Name: İskemik İnme In Vitro Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:05:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Öğrenin, insan kan-beyin bariyerinin üçlü birincil hücre kültürü modelini in vitro iskemik inme çalışmaları için nasıl kuracağınızı. Bu yöntem, inme sonrası iyileşme mekanizmalarını araştırmak ve ilaç adaylarını taramak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 ve DA047157 Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibeleri tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm hücreler, malzemeler, ekipmanlar ve çözümlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.
1. Üçlü hücre kültürü BBB model ayarı
<ol><li>Tohumlama perisitleri<ol><li>HBVP'yi T75 kültür şişelerinde, birleşene kadar 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatörü içinde hücre yapışması için aktif bir yüzeye sahip olarak yetiştirin. Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, eski perisit ortamını aspire edin ve hücreleri 5 mL ılık Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile yıkayın. DPBS'yi aspire edin ve 4 mL sıcak tripsin-EDTA çözeltisi ve 1 mL DPBS kombinasyonunu kullanarak hücreleri şişeden ayırın. NOT: P7'den sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.</li>
		<li>Şişeyi bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin. Hücrelerin şişeden ayrılıp ayrılmadığını doğrulamak için mikroskop altında görüntüleyin. Şişeye 5 mL ılık perisit ortamı (% 2 fetal sığır serumu [FBS] içeren) ekleyin ve ayrılan hücreleri 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 200 × g'da 3 dakika boyunca santrifüj ederek hücrelerin tüpün dibinde bir pelet oluşturmasına izin verin. Hücre peletinin bozulmadan kalmasını sağlamak için ortamı tüpten aspire edin.</li>
		<li>Hücre peletini perisit ortamında yeniden askıya alın; hücrelerin birleşmesine ve ihtiyaç duyulan kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak ortam miktarını hesaplayın. Yeniden askıya alınan hücrelerin 10 μL'sini alın, bunları bir hücre sayma slaytına yerleştirin ve hücre sayısını sayın.</li>
		<li>Hücre yoğunluğunu belirleyin ve 300.000 hücreyi tohumlayın / kuyu eklerin abluminal tarafına 1 mL perisit ortamında ekleyin (6 delikli format). NOT: HBVP'yi kesici uçların alt tarafına yerleştirirken, önce kuyu ucu plakalarını baş aşağı çevirmek çok önemlidir. Plaka bir yüzeye düz bir şekilde yerleştirilirken, kuyu eklerinin abluminal tarafını ortaya çıkarmak için alt kısmı çıkarın. Abluminal tarafa perisit hücresi süspansiyonu ekledikten sonra, buharlaşmayı önlemek için kuyu eklerini ters çevrilmiş plaka ile örtün. Tüm plakaları gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöründe baş aşağı çevirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Astrositlerin tohumlanması<ol><li>Birleşime ulaşılana kadar 37 °C'de %5'lik bir CO2 inkübatörü içinde T75 şişelerinde HA yetiştirin. Perisit ortamı yerine astrosit ortamı (ayrıca% 2 FBS içeren) kullanarak yukarıdaki 1.1.1-1.1.4 adımlarını izleyin. NOT: P9'dan sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.</li>
		<li>Hücre yoğunluğunu belirleyin ve doku kültürünün dibine 300.000 hücre / kuyu tohumlayın 6 kuyucuklu plakalar. Buharlaşmayı önlemek için plakayı örtün ve tüm plakaları gece boyunca 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatöründe tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Endotel hücrelerinin tohumlanması<ol><li>HBMEC'yi doku kültürü kaplarında, birleşene kadar 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatöründe yetiştirin. Perisit ortamı yerine tam klasik ortam ( FBS içeren) kullanarak yukarıdaki 1.1.1-1.1.4 adımlarını izleyin. NOT: P12'den sonraki pasajları kullanmaktan kaçının.</li>
