Name: Dairesel RNAların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Keşfedin, dijital damlacık PCR kullanarak dairesel RNA seviyelerini hassas bir şekilde nasıl nicelleştireceğinizi. Bu yöntem, C2C12 hücrelerinde düşük bolluktaki nükleik asitleri mutlak kantitasyon için gelişmiş duyarlılık sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Yaşam Bilimleri Enstitüsü'nden intramural fonlar, DBT araştırma hibesi (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) ve Amaresh C. Panda'ya verilen Wellcome Trust / DBT Hindistan İttifakı Bursu [IA / I / 18 / 2 / 504017] ile desteklenmiştir. Makaleyi düzelttikleri için diğer laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz.

RNA RNazlara duyarlıdır; bu nedenle, tüm reaktifler, cihazlar ve çalışma alanları RNase içermeyen olmalı ve dikkatle kullanılmalıdır.
1. SirkRNA için farklı primer tasarım (bkz. Şekil 1)
<ol><li>BEDTools kullanarak circRNA ek açıklama verilerinden veya UCSC genom tarayıcısından, backsplice bağlantı koordinatları18,19 arasında mevcut ekzon / intron dizisini birleştirerek olgun dizisini alın.</li>
	<li>Toplam sirkRNA dizi uzunluğunun son 100 nükleotidini sirkRNA dizisi 10'un ilk 100 nükleotidine birleştirerek 200 nükleotid uzunluğunda bir PCR şablon dizisihazırlayın. NOT: Eğer sirkRNA uzunluğu 200 nükleotitten azsa, onu iki eşit yarıya bölün ve nükleotidleri son yarıdan ilk yarının başına kadar birleştirin.</li>
	<li>Primer3 web aracını kullanarak ve uzunluğu 20 olan 120-180 nükleotid arasında değişen bir PCRürün uzunluğu ayarlayarak astar tasarımı için yukarıdaki şablon dizisini kullanın.</li>
	<li>Tm ve astar uzunluğu gibi diğer parametreler için Primer3'ün varsayılan ayarlarını kullanın. CircBnc2 için primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.</li>
	<li>Herhangi bir oligo sentezleme şirketinden sentez için farklı astar dizilerini sipariş edin.</li>
</ol>2. RNA izolasyonu
NOT: Toplam RNA'yı fare C2C12 hücrelerinden ticari olarak temin edilebilen kitleri veya şirket içi RNA izolasyon yöntemini kullanarak izole edin. Burada kullanılan kurum içi RNA izolasyon yöntemi daha önce21 olarak tanımlanmıştır. Manyetik silika boncuklar, daha önce yayınlanan protokol22 kullanılarak laboratuvarda hazırlanır. Bu manyetik boncuklar çeşitli satıcılardan da temin edilebilir.
<ol><li>RNA izolasyonu için yaklaşık 5 x 106 çoğalan C2C12 miyoblast hücresi ve bir adet 4 günlük diferansiye C2C12 miyotüp içeren 10 cm'lik bir çanak alın.</li>
	<li>Hücreleri 10 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'yi pipet kullanarak atın.</li>
	<li>Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri 1 mL'lik 1x PBS'de kazıyın, 750 x g'de 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve PBS'yi bir pipet kullanarak atın.</li>
	<li>1 mL RNA izolasyon reaktifi (RIR) ekleyin ve hücreleri kuvvetli pipetleme21 ile lize edin.</li>
	<li>15 s için 200 μL (RIR hacminin 1 / 5'i) kloroform ve vorteks ekleyin. Tüpü 4 ° C'de 12.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.</li>
	<li>Üst sulu tabakanın 400 μL'sini alın, bir silika kolona yükleyin ve oda sıcaklığında 12.000 x g'da 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı yeni bir tüpe alın ve 600 μL% 100 etanol ekleyin.</li>
	<li>20 μL manyetik silika boncuk ekleyin ve tüpü 5 dakika boyunca 25 ° C ve 1.200 rpm'de ayarlanmış bir termomikser üzerine yerleştirin. NOT: Boncuk hacmi, lizis için alınan ilk hücre sayılarına bağlı olarak arttırılabilir veya azaltılabilir. Manyetik silika boncuklar ticari satıcılardan temin edilebilir.</li>
	<li>Tüpü 30 s boyunca veya çözelti netleşene kadar manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Süpernatantı bir pipet kullanarak dikkatlice atın.</li>
	<li>Manyetik silika boncukları% 90 etanol içeren 500 μL'lik bir yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Tüpü manyetik standın üzerine 30 s boyunca yerleştirin. Boncukları yıkamak için tüpü manyetik stand üzerinde iki kez döndürün. Boncukların mıknatısa doğru yerleşmesine izin verin ve tamponu bir pipet kullanarak atın.</li>
