Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi
19 Mayıs 2023
Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.
Uzun süreli ve kısa süreli hematopoetik kök hücre veya HSC izolasyon yöntemi, araştırmacıların HSC bölmesindeki heterojenitenin hücre yenileme mekanizmalarını ve biyolojik temelini daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır. Uzun süreli HSC'lerin özel bir belirteci olabilecek bir transkripsiyon faktörü olan Hoxb5 tanımlandı. Buna dayanarak, bir Hoxb5 muhabirli fare hattı kuruldu ve uzun vadeli ve kısa vadeli HSC'ler başarıyla izole edildi.
Donör kemik iliği hücrelerinin toplanmasına başlamak için,% 70 etanol ile bir harç ve havaneyi sterilize edin ve tamamen kurumasını bekleyin. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS içeren takviyelerden oluşan hücre boyama tamponu olanları dengeleyin. Donör erkek Hoxb5-tri-mCherry fareden izole edilen kemikleri harç içine koyun ve hücre boyama tamponundan üç mililitre ekleyin.
Kemikleri havaneyle fırçalayın, ardından hücre kümelerini nazik pipetleme ile parçalayın ve hücre süspansiyonunu 100 mikronluk bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Çözelti berraklaşana kadar işlemi taze hücre boyama tamponu ile tekrarlayın. Genellikle, üç kez tekrarlamak net bir çözüm elde etmek için yeterlidir.
Femurları ve tibiaları CD45.1.2 konjenik fareden izole ettikten sonra, kemiklerin her iki ucunu keskin steril makasla kesin. Buz gibi soğuk hücre süspansiyon tamponu ile doldurulmuş beş mililitrelik bir şırınga ile donatılmış 23 gauge bir iğne kullanarak, kemik iliğini hücre süspansiyon tamponu içeren steril bir hücre kültürü kabına yıkayın. Hücre kümelerini nazik pipetleme ile ayrıştırın, ardından P1000 pipet kullanarak hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin.
Geçit kurulumu için, metinde verilen talimatları izleyerek numuneyi hazırlayın ve 400 mikrolitresini 35 mikron hücre süzgeci çıtçıtlı kapağı olan yuvarlak tabanlı bir polistiren test tüpüne aktarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek analizden önce ölü hücre germe reaktifini hazırlayın ve numuneye ekleyin. Ardından, akış sitometresini açın ve üreticinin talimatlarını izleyerek analiz yazılımını başlatın.
Ardından, verileri almaya başlamak için Yükle'ye basın. Çiftleri, ölü hücreleri ve soy-pozitif hücreleri hariç tuttuktan sonra, soy-negatif, c-kit-pozitif, Sca-1-pozitif fraksiyonu açın. Ardından, Flk2-pozitif fraksiyonu dışarı çıkarın.
Daha sonra CD150-pozitif, CD34-negatif veya düşük fraksiyondaki Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC'leri açın. Daha sonra,% 10 ısı ile inaktive FBS ile desteklenmiş, 600 mikrolitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS içeren 1,5 milimetrelik düşük proteinli bir bağlama tüpü hazırlayın. Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC sıralamayı gerçekleştirmek için, hazırlanan 1.5-mililitre düşük proteinli bağlama tüpünü bir sıralama toplama cihazına ayarlayın ve daha önce bahsedilen geçit stratejisini kullanarak Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC'leri tüpe sıralayın.
İlk sıralamada, sıralama hassasiyeti modundaki verimi kullanın. 96 delikli plakayı, otomatik hücre biriktirme ünitesi aşamasında önceden hazırlanmış destekleyici hücrelerle ayarlayın. Ardından, 1,5 mililitrelik düşük proteinli bağlama tüpünü akış sitometresinin yükleme portuna ayarlayın.
Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC'leri, daha önce bahsedilen geçit stratejisini kullanarak destekleyici hücrelerle birlikte 96 delikli plakaya sıralayın. Kendi kendini yenileme kapasitelerini test etmek için 10 Hoxb5-pozitif veya Hoxb5-negatif pHSC'yi sıralayın. Donör Hoxb5-tri-mCherry farelerinin kemik iliği analizinin akış sitometri grafikleri, soy negatif, c-kit pozitif, Sca-1-pozitif, CD150-pozitif, CD34-negatif veya düşük, Flk2-negatif ile tanımlanan pHSC fraksiyonundaki hücrelerin yaklaşık% 20 ila 25'inin Hoxb5-pozitif pHSC'ler olduğunu ortaya koymuştur.
Burada, alıcı farelerin periferik kan analizinin temsili akış sitometri grafikleri gösterilmiştir. Ayrıca, primer transplantasyondan sonra alıcı farelerin periferik kan analizi, Hoxb5-pozitif ve Hoxb5-negatif pHSC'lerin transplantasyondan dört hafta sonra benzer donör kimerizmi sunmasına rağmen, sadece Hoxb5-pozitif pHSC alıcılarında sürekli hematopoez gözlendiğini ortaya koymuştur. Hoxb5 negatif HSC'ler transplantasyondan sekiz hafta sonra hematopoetik hücre üretme yeteneğini kaybetmeye başladı.
