Name: Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden nöro retina organoidleri üretmek için yapışkan ve süspansiyon kültür yöntemlerini. Bu protokol, retina dejeneratif hastalıklarının araştırılması ve hücre bazlı tedaviler için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Genetikçi Dr. Chitra Kannabiran'ın bilimsel ve teknik desteğini kabul ediyor; Dr. Subhadra Jalali, Retina Danışmanı; Dr. Milind Naik, Oküloplastik Cerrah; ve Dr. Swathi Kaliki, LV Prasad Göz Enstitüsü, Haydarabad'da Oküler Onkolog normal ve hastaya özgü iPSC hatlarının oluşturulmasına doğru. Yazarlar, Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Bilim ve Teknoloji Bölümü (IM), (SB / SO / HS / 177/2013), Biyoteknoloji Bölümü (IM), (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) ve ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) ve CSIR (V.K.P.), Hindistan Hükümeti'nden Kıdemli Araştırma Burslarından Ar-Ge hibelerini kabul etmektedir.

<ol><li>Dandona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+visual+impairment+in+India%3A+the+Andhra+Pradesh+Eye+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li>
<li>Sen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+retinitis+pigmentosa+in+South+Indian+population+aged+above+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years.</a> Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).</li>
<li>Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trend+of+retinal+diseases+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Trend of retinal diseases in developing countries.</a> Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).</li>
<li>RetNet - Retinal Information Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet/">https://sph.uth.edu/retnet/</a> (2022).</li>
<li>Cicero, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinitis+pigmentosa%3A+retinal+organoids+generated+from+the+iPSCs+of+a+patient+with+the+USH2A+mutation+show+early+developmental+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361(2019).</li>
<li>Lane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+and+rescue+of+RP2+Retinitis+pigmentosa+using+iPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).</li>
<li>Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinitis+pigmentosa+through+patient-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100438(2021).</li>
<li>Gonzalez-Cordero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).</li>
<li>Meyer, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+vesicle-like+structures+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+facilitate+a+customized+approach+to+retinal+disease+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment.</a> Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Lamba, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-based+retinal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.</a> Bio-Protocol. 8 (12), 2882(2018).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communications. 5, 4047(2014).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95(2019).</li>
<li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

Tüm yazarların çıkar çatışması veya finansal açıklamaları yoktur.

hiPSC'ler in vitro organ ve doku gelişimini incelemek için güçlü bir araçtır. Sağlıklı ve hastalığa özgü hiPSC'leri retina soyuna doğru ayırt ederek hastalık fenotipinin özetlenmesi, kalıtsal retina distrofilerinin farklı formlarının patofizyolojisi hakkında daha yeni bilgiler edinilmesine yardımcı olabilir. PSC'lerin retinal hücre tiplerine in vitro farklılaşması için çeşitli protokoller tanımlanmış ve benimsenmiştir. Bunların çoğu, rekombinant büyüme faktörlerinin, takviyelerin, küçük moleküllerin ve ...