	<li>Adım 2.9'u iki kez yineleyin. Yıkamadan sonra, tüpü kısaca döndürün ve 30 s boyunca manyetik standın üzerine geri yerleştirin. Kalan yıkama tamponunu atın. Tüpü 50 °C'de bir termomikserde 3 dakika boyunca hava ile kurutun ve kapağı açık tutun.</li>
	<li>20 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve boncukları yeniden askıya alın. NOT: RNA elüsyon hacmi, RNA konsantrasyonunu artırmak için 10 μL'ye düşürülebilir.</li>
	<li>Tüpleri oda sıcaklığında 2-3 dakika bekletin. Tüpü manyetik standın üzerine geri yerleştirin ve 30 saniye bekletin. Bir spektrofotometre kullanarak miktar ve kalite değerlendirmesi için çözünmüş RNA'yı yeni bir tüpte toplayın. NOT: RNA, uzun süreli depolama için -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir. Optimum sonuç elde etmek için, ertesi gün cDNA sentez adımına devam etmeniz önerilir.</li>
</ol>3. cDNA sentezi
<ol><li>RNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve cDNA sentezi için 1 μg RNA alın.</li>
	<li>1 μL toplam RNA'yı 1 μL dNTP karışımı (dATP, dTTP, dGTP ve dCTP'nin her biri 10 mM), 4 μL 5x ters transkriptaz (RT) tamponu, 2 μL 10x RT rastgele primer, 0.25 μL ters transkriptaz enzimi (200 U / μL) ve 0.5 μL RNaz inhibitörü (40 U / μL) ile karıştırın ve nükleaz içermeyen su kullanarak hacmi 20 μL'ye kadar yapın. NOT: Ters transkriptaz enzim hacmi, cDNA sentezi için alınan ilk RNA konsantrasyonuna bağlı olarak değiştirilebilir.</li>
	<li>Reaksiyonu karıştırmak ve kısaca döndürmek için tüpe dokunun. Tüpü 10 dakika boyunca 25 ° C'ye, ardından 1 saat boyunca 50 ° C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Enzimi inaktive etmek için, tüpü 5 dakika boyunca 85 ° C'ye yerleştirin.</li>
	<li>Tüpü 2 dakika boyunca buzla soğutun ve cDNA konsantrasyonunu 2 ng / μL'ye çıkarmak için tüpe 480 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. NOT: cDNA -20 °C'de saklanabilir veya dd-PCR analizi için hemen kullanılabilir.</li>
</ol>4. Dijital damlacık PCR (dd-PCR) iş akışı
NOT: dd-PCR'nin iş akışı, numune hazırlamadan başlayarak, damlacık üretimi, PCR amplifikasyonu, damlacık sayımı ve veri analizi ile devam eden birden fazla adımı içerir. dd-PCR, ürünlerin mutlak niceliğini içerdiğinden ve herhangi bir standart eğriye ihtiyaç duymadığından, her adım doğru veri üretimi için çok önemlidir. Bu nedenle, dd-PCR'nin farklı adımlarının her biri aşağıda açıklanmıştır.
<ol><li>dd-PCR reaksiyonunun hazırlanması.<ol><li>22 μL'lik PCR reaksiyonunu 0,2 mL PCR tüplerinde veya şeritlerinde, negatif bir kontrol tüpü ve NTC (şablon olmayan kontrol) tüpleri ile birlikte ayarlayın. NOT: Farklı sirkRNA'ların tespiti için her farklı farklı primer çifti, test numuneleriyle birlikte bir NTC reaksiyonuna sahip olmalıdır.</li>
		<li>Negatif kontrol reaksiyon tüpünü kurmak için 11 μL dd-PCR master-mix (örneğin, EvaGreen Supermix) ve 11 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. NOT: dd-PCR ana karışımını oda sıcaklığında çözün ve ardından homojen bir karışım yapmak için kısa bir vorteks yapın. cDNA'yı seyreltmek için kullanılan negatif kontrol reaksiyon tüpünü ve NTC tüplerini kurmak için aynı nükleaz içermeyen suyu kullanın.</li>
		<li>NTC reaksiyon tüplerini kurmak için 11 μL dd-PCR master-mix, 5.5 μL circRNA spesifik ileri ve ters primer karışımı 1 μM konsantrasyonda ve 5.5 μL nükleaz içermeyen su ekleyin. NOT: 100 μM stoğun ileri ve geri dairesel RNA'ya özgü farklı primerlerini seyreltin ve ileri ve geri sirkRNA primer karışımının 1 μM çalışma konsantrasyonunu hazırlamak için karıştırın; Böylece, son astar konsantrasyonu 22 μL reaksiyonunda 250 nM'dir.</li>
		<li>Test reaksiyon tüplerini kurmak için 11 μL dd-PCR master-mix, 5.5 μL circRNA spesifik ileri ve ters primer karışımı 1 μM konsantrasyonda ve 5.5 μL cDNA (2 ng / μL) ekleyin.</li>