		<li>Astrositler içeren doku kültürü 6 kuyucuklu plakaları ve perisitler içeren kuyu eklerini (6 kuyucuklu format) 37 °C'de% 5 CO2 inkübatöründen çıkarın. Astrosit ortamını doku kültürü 6 kuyucuklu plakalardan aspire edin. Her bir kuyucuğa 1 mL perisit ortamı ve 1 mL astrosit ortamı ekleyin.</li>
		<li>Perisit ortamını kuyu eklerinden aspire edin ve tohumlanmış astrositleri içeren doku kültürü 6 kuyucuklu plakalara yerleştirin. HBMEC'yi 2 mL'lik tam klasik ortamda 300.000 hücre / kuyucuk yoğunluğunda, aynı kuyu eklerinin apikal tarafına tohumlayın. NOT: Endotel hücreleri, kuyu eklerinin abluminal tarafındaki perisitlerin ve doku kültürü 6 delikli plakaların üzerindeki astrositlerin tohumlanmasından sonraki ertesi gün kuyu eklerinin apikal tarafına tohumlanmalıdır. BBB benzeri özellikleri indüklemek için hücreler 6 gün boyunca üçlü kültürde tutulmalıdır. Hücre kültürü ortamı, deneylerden 24 saat önce her iki iyi yerleştirilmiş bölmede değiştirilmelidir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Oksijen-glikoz yoksunluğunun indüksiyonu
<ol><li>Hücreleri DPBS ile 3 kat yıkayın. OGD'ye tabi tutulan üçlü hücre kültürleri için, hem apikal hem de bazolateral bölmelere glikozsuz ortam (L-glutamin ve fenol kırmızısı olmadan) ekleyin. Normozik kontrol hücresi kültürlerinde kültür ortamını taze ortamla değiştirin. Kontrol üçlü kültürlerini 37 °C'de %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. NOT: OGD'nin indüksiyonundan önce veya OGD'den hemen sonra meydana gelen değişiklikler, endotel hücre monokatmanlarını daha da etkileyecek mekanik stres yaratabilir. Böylece, normoksik kontrol hücre kültürleri için orta replasman ile adımlar dahil edilmiştir.</li>
	<li>Kültürlerin yeterli nemlendirilmesini sağlamak için hipoksi inkübatör odasına 20 mL steril su içeren bir Petri kabı yerleştirin. Halka kelepçesini serbest bırakarak odayı açın. Hücre kültürlerini raflara yerleştirin. Halka kelepçesini sabitleyerek odayı kapatın.</li>
	<li>Odanın hem giriş hem de çıkış portlarını açın. Debimetrenin üstünden gelen boruyu odaya takın. Debimetrenin altından gelen boruyu, bir hava filtresi aracılığıyla% 95 N2/% 5 CO2 gaz karışımını içeren gaz tankına takın. </li>
	<li>Minimum gaz akışına izin vermek için tank akış kontrol valfini saat yönünün tersine çevirerek açın. Saat yönünde dönerek basınç regülatörü valfini yavaşça açın.</li>
	<li>Odayı gaz karışımı ile 5 dakika boyunca 20 L/dak akış hızında yıkayın. Odayı gaz kaynağından ayırın ve her iki beyaz plastik kelepçeyi de sıkıca kapatın.</li>
	<li>Saat yönünde dönerek tank akış kontrol valfini kapatın. Saat yönünün tersine dönerek basınç regülatörü valfini kapatın.</li>
	<li>Hipoksi odasını 4 saat boyunca 37 ° C'de geleneksel bir inkübatöre yerleştirin. NOT: Sonraki reoksijenasyon periyodunu eklemek için, hücreleri DPBS ile 3 kat yıkayın, tüm üçlü kültürlerde taze ortam ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO 2 inkübatöründe24 saat daha saklayın. Üreticinin talimatlarına göre, haznede kalan oksijen konsantrasyonu, 20 L / dak'da anaerobik gaz karışımı ile en az 4 dakika temizlendikten sonra% 0'dır.</li>
</ol>3. TEER ölçümleri
<ol><li>Sterilize edilmiş TEER cihazını biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve elektrotları epitel voltohmmetresine takın. Elektrotları en az 30 dakika boyunca 30 mL% 70 izopropil alkol çözeltisinde sterilize edin.</li>
	<li>TEER cihazını açın ve işlevi ohm olarak ayarlayın.</li>
	<li>Elektrotları% 70 izopropil alkol çözeltisinden çıkarın ve TEER cihazındaki dijital okuma 0 ohm okuyana kadar en az 30 dakika boyunca 20 mL DPBS içine yerleştirin.</li>
