Uzun Menzilli Fiber Hizalamalı Mikromühendislik 3D Kollajen Hidrojelleri
7 Eylül 2022
Bu protokol, lifleri bir 3D kollajen hidrojel (kalınlığı <250 μm) hizalamak için uzatma gerinim (germe) oluşturmak için sıvı akış yönü boyunca değişen geometriye sahip bir mikroakışkan kanalın kullanımını göstermektedir. Ortaya çıkan hizalama birkaç milimetre boyunca uzanır ve uzatma gerinim hızından etkilenir.
Bu yöntem, vücuttaki sağlıklı ve hastalıklı dokularda bulunan model ortamlarına kontrollü lif hizalama seviyelerine sahip 3D kollajen hidrojelleri tasarlamamızı sağlar. Bu teknik, hizalanmış kollajen hidrojellerini tasarlamak, hücreleri tanıtmak ve hücrelerin topografik olarak tanımlanmış 3D ortamlarda nasıl davrandığını ölçmek için basit bir mikroakışkan yaklaşım sağlar. Prosedürü laboratuvarım için Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly ve Justin Vidas gösterecek.
Başlamak için, 250 mikrometre kalınlığında bir PDMS levhayı plastik bir taşıyıcıya monte edin ve tıraş bıçağı, 0,5 milimetre bıçak derinliğinde, saniyede bir santimetre hızda ve yüksek kuvvette bir zanaat kesici kullanarak mikroakışkan tasarımı kesin. Ultrasonik bir banyo kullanarak, mikroakışkan kanal kesiklerini beş dakika boyunca temizleyin. Sonikasyonlu kanalları deiyonize suda durulayın ve beş dakika boyunca 100 santigrat derecede sıcak bir plaka üzerinde kurutun.
Kanalları kullanana kadar temiz, kapalı bir Petri kabında saklayın. PDMS kapak tabakasını imal etmek ve yüzeyi gelecekteki modifikasyonlar için işlevselleştirmek için, 49 mililitre asetona bir mililitre aminopropil trietoksisilan ekleyerek bir cam beherde% 2'lik bir aminopropil trietoksisilan çözeltisi hazırlayın. Daha sonra,% 25'lik bir glutaraldehit çözeltisini% 5'e seyreltin.
Her 24 milimetre x 50 milimetre kapak kayması için iki mililitre çözelti yapın. IPA kullanarak kapak fişlerini banyo sonikatöründe beş dakika boyunca temizleyin. IPA'yı deiyonize su kullanarak kapak fişlerinden durulayın.
Kapak kayması üzerindeki pürüzsüz bir su filmi, IPA'nın iyice durulandığını gösterir. Kapak kaymalarını sıcak bir plaka üzerinde 100 santigrat derecede beş dakika kurutun. Kurutulmuş kapak fişlerini temiz Petri kaplarına yerleştirin ve üst üste binmemelerini sağlayın.
Bir korona boşaltma değneği kullanarak, kapak kaymalarını her biri bir dakika boyunca bir korona deşarjına maruz bırakın. Korona maruziyetinden sonraki beş dakika içinde kapak fişlerini çıkarın ve her kapak kaymasını 10 saniye boyunca aminopropil trietoksisilan çözeltisine batırın, kapak kaymasının suya batırıldığından emin olun Ardından, kapak kaymalarını aminopropil trietoksisilan çözeltisinden çıkarın, 10 saniye boyunca asetona daldırın ve basınçlı hava ile kurutun. Kuru kapak kaymasını Petri kabına geri yerleştirin, tedavi edilen taraf yukarı bakacak şekilde.
Her kapak kaymasının yüzeyine bir mililitre glutaraldehit çözeltisi pipetin. Çözeltinin kapak kaymasının kenarına dökülmesine izin vermeden mümkün olduğunca fazla yüzeyi örtün. Kapak kaymalarının 30 dakika boyunca çözelti ile temas etmesine izin verin ve ardından 20 saniye boyunca deiyonize suyla durulayın.