		<li>Vorteks, tüplerin dibinde homojen bir reaksiyon karışımı elde etmek için tüm reaksiyon tüplerini kısaca santrifüj ederek iyice takip eder.</li>
	</ol></li>
	<li>Damlacık üretimi.<ol><li>20 μL PCR karışımını 0,2 mL PCR tüplerinden damlacık jeneratörü kartuşunun numune kuyucuklarına aktarın.</li>
		<li>Çok kanallı pipet kullanarak damlacık jeneratörü kartuşunun yağ kuyularına 70 μL damlacık üretim yağı ekleyin. NOT: Damlacık üretim yağını kullanmadan önce oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Damlacık jeneratörü kartuşunu lastik conta ile örtün ve kartuşun damlacık kuyucuklarında oluşan numune-yağ damlacığı karışımını elde etmek için damlacık jeneratörü makinesine yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR amplifikasyonu.<ol><li>Numune-yağ damlacık karışımının 40 μL'sini, damlacık jeneratörü kartuşunun damlacık kuyucuklarından çok kanallı pipet kullanarak 96 delikli bir PCR plakasına aktarın. NOT: dd-PCR 96 delikli plakaya aktarırken damlacıkları kırmayı önlemek için çok kanallı pipetin uçlarından kuyucuklara açı yaparken numune-yağ damlacık karışımını dikkatlice aktarın.</li>
		<li>96 delikli PCR plakasını alüminyum folyo sızdırmazlık maddesi ile kapatın, 80 ° C'de önceden ısıtılmış plaka sızdırmazlık makinesi bloğuna yerleştirin ve PCR plakasını kapatmak için contaya tıklayın.</li>
		<li>Şimdi, plakayı dd-PCR termal bisikletçiye yerleştirin ve programı, kapak sıcaklığı 105 ° C'ye ve 2 ° C / s'lik bir rampa hızına ayarlanmış olarak Tablo 2'de belirtildiği gibi ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Damlacık sayımı.<ol><li>PCR bittikten sonra, plakayı dd-PCR damlacık sayacı makinesine, damlacıkları saymak için plaka tutucu ile doğru konuma getirin.</li>
		<li>Damlacık analiz yazılımını açın ve numune bilgileri için girdi vererek çalıştırmayı ayarlayın.</li>
		<li>Kurulum seçeneğine tıklayın. Ardından, yeni bir şablon açmak için şablon seçeneğine tıklayın.</li>
		<li>Deney adı (kullanılan cDNA veya negatif kontrol veya NTC), hedef adı (circRNA primer adı) ve tipi (bilinmeyen) ve deney türü ABS (mutlak niceleme) ve Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) gibi deneyin ayrıntılarını koyarak her bir kuyucuğu tanımlayın.</li>
		<li>Son olarak, şablonu kaydedin ve çalıştır seçeneğine tıklayarak çalıştırmayı başlatın ve satıra göre veya sütuna göre saymayı seçin. Makinenin damlacık sayımını tamamlamasına izin verin, bu da yaklaşık 1 dakika / kuyu alır.</li>
		<li>Damlacık okumasının tamamlanmasından sonra verileri analiz etmek için Analiz Et düğmesine tıklayın.</li>
		<li>Pozitif ve negatif damlacıkları görmek için 1D Genlik düğmesini tıklayın</li>
		<li>Pozitif damlacıkları negatif damlacıklardan ayırmak için, aynı hedefe sahip tüm numuneler için ortak bir eşik çizgisi koyun. NOT: Her numunedeki toplam damlacıklar, mutlak niceleme için dikkate alınmak üzere 10.000'in üzerinde olmalıdır. NTC pozitif damlacık sayıları göstermemelidir. NTC'de pozitif damlacıkların varlığı, reaktiflerin kontaminasyonunu veya primer dimerlerin amplifikasyonunu gösterir. Pozitif damlacıkların NTC'de astar dimerlere mi yoksa spesifik olmayan ürünlere mi sahip olduğunu bulmak zordur. Primerlerin kontrol edilmesi ve dd-PCR dahil olmak üzere herhangi bir PCR için genel bir uygulama olarak reaktiflerin kontaminasyonundan kaçınılması önerilir.</li>
		<li>circRNA sayım verilerini .csv dosyası olarak dışa aktarmak için Dışa Aktar düğmesine tıklayın. Dışa aktarılan veriler, her numunede bulunan circRNA'ların sayısını gösterir.</li>
		<li>Her reaksiyonda kullanılan toplam cDNA miktarını göz önünde bulundurarak, RNA'nın nanogramı başına her numunedeki sirkRNA sayısını manuel olarak hesaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+the+predominant+transcript+isoform+from+hundreds+of+human+genes+in+diverse+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types.</a> PLoS One. 7 (2), 30733(2012).</li>