Retina, omurgalı gözün arkasında bulunan ve ışık sinyallerini foto-transdüksiyon yolu olarak bilinen biyokimyasal bir fenomenle sinir uyarılarına dönüştüren ışığa duyarlı bir dokudur. Retinanın fotoreseptör hücrelerinde üretilen ilk sinir uyarıları, diğer retinal internöronlara ve retinal ganglion hücrelerine (RGC'ler) dönüştürülür ve beynin görsel korteksine ulaşır, bu da görüntü algısına ve görsel tepkiye yardımcı olur.
Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, 1 milyonu Asya'da olmak üzere tahmini 1,5 milyon çocuk kördür. Kalıtsal Retina Distrofisi (IRD), dünya çapında 4.000 kişiden 1'ini etkileyen majör bir körleme hastalığıdır 1,2,3, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ile ilişkili körlük prevalansı gelişmekte olan ülkelerde %0,6-%1,1 arasında değişmektedir 4. IRD'ler, retina gelişimi ve fonksiyonunda rol oynayan 300'den fazla farklı gendeki kalıtsal genetik kusurlardan kaynaklanır5. Bu tür genetik değişiklikler, normal retina fonksiyonlarının bozulmasına ve retina hücrelerinin, yani fotoreseptör hücrelerin ve retina pigmentli epitelin (RPE) kademeli olarak dejenerasyonuna neden olur ve böylece ciddi görme kaybına ve körlüğe yol açar. Kornea, lens vb. ile ilgili diğer kör edici durumlarda muazzam ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, retina distrofileri ve optik sinir atrofilerinin bugüne kadar kanıtlanmış bir tedavisi yoktur. Yetişkin bir insan retinasında kök hücrelerbulunmadığından 6, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) ve hasta kaynaklı indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) gibi alternatif kaynaklar, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir tedarikini sağlayabilir ve in vitro hastalık modelleme çalışmaları için gerekli olan karmaşık doku organoidlerinin geliştirilmesi ve rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için büyük bir umut vaat edebilir7, 8,9,10.
Birkaç yıllık retinal araştırma, erken retina gelişimini düzenleyen moleküler olayların daha iyi anlaşılmasını sağlamıştır. PSC'lerden retinal hücreler ve 3D organoidler üretmek için kullanılan protokollerin çoğu, bilinen biyolojik süreçleri aşamalı bir şekilde modüle etmek için hücreleri karmaşık bir büyüme faktörleri ve küçük moleküller kokteylinde kültürleyerek bu gelişimsel olayları in vitro olarak özetlemeyi amaçlamaktadır. Bu şekilde üretilen retinal organoidler başlıca retinal hücrelerden oluşur: retinal ganglion hücreleri (RGC'ler), internöronlar, fotoreseptörler ve retina pigmentli epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Retinal organoidleri kullanarak IRD'leri modellemeye yönelik başarılı girişimlere rağmen, farklılaşma sırasında büyüme faktörlerinin ve küçük moleküllerin karmaşık kokteyline olan gereksinim ve retinal organoid üretiminin nispeten düşük verimliliği, çoğu protokolde büyük bir zorluk oluşturmaktadır. Bunlar büyük ölçüde embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından in vitro gelişimin farklı aşamalarında karmaşık kültür koşullarını kullanarak retinal soylara kademeli olarak farklılaşmalarını içerir20,21,22.
Burada, sağlıklı kontrol ve retina hastalığına özgü hiPSC'lerden kompleks 3D nöro-retinal organoidler geliştirmek için basitleştirilmiş ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Burada tarif edilen protokol, embriyoid vücut oluşumuna ihtiyaç duymadan yakın birleşimli hiPSC kültürlerinin doğrudan farklılaşmasını kullanır. Ayrıca, kültür ortamının karmaşıklığı basitleştirilmiştir, bu da onu yeni araştırmacılar tarafından kolayca benimsenebilecek uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir teknik haline getirmektedir. Retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı ilkel kümelerinin (EFP'ler) ortaya çıkmasına kadar yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrit bir kültür sistemini içerir. Ayrıca, her EFP içindeki dairesel nöro-retinal adalar, PAX6 + ve CHX10 + prolifere eden nöro-retinal öncüllerden oluşan çok katmanlı 3D retinal kaplar veya organoidler hazırlamak için 1-2 hafta boyunca süspansiyon kültürlerinde manuel olarak toplanır ve yetiştirilir. Retinal organoidlerin 100 μM Taurin içeren ortamda 4 hafta daha uzatılmış kültürü, RCVRN + ve CRX + fotoreseptör öncüllerinin ve ilkel iç segment benzeri uzantılara sahip olgun hücrelerin ortaya çıkmasına neden olmuştur.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m Şırınga filtreleri</td><td>TPP</td><td>99722&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>15 mL santrifüj tüpü</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 mL santrifüj tüpü</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu plakalar</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Chx10 Antikoru; Fare monoklonal</td><td>Santa Cruz</td><td>SC365519</td><td>1:50 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-CRX antikoru; Tavşan monoklonal</td><td>Abcam</td><td>ab140603</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-MiTF antikoru, Fare monoklonal</td><td>Abcam</td><td>ab3201</td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin Antikoru; Tavşan poliklonal&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x), serum içermez</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Temel Fibroblast büyüme faktörü (bFGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanozu (50 mL)</td><td>Tarson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC Nitelikli</td><td>Matris Corning</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>CryoTubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>V7884</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesi (bazal ortam)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA polimeraz</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0709</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s Fosfat Tamponlu</td><td>Tuzlu Termo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 orta boy kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>Etilen diamin tetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Falcon TC ile İşlem Görmüş Petri Kabı Değil, 60 mm & nbsp;</td><td>Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Cenin Ağacı&nbsp; Büyükbaş&nbsp; Serum, nitelikli, Amerika Birleşik Devletleri&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>GelDocXR+ ile Görüntü laboratuvarı yazılımı</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>Agaroz Jel dokümantasyon sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L), Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L), Alexa Fluo 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan-IgG (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>HistoCore MULTICUT</td><td>Leica</td><td></td><td>Kesitleme için</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Değiştirme</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Aksorbik asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2 ek (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>RNA</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Qualigens</td><td>23995</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetlerini ölçmek için, 9 inç, Steril Olmayan, Fişe Takılı</td><td>Olmayan Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Anti-Otx2 antikoru, Tavşan monoklonal</td><td>Abcam</td><td>ab183951</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Rekombinant Anti-PAX6 antikoru; Tavşan Monoklonal</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Rekombinant Anti-RPE65 antikoru, Tavşan Monoklonal</td><td>Abcam</td><td>ab231782</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan Noggin Proteini R</td><td>& D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler 10 mL</td><td>TPP</td><td>94010</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler 5 mL</td><td>TPP</td><td>94005</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat Tribazik dihidrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Starfrost ( silan kaplı) mikroskobik slaytlar</td><td>Knittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Birinci İplikli Sentez Sistemi</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>için</td> Birinci İplikli Sentez Sistemi 18080051 <td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>DAPI ile VECTASHIELD Antifade Montaj Ortamı&nbsp;</td><td>Vektör laboratuvarları</td><td>H-1200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vitronektin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür (Rho-kinaz inhibitörü)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Konfokal mikroskop</td></tr></tbody></table>