Kapak fişlerini basınçlı hava kullanarak kurutun ve plazma ile işlenmiş tarafı yukarı doğru Petri kaplarına geri yerleştirin Modüler manyetik tabanı lazerle kesmek için, geçiş sayısı ve güç gibi uygun lazer ayarlarını kullanarak tasarımları PMMA katmanından kesin. Lazer ayarları, mıknatıslar PMMA katmanına preslenebilecek şekilde ayarlanmalıdır. Lazer kesim işlemindeki kalıntıları gidermek için lazerle kesilmiş kısmı sabun ve su kullanarak yıkayın.
Solvent kullanmayın, çünkü lazerle kesilmiş kenarlarda mikro çatlaklar yayabilirler. Platformu monte etmek için, mıknatısları elle lazer kesim tabanına itin. Mıknatısların kalınlığı, mıknatısların tabanın yüzeyi ile aynı hizada olmasını sağlamak için PMMA tabanının kalınlığından daha az olmalıdır.
Basıncı hassas yapıştırıcıdan veya PSA tabakasından desteği çıkarın ve tabanı, işlevselleştirilmiş tarafı yukarı bakacak şekilde glutaraldehit ile muamele edilmiş bir kapak kaymasına takın. PDMS kanal kesimini çerçeve tarafından tanımlanan boşluğa yavaşça yerleştirin. Hava kabarcıklarını çıkarmak ve konformal temas sağlamak için geniş uçlu cımbızla bastırın.
Sığır serum albüminini veya BSA ile muamele edilmiş kanal kapağını, BSA tarafı aşağı bakacak şekilde kanal kesiğinin üstüne yerleştirin. Sıvı giriş ve çıkış portlarının kanalla aynı hizada olduğundan emin olun. Cihaz kollajen I enjeksiyonu için hazırdır.
Bir biyogüvenlik kabinine bir şırınga pompası, soğutulmuş steril bir şırınga, soğutulmuş nötralize edilmiş kollajen I çözeltisi ve steril bir 20-gauge 90 derece açı uçlu luer kilit iğnesi yerleştirin. Kollajen I solüsyonunu şırıngaya yükleyerek kabarcıklardan kaçının. İğne ucunu şırıngaya takın, şırıngayı şırınga pompasına, iğne aşağı bakacak şekilde yükleyin ve iğneyi kollajen I çözeltisi ile astarlayın.
Şırınga pompasını dakikada 50 ila 2.000 mikrolitre arasında gerekli akış hızına ayarlayın. Hazırlanan PDMS kanallarını bir laboratuvar jakına yerleştirin ve iğne ile düzleştirin. İğneyi PDMS kanalının giriş portuna yerleştirin.
Çıkış tarafında topladığım 30 mikrolitrelik bir kollajen damlasına kadar kanala enjekte edin. Laboratuvar jakını indirin ve iğneyi yeni doldurulan kanaldan yavaşça ayırın. Tüm kanallar kollajen I çözeltisi ile doldurulana kadar tekrarlayın.
Yeni oluşan kollajen I jelinin dehidrasyonunu önlemek için doldurulmuş kanalları Petri kaplarına deiyonize suyla doyurulmuş temiz, tüy bırakmayan bir mendille birlikte yükleyin. Petri kabını örtün ve yüklü kanalları soyma adımından önce iki saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Soyulma ve ortam dengesi için, polimerize kollajen I jelini açığa çıkarmak için cımbız kullanarak PDMS kapağını kaldırarak başlayın.
Kuyuya 650 mikrolitre endotel büyüme ortamı ekleyin. Alternatif olarak, ek bir kollajen tabakası tanıtmak veya ortam perfüzyon yetenekleri sağlamak için başka bir modül takın. Jeli ve ortamı dengelemek için cihazları inkübatörde en az dört saat bırakın.
Hücrelerle tohumlamadan önce ortamı değiştirin. Cam kapağın kaymasını etkinleştiren kanalın kaldırılmasını ve PDMS kapağının BSA ile işlevselleştirilmesi kollajen I yapışmasını önledi. Kollajen I lif hizalaması, kapağı kaldırdıktan sonra etkilenmeden kaldı.
