin zaman atlamalı görüntülemesi için esnek bir çevresel oda tasarlama yöntemini. SKOV3 hücrelerinde lipid damlacıklarının dinamiklerini 24 saat boyunca gözlemleyin.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskobu ile Hızlandırılmış Canlı Hücre Görüntüleme için Esnek Bir Oda

Daha fazla video keşfet