	<li>Elektrotun uzun çatalını, boş kuyu eki kontrolünün kuyu ekleme askısındaki üç açıklıktan birine yerleştirin ve kuyunun dibine değene kadar indirin. Kısa çatalın, kuyu ucunun altındaki apikal kültürün üzerinde durduğundan emin olun. NOT: Boş kuyu eki kontrolü, apikal bölmede 2 mL komple klasik ortamdan ve bazolateral bölmede 1 mL perisit ortamı ve 1 mL astrosit ortamının bir kombinasyonundan oluşur. TEER ölçümü yapılırken elektrotların kuyu girişine 90° C'de tutulduğunu tespit edin. Aynı kuyuda elde edilen iki veya üç okumanın ortalamasını kullanmak (açıklık başına) değişkenliği azaltmaya yardımcı olabilir.</li>
	<li>Değeri kaydetmeden önce TEER cihazındaki dijital okuma değerleri aynı seviyeye gelene kadar bekleyin. Elektrotları ölçümler arasında yıkamak için tekrar DPBS'ye yerleştirin. İki boş kuyu eki kontrolü için tüm TEER ölçümlerini toplamaya devam edin.</li>
	<li>Kontrol ölçümleri için alınan 3.4-3.5 adımlarını kullanarak numune plakalarının TEER ölçümlerini toplayın. Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, elektrodu 30 dakika boyunca% 70 izopropil alkol çözeltisine geri yerleştirin. Elektrotları TEER cihazından ayırın ve hava ile kurumasını bekleyin.</li>
	<li>TEER değerlerini hesaplayın. Boş kuyu eki kontrolünün ortalama ohm değerini numunenin ohm değerinden çıkarmak için denklem (1)'i kullanın ve ardından bildirilen TEER değerini Ω∙cm2 cinsinden vermek için bu direnç değerini membran ekinin alanıyla (cm2) çarpın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64469/64469eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)</li>
</ol>4. BBB parasellüler geçirgenliğinin değerlendirilmesi
NOT: FITC-dextran içeren tüm adımları, ışıklar kapalıyken bir hücre kültürü biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. Fotobeyazlatmayı en aza indirmek için FITC-dextran çözeltilerini alüminyum folyo ile örtün.
<ol><li>Fenol kırmızısı içermeyen endotel hücre büyüme ortamı kullanarak 20 ve 70 kDa'lık (0.1 mg / mL) FITC-dextrans içeren çözeltiler hazırlayın ve sallanan bir platform çalkalayıcıda 1 saat boyunca karıştırılmaya izin verin. 0,22 μm şırınga filtresi kullanarak çözeltileri filtreleyin.</li>
	<li>Ortamı bazolateral bölmeden aspire edin ve üçlü hücre kültürü BBB modelinde 2 mL fenol kırmızısız endotel hücre büyüme ortamı ile değiştirin. Apikal bölmedeki hücreleri Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Apikal bölmeye 1 mL FITC-dextran çözeltisi ekleyin ve plakayı alüminyum folyo ile örtün. Plakayı 1 saat boyunca 37 °C'de% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Bazolateral bölmelerden 100 μL ortam alın ve siyah 96 delikli bir plakaya aktarın. Floresansı, sırasıyla 480 nm ve 530 nm olarak ayarlanmış uyarma ve emisyon dalga boylarına sahip bir mikroplaka okuyucu kullanarak ölçün.</li>
</ol>5. Canlı hücrelerde hipoksi tespiti
<ol><li>Tohum 200 μL HBMEC, HA ve HBVP, poli-d-lizin kaplı, 35 mm cam alt tabakların merkezinde, 150.000 hücre / çanak yoğunluğunda. HBMEC'yi tohumlamadan önce, bulaşıkların dibini bağlantı faktörü ile kaplayın. Hücrelerin bir CO2 inkübatöründe gece boyunca 37 ° C'de bırakarak cam yüzeye yapışmasına izin verin. NOT: İnsan birincil hücrelerine sahip çanakları, OGD için bir hipoksi odasına üçlü iyi yerleştirilmiş bir BBB modeli ile aynı anda yerleştirmek önemlidir.</li>
	<li>Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, kültür ortamını atın ve referans verilen Image-iT yeşil hipoksi reaktifinin (son konsantrasyon 1 μM) 2 μL'lik 1 mM Hoechst 33342 (son konsantrasyon 0.2 μM) ve 0.5 μL 5 mM stok çözeltisi içeren 2 mL önceden ısıtılmış glikozsuz ortam (OGD için) veya normal ortam (kontroller için) ekleyin. OGD tedavisinden sonra, ortamı tüm yemeklerde görüntüleme için optimize edilmiş ortamla değiştirin.</li>
	<li>GFP filtresi ve üst aşama konfokal mikroskop inkübatörü ile floresan canlı hücre görüntülemesini daha önce tarif edildiği gibi gerçekleştirin14,15.</li>
</ol>