Sekonder transplantasyon analizinde sadece Hoxb5 pozitif pHSC alıcılarında sağlam hematopoez saptandı. Buna karşılık, Hoxb5-negatif pHSC alıcı farelerde donör hücreler neredeyse hiç gözlenmedi, bu da Hoxb5-negatif pHSC'lerin primer transplantasyondan sonraki 16 hafta içinde kendini yenileme yeteneğini kaybettiğini düşündürdü. Bu protokol genellikle dokuz ila 12 saat sürer, bu nedenle hücre canlılığını korumak için numuneyi prosedürler boyunca mümkün olduğunca dört santigrat derecede tutmak önemlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bir Hoxb5 raporlayıcı sistemi kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. İzolasyon yöntemi, hücre yenilenme mekanizmalarının ve HSC kompartmanı içindeki heterojenliğin biyolojik temelinin anlaşılmasını geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Hematopoetik kök hücre biyolojisi
- Hücre yenilenme mekanizmaları
- Kök hücre heterojenliği
Arka Plan
- Hoxb5, LT-HSC'ler için potansiyel bir özel markör olarak tanımlanmıştır.
- Hedefli izolasyon için Hoxb5-reporter farelerin oluşturulması.
- Daha iyi bir anlayış için spesifik HSC popülasyonlarını izole etmenin önemi.
Kullanılan Yöntemler
- Kemik iliği izolasyon teknikleri.
- Hücre ayırma için akış sitometrisi.
- Kendi kendini yenileme kapasitesini değerlendirmek için P93 tabanlı analiz.
Temel Sonuçlar
- Hoxb5-pozitif ve Hoxb5-negatif pHSC'lerin başarılı izolasyonu.
- Transplantasyon sonrası kendini yenileme kapasitesi farklarının gösterilmesi.
- Hoxb5-negatif pHSC'lerin zamanla hematopoetik potansiyellerini kaybettiklerine dair kanıtlar.
Sonuçlar
- Bu protokol, HSC özelliklerinin ve davranışlarının incelenmesine yardımcı olur.
- Kök hücre işlevselliğinin anlaşılmasında Hoxb5'in önemini vurgular.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Alanları
Uzun dönemli ve kısa dönemli hematopoetik kök hücrelerin (HSC'lerin) güvenilir şekilde izole edilmesi, erken aşama keşiflerdeki risklerin azaltılması ve kök hücre biyolojisindeki fonksiyonel heterojenliğin netleştirilmesi açısından kritik öneme sahiptir. Hoxb5 raporlayıcı sistemi, LT-HSC'lerin ve ST-HSC'lerin hassas bir şekilde ayrıştırılmasına olanak tanıyarak kendini yenileme ve soy potansiyeli değerlendirmelerinde öngörüsel güveni destekler. Bu yetkinlik, hematopoetik araştırma süreçlerinde hedef doğrulamayı güçlendirir ve riske göre ayarlanmış portföy kararlarına temel oluşturur.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- HSC popülasyonlarındaki kendini yenileme mekanizmalarının ve soy yanlılığının sorgulanmasına olanak tanır.
- Hoxb5 ekspresyonu kullanarak LT-HSC'leri ST-HSC'lerden ayırarak fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Aşağı akış analizleri için biyolojik olarak farklı HSC alt kümelerini izole ederek mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Tekrarlanabilir in vitro ve in vivo assayler için valide edilmiş HSC popülasyonları sağlar.
- Akış sitometrisi aracılığıyla tutarlı gating ve sıralama stratejilerine olanak tanıyarak assay standardizasyonunu geliştirir.
- Transplantasyon sonrası kendi kendini yenileme ve farklılaşma çıktılarının kantitatif ölçümünü destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel çalışmalar için izole edilen HSC alt kümelerini hastalıkla ilgili modellerle hizalar.
- Uzun süreli engraftmanı ve hematopoetik çıktıyı takip ederek, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Tanımlanmış HSC girdi popülasyonları sağlayarak preklinik modellerdeki biyolojik belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Hoxb5 tabanlı bu izolasyon yöntemi, hematopoetik araştırmalardaki hipotez testlerini, hedef doğrulamasını ve mekanistik çalışmaları destekleyerek, keşiften preklinik aşamaya kadar uzanan sürekliliğe entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Fonksiyonel olarak farklı HSC'leri izole ederek kendi kendini yenileme ve farklılaşma yolaklarını netleştirir.
- Tarama: HSC fonksiyonunu ve soy potansiyelini değerlendirmek için tekrarlanabilir, kantitatif çıktılar sağlar.
- Analitik: HSC alt kümeleri arasında tutunma ve kendi kendini yenilemenin istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: HSC biyolojisinin hastalık modelleri ve biyobelirteç geliştirme ile uyumlandırılmasını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Araştırma programları genelinde HSC izolasyonu için standartlaştırılmış, yeniden kullanılabilir bir iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: HSC fonksiyonu ve hedef doğrulama konusundaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: HSC izolasyonunun ve sonraki analizlerin tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken evre araştırmalardaki mekanistik belirsizliği azaltarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hematopoetik hedeflerin ve modellerin risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Akış sitometrisi ve hücre ayıklama tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Hoxb5 reporter fare hatlarına ve uyumlu analitik altyapıya erişim gerektirir.
- Gating ve ayıklama protokollerinin ekipler arası titiz bir şekilde standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı fare suşları veya model sistemler için adaptasyon gerektirebilir.
- Güvenilir sonuçlar elde etmek için örnek canlılığı süreç boyunca 4°C'de korunmalıdır.
