Düşük Bolluktaki Proteinlerin Hedeflenen Kütle Spektrometrisine Dayalı Protein Analizinde Mikro Örnekleme

Bu protokol, afinite temizliği ve protein proteolizi için boncukların nasıl hazırlanacağı ve bunların kurutulmuş mikro örneklerden düşük bolluktaki proteinlerin belirlenmesinde nasıl kullanılacağı konusunda adım adım genel bir bakış sunar. Başlıca avantajı, çok küçük hacimlerden karmaşık numunelerin son derece verimli bir şekilde örneklenmesini hazırlamak ve gerçekleştirmek için size araçlar verilmesidir. Bu yöntem, proteini veya proteotipik peptidi yakalamak için etkili antikorlara erişiminiz olduğu sürece diğer protein biyobelirteçlerine uyarlanabilir.

Antikorun asit tedavisi için pH'ı ayarlarken, özellikle de az miktarda boncuk hazırlarsanız, çok dikkatli olmanız gerekir. Başlamak için, istenen hacimdeki antikor çözeltisini beş mililitrelik düşük proteinli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve antikor çözeltisine küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin. PH'ı ölçmek için mikroelektrotlu bir pH metre kullanın ve önce 10 mikrolitre bir molar hidroklorik asit ekleyerek ve ardından pH 2.5'e yaklaştıkça hacmi azaltarak pH'ı ayarlayın.

PH'ı 2,5'e ayarlamak için gerekli olan bir molar hidroklorik asidin toplam hacmini kaydedin. Mikroelektrodu çıkarın ve asitlenmiş antikoru buz üzerinde, manyetik bir karıştırıcı üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Antikor çözeltisini nötralize etmek için, pH'ı ölçün ve önce 10 mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ekleyerek ve ardından pH yediye yaklaştıkça sodyum hidroksit hacmini azaltarak yediye ayarlayın.

Eklenen bir molar sodyum hidroksitin toplam hacmini kaydedin. Manyetik boncuk süspansiyonunu bir vorteks karıştırıcı üzerinde iyice karıştırın ve istenen miktarda boncuk süspansiyonu içeren bir hacmi geri çekin. Örneğin, bir mililitre boncuk süspansiyonu hazırlamak için, 20 miligram boncuk içeren bir hacmi geri çekin.

Boncuk süspansiyonunu bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları eşit miktarda tip I su ile iki kez yıkayın ve yıkama çözeltisinin her ilavesinden sonra bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın. Ardından, çözeltiyi bir dakika boyunca manyetik bir rafa tekrar yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın.

Manyetik boncuklara antikor eşleşmesi için asitle muamele edilmiş antikor, 0.5-molar borat tamponu ve kuplaj tamponu ekleyin. Bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın ve tercihen karşılıklı dönüş ve titreşimle uçtan uca bir numune karıştırıcı kullanarak gece boyunca ortam sıcaklığında döndürün. Ardından, 239 g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Tüpü iki dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları yıkadıktan sonra, tüpü bir dakika boyunca mıknatısın üzerine tekrar yerleştirin ve süpernatanı çıkarmak için aynı prosedürü izleyin. Bunu, bir buzdolabında istenen boncuk stok konsantrasyonunu kullanarak istediğiniz tamponda saklayın.

10 mikrolitrelik bir volümetrik absorptif mikro örneklemede veya VAMS'ta 10 mikrolitre serumun toplanmasına izin verin, üreticinin yönergelerini kullanarak uç alın ve ortam sıcaklığında en az iki saat boyunca hava ile kurutun. VAMS'yi tutucudan çıkarın ve iki mililitrelik düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. 1.000 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat çözeltisi ekleyin ve 1.000 rpm'de sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı kullanarak 22 santigrat derecede bir saat boyunca VAMS'yi çıkarın.