<ol><li>Mozaffarian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2016+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (94), 38(2016).</li>
<li>Yousufuddin, M., Young, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Aging and ischemic stroke.</a> Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).</li>
<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+in+the+21st+century%3A+a+snapshot+of+the+burden%2C+epidemiology%2C+and+quality+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life.</a> Stroke Research and Treatment. , 3238165(2018).</li>
<li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blood-brain+barrier+overview+on+structure%2C+function%2C+impairment%2C+and+biomarkers+of+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69(2020).</li>
<li>Brown, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+and+neurovascular+function+in+the+healthy+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282(2019).</li>
<li>Cabezas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+modulation+of+blood+brain+barrier%3A+perspectives+on+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211(2014).</li>
<li>Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dysfunction+in+ischemic+stroke%3A+targeting+tight+junctions+and+transporters+for+vascular+protection%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).</li>
<li>Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%2C+stroke%2C+blood-brain+barrier+dysfunction%2C+and+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities.</a> Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).</li>
<li>He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-culture+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cell-culture models of the blood-brain barrier.</a> Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).</li>
<li>Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+culture+model+of+the+blood-brain+barrier+using+porcine+brain+endothelial+cells%2C+astrocytes+and+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes.</a> PLoS One. 10 (8), 0134765(2015).</li>
<li>Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+blood-brain+barrier+models+for+in+vitro+biological+analysis%3A+one+cell+type+vs+three+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+induce+tight+junction+disruption+and+astrocyte+neurotoxicity+in+a+rat+blood-brain+barrier+primary+triple+coculture+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model.</a> International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).</li>
<li>Appelt-Menzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+model+mimicking+the+neurovascular+unit+using+induced+pluri-+and+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+construction+of+a+reversible+arylazo-based+NIR+probe+for+cycling+hypoxia+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo.</a> Nature Communications. 12 (1), 2772(2021).</li>
<li>Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+switching+of+tumor+cells+under+hypoxic+conditions+in+a+tumor-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model.</a> Micromachines. 11 (4), 382(2020).</li>
<li>Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+of+the+blood-brain+barrier+in+vitro+and+the+function+of+cerebral+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes.</a> FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).</li>
<li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li>
<li>Rizzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+culture+cell+system+modeling+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).</li>
<li>Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P50%3A+Developing+a+physiologically+relevant+blood+brain+barrier+model+for+the+study+of+drug+disposition+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma.</a> Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).</li>
<li>Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transwell+blood+brain+barrier+model+using+primary+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230(2019).</li>
<li>Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+pericytes+differentially+modulate+blood-brain+barrier+characteristics+during+development+and+hypoxic+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).</li>
</ol>