<li>Chen, L. L., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+circRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of circRNA biogenesis.</a> RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).</li>
<li>Kristensen, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogenesis%2C+biology+and+characterization+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).</li>
<li>Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+in+disease%3A+Basic+properties+and+biomedical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).</li>
<li>Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+translation%2C+a+path+to+hidden+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNA translation, a path to hidden proteome.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685(2022).</li>
<li>Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPanda%2C+AC+%22Circular+RNAs%3A+Biogenesis+and+Functions%22">Circular RNAs: Biogenesis and Functions</a>. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).</li>
<li>Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+circular+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Non-Coding+RNA%22%5BJournal%5D)">Emerging role of circular RNA-protein interactions.</a> Non-Coding RNA. 7 (3), 48(2021).</li>
<li>Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircRNAs%3A+Role+in+human+diseases+and+potential+use+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers.</a> Cell Death & Disease. 12 (5), 468(2021).</li>
<li>Pandey, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+analysis+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Methods for analysis of circular RNAs.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566(2020).</li>
<li>Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDas%2C+A+%22PCR+Primer+Design.+Methods+in+Molecular+Biology%22">PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology</a>. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).</li>
<li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Hayden, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+droplet+digital+PCR+to+real-time+PCR+for+quantitative+detection+of+cytomegalovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+From+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic%2C+prognostic%2C+and+therapeutic+value+of+droplet+digital+PCR+%28ddPCR%29+in+COVID-19+patients%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712(2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li>
<li>Lee, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+database%3A+2022+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser database: 2022 update.</a> Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+A+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Research. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+cost-effective+method+for+DNA-free+total+RNA+isolation+using+magnetic+silica+beads%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Oberacker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Synthesis+of+Functionalized+Paramagnetic+Beads+for+Nucleic+Acid+Purification+and+Manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation.</a> Bio-protocol. 9 (20), 3394(2019).</li>
<li>Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+droplet+digital+PCR+shows+high+resilience+to+PCR+inhibitors+from+plant%2C+soil+and+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples.</a> Plant Methods. 10 (1), 42(2014).</li>
<li>Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+droplet+digital+PCR+from+RNA+and+DNA+extracts+with+direct+comparison+to+RT-qPCR%3A+Clinical+implications+for+quantification+of+Oseltamivir-resistant+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations.</a> Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