Matrisin hizalanmış segmentinde kültürlenen HUVEC'lerin görüntüleri, rastgele liflere sahip segmentteki HUVEC'lere kıyasla artmış aktin lifi hizalaması gösterdi. Yaklaşımımız, tümör mikro ortamını modellememize ve farklı hücre tiplerinin nasıl tepki verdiğini ölçmemize olanak tanır. Uzun vadeli deneyleri desteklemek için akış kanallarını da tanıtabiliriz.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kontrollü lif hizalaması ile 3D kollajen hidrojellerin mühendisliği için bir mikroakışkan yöntemi gösterir. Teknik, sağlıklı ve hastalıklı dokularda bulunan ortamların modellenmesini sağlayarak, tanımlanmış 3D alanlarda hücre davranışı üzerinde etki eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyomalzemeler
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- Kollajen hidrojeller doku mühendisliğinde yaygın olarak kullanılır.
- Hidrojellerdeki lif hizalaması, hücresel tepkileri etkileyebilir.
- Mikroakışkan teknikler, hidrojel özellikleri üzerinde hassas kontrol sağlar.
- Bu çalışma, lif hizalaması üzerindeki uzama gerilmesinin etkilerini araştırır.
Kullanılan Yöntemler
- Bir taşıyıcı üzerine PDMS tabakasının monte edilmesi ve mikroakışkan tasarımının kesilmesi.
- Ultrasonik banyoda mikroakışkan kanal kesimlerinin temizlenmesi.
- Hidrojel oluşumu için kanalların durulama ve kurutma işlemi.
- Analizler için hizalanmış kollajen hidrojellerine hücrelerin sokulması.
Ana Sonuçlar
- Hizalanmış kollajen hidrojellerin başarılı üretimi.
- Hizalama birkaç milimetre boyunca uzanır.
- Hücre davranışı, hidrojellerin topografik özelliklerinden etkilenir.
- Yöntem, doku modelleme için basit bir yaklaşım sağlar.
Sonuçlar
- Mikroakışkan yöntem, kollajen hidrojellerdeki lifleri etkili bir şekilde hizalayır.
- Bu teknik, mühendislik yapılan dokulardaki hücresel tepkileri incelemek için kullanılabilir.
- Gelecek uygulamaları, çeşitli doku tiplerinin modellenmesini içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Microengineered 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment enable precise modeling of structured tissue microenvironments for early discovery and translational research. This platform supports predictive confidence in cell-matrix interaction studies, de-risking target validation and phenotypic screening in oncology, regenerative medicine, and tissue engineering portfolios. The ability to control fiber alignment and matrix architecture in 3D culture systems advances the fidelity of disease-relevant models and informs risk-adjusted R&D decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell behavior in physiologically relevant, aligned 3D matrices.
- Supports mechanistic de-risking by modeling healthy and diseased tissue architectures.
- Facilitates functional target validation through controlled microenvironmental cues.
- Improves predictive confidence for downstream phenotypic screening.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible 3D matrices for quantitative cell response assays.
- Enables preparation of aligned collagen systems for high-content screening workflows.
- Supports assay scalability and platform reuse across multiple cell types and conditions.
- Delivers robust, quantifiable outputs for compound evaluation in structured environments.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant tissue microenvironments for translational biomarker studies.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining matrix architecture.
- Reduces biological ambiguity in preclinical model selection and validation.
- Aligns with risk-adjusted advancement decisions for tissue-targeted therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic studies in 3D systems.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of cell-matrix interactions and pathway clarification in aligned 3D environments.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible matrices with quantifiable alignment for comparative studies.
- Analytics: Supports quantitative measurement of cell morphology, motility, and alignment in response to defined matrix cues.
- Translational Research: Facilitates modeling of tumor, cardiac, and musculoskeletal microenvironments for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for repeated use across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-matrix studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible 3D culture systems for cross-team adoption.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling high-fidelity tissue modeling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of tissue-targeted discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, biomaterials, and 3D cell culture techniques.
- Needs access to microfabrication tools, imaging systems, and analytical infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible matrix preparation and analysis.
- Adaptable to various cell types and tissue models with protocol optimization.
- Matrix thickness and alignment range may limit application to specific tissue models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:38
Fabrication of the Two-Piece Channel and Modular Platform Base
4:28
Injecting the COL1 Solution into the Microchannel and Removing the Cover for Cell Culture Applications
6:16
Results: Confocal Reflectance Images of COL1 Fibers
6:45
Conclusion