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını açıkladı.

Bu protokolde, in vitro iskemik inme ortamında BBB disfonksiyonunu incelemek için güvenilir bir üçlü endotel hücre-perisit-astrosit kültürü BBB modeli oluşturmak için bir yöntem tanımladık. Perisitlerin in vivo endotel hücrelerinin en yakın komşuları olduğu göz önüne alındığında, HBVP bu model16'daki kuyu eklerinin alt tarafına kaplanmıştır. Bu konfigürasyon, astrositler ve endotel hücreleri arasındaki doğrudan hücreden hücreye iletişimden yoksun olmasına rağmen, bu düzenleme, sa...

İnme, dünya çapında önde gelen ölüm ve uzun süreli sakatlık nedenlerinden biridir1. İnme insidansı yaşla birlikte hızla artar ve 55 yaşından sonra her 10 yılda bir iki katına çıkar2. İskemik inme, tüm inme vakalarının %80'inden fazlasını kapsayan trombotik ve embolik olaylara bağlı serebral kan akımının bozulması sonucu ortaya çıkar3. Şimdi bile, iskemik inme sonrası doku ölümünü en aza indirmek için nispeten az sayıda tedavi seçeneği mevcuttur. Mevcut tedaviler zamana duyarlıdır ve sonuç olarak her zaman iyi klinik sonuçlara yol açmaz. Bu nedenle, inme sonrası iyileşmeyi etkileyen iskemik inmenin karmaşık hücresel mekanizmaları üzerine araştırmalara acilen ihtiyaç vardır.
BBB, kan ve beyin parankimi arasındaki moleküllerin değişimi için dinamik bir arayüzdür. Yapısal olarak, BBB, bir bazal membran, perisitler ve astrositik uç ayaklar4 ile çevrili bileşke kompleksleri ile birbirine bağlanmış beyin mikrovasküler endotel hücrelerinden oluşur. Perisitler ve astrositler, güçlü, sıkı kavşakların oluşumu için gerekli çeşitli faktörlerin salgılanması yoluyla BBB bütünlüğünün korunmasında önemli bir rol oynamaktadır 5,6. BBB'nin parçalanması, iskemik inmenin ayırt edici özelliklerinden biridir. Serebral iskemi ile ilişkili akut inflamatuar yanıt ve oksidatif stres, sıkı bağlantı protein komplekslerinin bozulmasına ve astrositler, perisitler ve endotel hücreleri arasındaki düzensiz çapraz konuşmaya neden olur ve bu da BBB7 boyunca parasellüler çözünür geçirgenliğin artmasına neden olur. BBB disfonksiyonu ayrıca beyin ödemi oluşumunu teşvik eder ve hemorajik transformasyon riskini arttırır8. Yukarıdakilerin tümü göz önüne alındığında, iskemik inme sırasında ve sonrasında BBB düzeyinde meydana gelen moleküler ve hücresel değişikliklerin anlaşılmasına büyük ilgi vardır.
Her ne kadar birçok in vitro BBB modeli son yıllarda geliştirilmiş ve çeşitli çalışmalarda kullanılmış olsa da, hiçbiri in vivo koşullarda tam olarak çoğalamamaktadır9. Bazı modeller, tek başına veya perisitler veya astrositlerle kombinasyon halinde iyi yerleştirilmiş geçirgen destekler üzerinde kültürlenmiş endotel hücre monokatmanlarına dayanırken, sadece daha yeni çalışmalar üçlü hücre kültürü model tasarımlarını ortaya koymuştur. Hemen hemen tüm mevcut üçlü kültür BBB modelleri, hayvan türlerinden izole edilen astrositler ve perisitler veya insan pluripotent kök hücrelerinden türetilen hücreler10,11,12,13 ile birlikte birincil beyin endotel hücrelerini içerir.
İnsan BBB'sini in vitro olarak daha iyi özetleme ihtiyacını kabul ederek, insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri (HBMEC), birincil insan astrositleri (HA) ve birincil insan beyni vasküler perisitlerinden (HBVP) oluşan üçlü bir hücre kültürü in vitro BBB modeli kurduk. Bu üçlü kültür BBB modeli, 0,4 μm gözenek boyutuna sahip 6 delikli plakalı, polyester membran uçlar üzerine kurulmuştur. Bu iyi insertler, hücre bağlantısı için en uygun ortamı sağlar ve orta örnekleme veya bileşik uygulaması için hem apikal (kan) hem de bazolateral (beyin) bölmelere kolay erişim sağlar. Bu önerilen üçlü hücre kültürü BBB modelinin özellikleri, in vitro iskemik inmeyi taklit eden OGD sonrası TEER ve parasellüler akı, nemlendirilmiş, kapalı bir oda kullanılarak elde edilen oksijen (% <1O2) ve besin (glikozsuz ortam kullanılarak) eksikliği ile ölçülerek değerlendirilmektedir. Ek olarak, bu modeldeki indüklenmiş iskemik benzeri koşullar, hipoksik hücrelerin doğrudan görselleştirilmesiyle doğru bir şekilde doğrulanır.