CircRNA araştırması, son on yılda yüksek verimli dizileme teknolojilerinin keşfi ile büyümüştür. Sonuç olarak, gelecekteki RNA terapötikleri için potansiyel bir molekül olarak kabul edilmiştir. Ek olarak, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda biyobelirteç olarak hareket ettiği bilinmektedir 4,8. Bununla birlikte, sirkRNA'nın tanımlanması, düşük bolluğu ve onu ebeveyn mRNA9'dan ayıran yalnızca bir ...

RNA dizileme teknolojilerindeki son gelişmeler ve yeni hesaplama algoritmaları, dairesel RNA (circRNA)1 olarak adlandırılan, büyüyen kodlamayan RNA ailesinin yeni bir üyesini keşfetti. Adından da anlaşılacağı gibi, sirkRNA'lar, serbest uçları olmayan tek sarmallı RNA moleküllerinin bir ailesidir. Bunlar, yukarı akış ekleme alıcı bölgesinin, kararlı bir RNA çemberi1,2 oluşturmak için aşağı akış ekleme donör bölgesi ile kovalent olarak birleştiği, geri ekleme adı verilen kanonik olmayan baştan kuyruğa ekleme ile oluşturulurlar. Bu süreç, dairesel ekzonların yukarı ve aşağı akımında bulunan ters Alu tekrarlayan elementler de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından aracılık edilebilir veya bazı ekleme faktörleri veya RNA bağlayıcı proteinler (RPP'ler) tarafından aracılık edilebilir2,3. Sadece ekzonik veya intronik diziden üretilen dairesel RNA'lar ekzonik sirkRNA ve dairesel intronik RNA'lar veya ci-RNA'lar olarak sınıflandırılırken, bazı ekzonik sirkRNA'lar introniği korur ve ekzon-intron sirkRNA'lar (EIcircRNA'lar)3,4 olarak adlandırılır. SirkRNA'ların işlevleri, miRNA ve / veya RBP'yi süngerlemek, transkripsiyonu düzenlemek ve peptidlereçevirerek hücresel fonksiyonu düzenlemek de dahil olmak üzere çok yönlüdür 3,5,6,7. Çeşitli raporlar, sirkRNA'ların çeşitli hastalıklarda ve fizyolojik süreçlerdeki önemini vurgulamıştır8. Ayrıca, dokuya özgü ekspresyon paternleri ve ekzonükleaz sindirimine direnç, onu hastalık tanısı için fonksiyonel bir biyobelirteç haline getirir ve uygun bir terapötik hedef olarak da kullanılabilir8. Sağlık ve hastalıkların düzenlenmesindeki önemi göz önüne alındığında, sirkRNA ekspresyonunun doğru bir şekilde ölçülmesi saatin ihtiyacıdır.
Biyolojik örneklerdeki sirkRNA'ları ölçmek için çeşitli biyokimyasal yöntemler geliştirilmiştir9. SirkRNA nicelleştirmesi için en uygun ve yaygın olarak kabul edilen yöntemlerden biri, ters transkripsiyon ve ardından farklı primer çiftleri10 kullanılarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonudur (RT-qPCR). Bununla birlikte, sirkRNA'ların çoğunluğu lineer mRNA'lara kıyasla düşük bolluk içindedir, bu da onları ölçmeyi zorlaştırır11. Bu sorunun üstesinden gelmek için, belirli bir numunedeki sirkRNA sayısını doğru bir şekilde ölçmek için dijital damlacık PCR'yi (dd-PCR) kullanmaya çalıştık. dd-PCR, mikroakışkanlar ilkesini takip eden gelişmiş bir PCR teknolojisidir; yağda birden fazla sulu damlacık üretir ve PCR her damlacıkta ayrı bir reaksiyon12 olarak oluşur. Reaksiyon bireysel damlacıklarda meydana gelir ve ilgilenilen gen için pozitif veya negatif damlacıkların sayısını veren bir damlacık okuyucu kullanılarak analiz edilir12. Belirli bir örnekte yalnızca tek bir kopya olsa bile, ilgilenilen bir geni doğru bir şekilde ölçmek için en hassas tekniktir. İnhibitörlere karşı duyarlılığın azalması, daha iyi hassasiyet ve niceleme için referans genin ihmal edilmesi, onu geleneksel qPCR 13,14,15'ten daha avantajlı hale getirir. İlgilenilen bir genin mutlak nicelleştirilmesi için bir araştırma ve teşhis aracı olarak yaygın olarak kullanılmıştır16,17. Burada, fare C2C12 miyotüplerini ayırt etmede ve farklı primerler kullanarak fare C2C12 miyoblastlarını çoğaltmada sirkRNA nicelemesi için ayrıntılı dd-PCR protokolünü açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml mikrosantifuge tüp</td><td>Tarson</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml kapaklı tüp şeritleri</td><td>Tarson</td><td>610020, 510073</td><td></td></tr><tr><td>Filtre Uçları</td><td>Tarson</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>DNase / RNaz İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Hücresi sıyırıcı</td><td>HiMedia</td><td>TCP223</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>SRL</td><td>96764</td><td></td></tr><tr><td>DNA seyreltici</td><td>HiMedia</td><td>MB228</td><td></td></tr><tr><td>Rastgele primerler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP seti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Murin RNaz inhibitörü</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Maxima ters transkriptaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0743</td><td></td></tr><tr><td>QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td> Evagreen Bio-Rad 1864006 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>PCR Plakası için damlacık üretim yağı</td></tr><tr><td>Isı Yalıtımı, folyo, delinebilir</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuşları ve Contaları</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td>DG8</tr><tr><td>Kartuşu tutucu</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Jeneratörü</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96 Kuyulu Plakalar</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR Plaka Kapatıcı</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyici 96&ndash; Derin Kuyu Reaksiyon Modülü</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Okuyucu</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Quantasoft Yazılımı</td><td>Bio-Rad</td><td>1864011</td><td></td></tr><tr><td>Silika sütun</td><td>Şemsiye Yaşam Bilimleri</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>UCSC Genom Tarayıcı</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td><td></td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td></td>https://primer3.ut.ee/</tr></tbody></table>

