A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Caixing Xiong; Dwight Baker; Patricia Pietrantonio

doi:10.3791/64505

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kals...

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biochemistry

A “Dual-Addition” Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Full Text

2,761 Views

08:46 min

December 2, 2022

DOI: 10.3791/64505-v

Caixing Xiong¹, Dwight Baker², Patricia Pietrantonio¹

¹Department of Entomology,Texas A&M University, ²Department of Biochemistry and Biophysics,Texas A&M University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.

Yüksek Verimli tarama kalsiyum floresan çift ilaveli test, hücre içi kalsiyum kaskad yoluyla sinyal veren bir G proteinine bağlı reseptörün yeni küçük molekül ligandlarının tanımlanmasına izin verir. İkili toplama testinin temel avantajı, floresan sinyalinin iki dakika sürmesi koşuluyla aynı hücrelerle tek bir tahlilde agonist ve antagonist HTS'nin saptanmasıdır. Bu yöntem, eklembacaklı nöron peptid ailesinin, bir GPCR'nin çoğunu içeren kalsiyum kaskad yoluyla sinyal veren herhangi bir GPCR'ye uygulanabilir.

Tahlil tekrarlanabilirliği için, ikinci baskı için bilinen agonistin hücre yoğunluğunu, enjeksiyon hızını ve konsantrasyonunu optimize etmek önemlidir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırma görevlisi olan Bianca Henriques-Santos olacak. Kalsiyum floresan tahliline, harcanan ortamı% 70 ila% 90 oranında akıcı BMLK üç hücre içeren T-75 şişesinden çıkararak başlayın.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Explore More Videos

Biyokimya Sayı 190