<table><tbody><tr><td>0.4 ve mikro ile 24 mm Transwell; m Gözenekli Polyester Membran Ek</td><td>Parça Corning</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cam Alt</td><td>Tabaklar MatTek Yaşam Bilimleri (FISHERSCI)</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Astrosit Orta</td><td>Science Cell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Bağlanma Faktörü</td><td>Hücre Sistemleri (Fisher Scientific)</td><td>4Z0-201</td><td></td></tr><tr><td>BD 60 mL Şırınga</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys Imaging Optimize Edilmiş Ortam</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>5791</td><td></td></tr><tr><td>Serum ve CultureBoost</td><td>4Z0-500</td><td>Hücre</td><td></td>Sistemleri ile Komple Klasik</tr><tr><td>Ortam Corning 50 mL PP Santrifüj Tüpleri (CentriStar Kapaklı Konik Alt</td><td>VWR</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Corning 75cm&sup2; U-şekilli eğik boyun tedavi edilmemiş hücre kültürü şişesi&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellBIND 96 kuyulu Düz Şeffaf Alt Siyah Polistiren Mikroplakalar</td><td>Corning</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>Sayım Hücre Sayma Odası Slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Kontes II FL Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td><td></td></tr><tr><td>Decon CiDehol 70 İzopropil Alkol Çözeltisi&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>04-355-71</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Petri Kapları</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Ortamı (Glikoz yok, glutamin yok, fenol kırmızısı yok)</td><td>ThermoFisher</td><td>A14430-01</td><td>Glikozsuz ortam</td></tr><tr><td>DPBS (Kalsiyum Yok, Magnezyum Yok)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>EBM Endotel Hücre Büyümesi Bazal Ortam, Fenol Kırmızı İçermez, 500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3129</td><td></td></tr><tr><td>STX2 elektrotlu EVOM2 Epitelyal Volt / Ohm (TEER) Metre</td><td>Dünya Hassas Aletleri</td><td>NC9792051</td><td>Epitelyal voltohmmetre&nbsp;</td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat &ndash; dekstran (wt 20.000)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>FD20-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat &ndash; dekstran (ağırlık 70,000)</td><td>Millipore Sigma</td><td>FD70S-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorview FV3000 Konfokal Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>Gaz Tankı (%95 N<alt>2</alt>, %5 CO<alt>2</alt>)</td><td>Airgas</td><td>X02NI95C2003071</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı yok)</td><td>Thermofisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihidroklorür, Trihidrat - Suda 10 mg / mL Çözelti</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Astrositleri</td><td>Bilim Hücresi</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Beyni Vasküler Perisitler</td><td>Bilim Hücresi</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Hipoksi İnkübatör Odası</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>27310</td><td></td></tr><tr><td>Image-iT Yeşil Hipoksi Reaktifi</td><td>ThermoFisher</td><td>I14834</td><td></td></tr><tr><td>Perisit Orta</td><td>Bilim Hücresi</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Birincil İnsan Beyni Mikrovasküler Endotel Hücreleri</td><td>ACBRI 376</td><td>Hücre Sistemleri</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan Platform Çalkalayıcı, Çift</td><td>VWR</td><td>10860-658</td><td></td></tr><tr><td>Tek Akış Ölçer</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>27311</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Mikroplaka Okuyucu Moleküler</td><td>Cihazlar</td><td>75886-128</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtresi, 25 mm, 0.22 &mu; m, PVDF, Steril</td><td>NEST Scientific</td><td>380121</td><td></td></tr><tr><td>TPP Çok Kuyulu Plakalar (6 oyuklu)</td><td>MidSci</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>TPP Doku Kültürü Şişeleri T-75</td><td>Şişeleri MidSci</td><td>TP90075</td><td>Hücre yapışması için aktive edilmiş yüzeyli şişeler</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0.25), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distile Su</td><td>İnvitrojeni (Yaşam Teknolojileri)</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Uno Sahne Üst İnkübatör-Oko</td> <td>Lab</td><td>UNO-T-H-CO2-TTL</td><td></td></tr></tbody></table>