dairesel rna'ların dijital damlacık pcr kullanılarak nicelleştirilmesi

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (dd-PCR) en hassas niceleme yöntemlerinden biridir; reaksiyonu yaklaşık 20.000 yağda su damlacığına ayırır ve PCR bireysel damlacıklarda meydana gelir. dd-PCR, geleneksel gerçek zamanlı qPCR'ye göre, düşük bolluk hedeflerinin tespitinde artan doğruluk, niceleme için referans genleri atlama, numuneler için teknik replikaları ortadan kaldırma ve numunelerdeki inhibitörlere karşı yüksek esneklik gösterme gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Son zamanlarda, dd-PCR, gen ekspresyon analizi ve teşhisi için hedef DNA veya RNA'yı doğru bir şekilde ölçmek için en popüler yöntemlerden biri haline gelmiştir. Dairesel RNA'lar (sirkRNA'lar), 5' ve 3' uçları olmayan, yakın zamanda keşfedilen kovalent olarak kapalı RNA moleküllerinin büyük bir ailesidir. RNA bağlayıcı proteinler ve mikroRNA'lar için sünger görevi görerek gen ekspresyonunu düzenledikleri gösterilmiştir. Ayrıca, sirkRNA'lar vücut sıvılarına salgılanır ve ekzonükleazlara karşı dirençleri, hastalık teşhisi için biyobelirteçler olarak hizmet etmelerini sağlar. Bu makale, hücrelerdeki spesifik dairesel RNA (circRNA) seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için farklı primer tasarımı, RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve dd-PCR analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermeyi amaçlamaktadır. Sonuç olarak, dd-PCR kullanarak circRNA'ların kesin niceliğini gösteriyoruz.

Her numunedeki sirkRNA'ların mutlak sayısı, dışa aktarılan dd-PCR verilerinden türetilebilir. Gerçek zamanlı kantitatif PCR analizi, diferansiye C2C12 miyotüplerinde circBnc2'nin diferansiyel ekspresyonunu önerdi (veriler gösterilmedi). Burada, çoğalan C2C12 miyoblastlarında ve miyotüplerinde circBnc2'nin mutlak kopya sayısını kontrol etmek istedik. CircBnc2'nin ekspresyonu iki koşulda karşılaştırıldığından, aynı reaktifleri ve prosedürü kullanarak RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve PCR için tüm n...

Bu protokol, farklı primerler kullanılarak hücrelerdeki dairesel RNA (circRNA) seviyelerinin hassas bir şekilde ölçülmesi için ayrıntılı dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini açıklamaktadır.