Ekstraktı triptik proteoliz için yeni bir 1.5 mililitre düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sindirimi başlatmak için her VAMS ekstraktına 30 mikrolitre yıkanmış tripsin boncukları ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı veya benzeri bir karıştırıcı kullanarak 37 santigrat derece ve 1.000 rpm'de iki saat boyunca inkübe edin. Beş dakika boyunca 2.655 g'da santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir iki mililitrelik düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

100-milimolar amonyum bikarbonat çözeltisinde kararlı izotop etiketli peptidi içeren mililitre iç standart veya IS, çözeltisi başına 25 mikrolitre 14 nanogram ekleyin. Sindirilmiş bir VAMS özü ve IS içeren her düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne iki adet 20 mikrolitre yıkanmış manyetik boncuk süspansiyonu ekleyin. Ortam sıcaklığında uçtan uca bir numune karıştırıcı kullanarak immünoekstraksiyonu bir saat boyunca gerçekleştirin. Manyetik boncukları% 0.05 polisorbat 20 ile 500 mikrolitre PBS ekleyerek yıkayın.

Boncuk ve yıkama çözeltisi içeren düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpünü manyetik raftan çıkarın ve homojen olana kadar dikkatlice ters çevirin. Ardından, düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpünü mıknatısın üzerine 30 saniye boyunca yerleştirin, 30 saniye boyunca ters çevirin ve bir dakika boyunca mıknatısın üzerine tekrar yerleştirin. Yıkama solüsyonunu çıkarın ve manyetik boncukları PBS, tris hidroklorik asit ve amonyum bikarbonat ile tekrar yıkayın.

Her numuneye tip I suya 15 mikrolitre% 2 formik asit ekleyin ve yakalanan peptitleri ortadan kaldırmak için sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı veya benzeri bir şey kullanarak 22 santigrat derece ve 1.000 rpm'de beş dakika boyunca inkübe edin. Elüatı mıknatısın üzerine bir dakika boyunca yerleştirdikten sonra, yeni bir 1.5 mililitrelik düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir kez tekrarlayın ve ikinci elüatı ilk elüat ile aynı düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Her bir elüata 20 mikrolitre 100 milimolar amonyum bikarbonat ekleyin. Santrifüj edin ve 40 mikrolitre elüatı HPLC şişeleri için mikro uçlara aktarın. Cihaz yazılımında, kolon fırın sıcaklığını 25 santigrat dereceye ve akış hızını dakikada 50 mikrolitreye ayarlayın.

Ardından, örnekleri otomatik numune alma cihazına yerleştirin. LC-MS/MS sistemi için mevcut yazılımı kullanarak çalıştırılacak numuneleri içeren bir dizi hazırlayın ve enjeksiyon hacmini 10 mikrolitreye ayarlayın. Sekansı başlatmak için enstrüman yazılımında Run Sequence (Diziyi Çalıştır) düğmesine basın ve benzeşim yakalanan, ProGRP'ye özgü, triptik peptidin ve IS'sinin tepe alanını kaydedin. VAMS ve kurutulmuş serum lekesi veya DSS, örnekleme sonrası proteotipik peptit ve IS'nin kütle spektrometresi veya MS kromatogramları ve ayrıca doğrudan ekstraksiyon çözeltisine eklenen çivili bir serum örneği için burada gösterilmiştir.

ProGRP ile çivilenmiş ve VAMS, DSS veya doğrudan ekstraksiyon çözeltisine uygulanan serum örnekleri için proteotipik ProGRP peptidinin IS'ye pik alan oranının temsili sonuçları bu şekilde gösterilmiştir. Bu sonuçlardan, VAMS'nin kontrol numunesi ile benzer alan oranları sağladığı, örnekleme malzemesinde kayıp olmadığını gösterirken, DSS'nin örnekleme malzemesinde kaybı gösteren önemli ölçüde daha düşük bir alan oranı sağladığı görülebilir. Bu şekilde, bozulmamış protein ekstraksiyonu ve proteotipik epitop peptid ekstraksiyonundan sonra baz pik kromatogramlarının karşılaştırılması sunulmuştur.

Antikor veya enzim kaplı boncukları kendiniz hazırlarken, boncukları özel ihtiyaçlarınızı karşılayacak şekilde uyarlayabilirsiniz. Bu, hedeflenen protein tayini ve küresel proteomik analiz için geçerlidir. VAMS ve kurutulmuş kan lekelerinden protein tayininde hassas yöntemler, daha geniş bir hastalık yelpazesinin takibinde hastane dışı testler gibi hasta odaklı yaklaşımları mümkün kılmaktadır.