İskemik İnme in vitro Çalışması için İnsan kan-beyin bariyerinin Üçlü birincil hücre kültürü modeli

A Triple Primary Cell Culture Model of the Human Blood-Brain Barrier for Studying Ischemic Stroke In Vitro

İskemik inme, sınırlı tedavi seçenekleri ile dünya çapında önemli bir ölüm ve sakatlık nedenidir. İskemik inmenin nöropatolojisi, hücre ölümüne ve bilişsel işlev bozukluğuna yol açan beyne giden kan akışında bir kesinti ile karakterizedir. İskemik inme sırasında ve sonrasında, kan-beyin bariyeri (BBB) disfonksiyonu yaralanma ilerlemesini kolaylaştırır ve zayıf hasta iyileşmesine katkıda bulunur. Mevcut BBB modelleri öncelikle endotel monokültürlerini ve astrositler veya perisitlerle çift ortak kültürleri içerir.
Bu tür modeller, hücreden hücreye iletişim için gerekli olan dinamik bir beyin mikro çevresini tamamen taklit etme yeteneğinden yoksundur. Ek olarak, yaygın olarak kullanılan BBB modelleri genellikle ölümsüzleştirilmiş insan endotel hücrelerini veya translasyonel sınırlamalar oluşturan hayvan kaynaklı (kemirgen, domuz veya sığır) hücre kültürlerini içerir. Bu yazıda, iskemik beyin hasarının in vitro olarak araştırılmasını sağlayan, sadece primer insan hücrelerini (beyin mikrovasküler endotel hücreleri, astrositler ve beyin vasküler perisitleri) içeren yeni bir iyi yerleştirme tabanlı BBB modeli açıklanmaktadır. 
Oksijen-glukoz yoksunluğunun (OGD) bariyer bütünlüğü üzerine etkileri pasif geçirgenlik, transendotelyal elektriksel direnç (TEER) ölçümleri ve hipoksik hücrelerin doğrudan görüntülenmesi ile değerlendirildi. Sunulan protokol, BBB'nin hücreler arası ortamını in vivo olarak taklit eden belirgin bir avantaj sunarak, iskemik beyin hasarı ortamında yeni terapötik stratejiler geliştirmek için daha gerçekçi bir in vitro BBB modeli olarak hizmet vermektedir.

Astrositlerin ve perisitlerin HBMEC'nin bariyer fonksiyonu üzerindeki etkilerini incelemek için, HBMEC monokültürü ve kontrol olarak iki çift ko-kültür modeli ile birlikte hücre kültürü ekleri üzerinde üçlü hücre kültürü BBB modelini (Şekil 1A) oluşturduk (Şekil 1B). Çift ko-kültür kontrolleri, HBMEC'nin HA ile temassız bir ortak kültürünü ve HBMEC'nin HBVP ile temas ortak kültürünü içeriyordu. Ko-kültürde 6 gün kaldıktan sonra, tüm deney düzenekleri 4 saat boyu...

Burada, birincil insan beyni mikrovasküler endotel hücrelerine, astrositlere ve perisitlere dayanan kan-beyin bariyerinin üçlü hücre kültürü modelini oluşturma yöntemini açıklıyoruz. Bu çok hücreli model, in vitro iskemik inme sırasında nörovasküler birim disfonksiyonunun incelenmesi veya ilaç adaylarının taranması için uygundur.

İskemik İnme In Vitro Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli

Ischemic stroke is a major cause of death and disability worldwide with limited therapeutic options. The neuropathology of ischemic stroke is ...