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR, hedef DNA veya RNA'nın mutlak nicelleştirilmesi için oldukça hassas ve doğru bir yöntemdir. Diğer konvansiyonel yöntemlerin doğru sonuç veremediği durumlarda hastalık tanısında kullanılmıştır. dd-PCR, çok düşük miktarda bulunan nükleik asit moleküllerini tespit etmek için en hassas tekniktir.Kantitatif PCR'nin aksine, dd-PCR nicelik için herhangi bir temizlik gen kontrolü gerektirmez. Duyarlılığı ve doğruluğu nedeniyle, dd-PCR, mikro RNA'lar ve dairesel RNA'lar gibi düşük miktarda RNA moleküllerini içeren moleküler teşhis ve araştırmalar için bir araç olarak kullanılabilir. dd-PCR kullanmadan önce, primerlerin spesifik olmayan herhangi bir PCR amplifikasyonu olmadan hedef genlerini yükselttiğini doğrulamak için RT-PCR veya RT-qPCR yapılmalıdır.Başlamak için, toplam dairesel RNA dizisi uzunluğunun son 100 nükleotidini dairesel RNA dizisinin ilk 100 nükleotidine birleştirerek 200 nükleotid uzunluğunda bir PCR şablon dizisi hazırlayın. Primer 3 web aracı tarafından tasarlanan astar şablon dizisini kullanın. RNA izolasyonu için yaklaşık 5 milyon çoğalan C2C12 miyoblast hücresi ve dört günlük bir farklılaştırılmış C2C12 miyotüpü içeren 10 santimetrelik bir çanak alın.Hücreleri 1

quantification-of-circular-rnas-using-digital-droplet-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya dPCR ile hedef nükleik asitleri tespit etmek için emülsifiye edilmiş nano damlacıklar oluşturmak için adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Boya bazlı bir kimya ve damlacık dijital PCR teknolojisi kullanılarak hücresiz mikroRNA'ların miktar tayini için hassas ve doğru bir yöntem açıklanmaktadır.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Dolaşımdaki mikroRNA'lar söz biyolojik kalp-damar hastalıkları ve akut miyokard enfarktüsü olarak göstermiştir. Bu çalışmada, bir protokol miRNA ayıklama, Ters transkripsiyon ve kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda serum miRNAs mutlak miktar için dijital PCR için açıklar.

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Bu çalışma, iki renkli bir ddPCR sistemi kullanarak SARS-CoV-2 tespiti için farklı tahliller geliştirme adımlarını özetlemektedir. Adımlar ayrıntılıdır ve tahlillerin ve deney performansının nasıl geliştirileceğine dair notlar eklenmiştir. Bu testler birden fazla SARS-CoV-2 RT-ddPCR uygulaması için kullanılabilir.

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Burada, tek hücrelerde mutlak mitokondriyal (mt) DNA kopya sayısını ve mtDNA delesyon heteroplazmi seviyelerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu Kullanarak Tek Hücreli Mitokondriyal DNA Kopya Sayısını ve Heteroplazmiyi Ölçme

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektör genom kopyalarının kesin miktar tayini kritiktir, ancak standart bir protokol henüz oluşturulmamıştır. Bu protokol, saflaştırılmış AAV numunelerinin hazırlanması ve viral genom titresinin güvenilir bir şekilde ölçülmesi için dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonunun (dd_PCR) yürütülmesi için doğrulanmış bir yöntemi tanımlar.

Dijital Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Saflaştırılmış Vektör Örneklerinde Adeno İlişkili Viral Genomların Miktar Tayini

Bu çalışma, gözenekli membran insertleri kullanarak aksonal mRNA'ları izole etmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır; böylece toplam nöron ve nörit ayrımı ve RNA arındırmasını mümkün kılar. RTddPCR ile birleştiğinde, bu yaklaşım düşük kopyalı transkriptlerin mutlak nicelendirilmesini sağlar; mRNA taşınımı ve yerel çeviri çalışmalarını yüksek duyarlılık, tekrarlanabilirlik ve geniş deneysel uygulama ile kolaylaştırır.

Gözenekli Membran Insertleri ve RTddPCR Kullanarak Aksonal MRNA'ların İzolasyonu ve Nicelesi

Keşfedin, dijital damlacık PCR kullanarak dairesel RNA seviyelerini hassas bir şekilde nasıl nicelleştireceğinizi. Bu yöntem, C2C12 hücrelerinde düşük bolluktaki nükleik asitleri mutlak kantitasyon için gelişmiş duyarlılık sunar.

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Daha fazla video keşfet