Protokolümüz, inme sonrası iyileşmeyi etkileyen karmaşık hücresel mekanizmaların incelenmesi için insan kan-beyin bariyerini in vitro olarak daha iyi özetleme ihtiyacını kabul etmektedir. Üçlü modelimiz, kısmen kuyu uçlarının büyük bölümlenmesiyle ilgili sağlam bir bütünlük sergileyerek değişim sıklığını azaltmamıza ve popülasyonların bozulmasını önlememize olanak tanır. Modelimiz, iskemik inme sırasında ve sonrasında kan-beyin bariyerinde meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri incelemek için harika bir araçtır.Protokolümüz, inme sonrası iyileşmeyi iyileştirmek için yeni hedeflerin ve terapötiklerin keşfedilmesine izin verir. İskemik inme için mevcut tedaviler zamana duyarlıdır ve sonuç olarak her zaman etkili değildir. T75 kültür şişelerinde HBVP'yi, birleşene kadar% 5'lik bir karbondioksit inkübatörü içinde% 5 karbondioksit inkübatörü içinde hücre yapışması için aktif bir yüzeye sahip olarak yetiştirerek başlayın.Birleşmeye ulaşıldıktan sonra, eski perisit ortamını aspire edin ve hücreleri beş mililitre ılık Dulbecco'nun PBS'si ile yıkayın. Dulbecco'nun PBS'sini aspire edin ve dört mililitre sıcak tripsin EDTA çözeltisi ve bir mililitre Dulbecco'nun PBS'sinin bir komb

a-triple-primary-cell-culture-model-human-blood-brain-barrier-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Bu video, insan beyni perisit, astrosit ve endotel hücrelerinin birlikte kültürlenmesini göstermektedir. Her hücre katmanı ayrı ayrı oluşturulur ve daha sonra birlikte kültürlenir, böylece kan-beyin bariyerinin hücresel düzenlemesini taklit eden üç katmanlı bir sistem...

İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Hücre Kültürü Modelinin Geliştirilmesi

Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Bu yordamı genel amacı fare modelleri iskemik inme kan - beyin bariyerini bozulma vivo içinde değerlendirmesi için son derece tekrarlanabilir bir teknik sağlamaktır.

Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Burada bir içinde cellulo BBB (kan beyin bariyerini) ayarını açıklayan bir iletişim kuralı mevcut-Minibrain polyester geçirgen membran kültür taşıma biomolecules veya enfeksiyöz ajanlar arasında bir insan BBB değerlendirmek için sistem eklemek ve onların komşu beyin hücreleri üzerinde fizyolojik etkisi.

Bariyer geçişleri patojenler veya ilaçlar ve onların etkileşim beyin ile çalışmak için bir insan kan-beyin arabirim modeli

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Bu protokol, in vitro model bir insan kan-beyin bariyeri (BBB) oluşturmak için bir yöntem açıklar. Endotel hücreleri ve perisitler bir kesici uç filtrenin (kan bölmesi) her iki tarafına ekilir ve astrositler alt kuyucuğa (beyin bölmesi) ekilir. Karakterize edilen model, nanopartikül taşıma deneyleri için kullanılmıştır.

İnsan Kan-Beyin Bariyerini Modelleyen Üçlü Kültür Hücre Sistemi

Kan-beyin bariyeri (BBB), istikrarlı ve sağlıklı bir beyin ortamının sürdürülmesinde çok önemli bir role sahiptir. BBB disfonksiyonu birçok nörolojik hastalıkla ilişkilidir. Serebrovasküler patolojiyi, BBB bütünlüğünü ve BBB'nin genetik ve hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini araştırmak için BBB'nin 3 boyutlu, kök hücre türevli bir modelini geliştirdik.

Nörolojik Hastalığı Modellemek ve Terapötik Olarak Hedeflemek için İn Vitro Kan-Beyin Bariyerinin Yeniden Yapılandırılması

Öğrenin, insan kan-beyin bariyerinin üçlü birincil hücre kültürü modelini in vitro iskemik inme çalışmaları için nasıl kuracağınızı. Bu yöntem, inme sonrası iyileşme mekanizmalarını araştırmak ve ilaç adaylarını taramak için değerlidir.

İskemik İnme In Vitro Çalışması için İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Birincil Hücre Kültürü Modeli

Daha fazla video keşfet