sağlıklı ve retina hastalığına Özgü İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden retinal organoidlerin Üretimi

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent kök hücreler, in vitro hastalık modelleme çalışmaları ve rejeneratif tedaviler geliştirmek için yararlı olan karmaşık doku organoidleri üretebilir. Bu protokol, retinal farklılaşmanın ilk 4 haftasında, farklı, kendi kendini organize eden göz alanı primordial kümelerinin (EFP'ler) ortaya çıkmasına kadar, yapışkan tek katmanlı kültürlerden oluşan hibrid bir kültür sisteminde retinal organoidlerin üretilmesinin daha basit, sağlam ve aşamalı bir yöntemini tanımlamaktadır. Ayrıca, her EFP'deki çörek şeklindeki, dairesel ve yarı saydam nöro-retinal adalar, çok katmanlı 3D optik kaplar (OC-1M) üretmek için 1-2 hafta boyunca retinal farklılaşma ortamında yapışkan olmayan kültür kapları kullanılarak süspansiyon altında manuel olarak toplanır ve kültürlenir. Bu olgunlaşmamış retinal organoidler PAX6+ ve ChX10+ proliferasyonlu, multipotent retinal öncülleri içerir. Öncü hücreler organoidler içinde doğrusal olarak kendi kendine monte edilir ve farklı radyal çizikler olarak görünür. Süspansiyon kültüründen 4 hafta sonra, retinal progenitörler post-mitotik arrest ve olgun retinal organoidleri (OC-2M) oluşturmak için soy farklılaşmasına uğrarlar. Fotoreseptör soyu işlenen öncüller, retinal organoidlerin en dış katmanlarında gelişir. Bu CRX + ve RCVRN + fotoreseptör hücreleri, iç segment benzeri uzantıları görüntülemek için morfolojik olarak olgunlaşır. Bu yöntem, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kullanılarak retinal organoidler üretmek için benimsenebilir. Tüm adımlar ve prosedürler, tekrarlanabilirliği sağlamak ve temel bilim ve çeviri araştırmalarında daha geniş uygulamalar için açıkça açıklanmış ve gösterilmiştir.

HiPSC'lerin göz soylarına farklılaşması, Şekil 1'de açıklandığı gibi, takviyeleri ve büyüme faktörlerini içeren farklı kültür ortamı kokteyllerindeki hücrelerin farklı zaman noktalarında sıralı adımlarla kültürlenmesiyle elde edilir. HiPSC kültürleri, pluripotent kök hücre bakım ortamı olan Essential 8 ortamında tutulur. % 70-80 akıcılığa ulaştıklarında (Şekil 2A), ortam 1 ng / mL bFGF, 1 ng / mL Noggin ve% 1 N2 takviyesi içeren 0. günde (adım 3.2'ye bakınız) Fa...

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Bu protokol, insan IPC'lerini araştırma ve rejeneratif uygulamalar için karmaşık üç boyutlu nöro retinal organoidlere ayırmanın basit ve etkili bir yöntemini açıklamaktadır. Bu teknik, hem retinal organoidlerin hem de RP hücrelerinin seçici olarak toplanmasına ve zenginleştirilmesine izin veren hem yapışkan hem de süspansiyon kültürlerini içerir. Retinal dejeneratif hastalıklar için hücre bazlı tedaviler geliştirmek için uygun ve düzenli bir hücre kaynağı kaynağı sağlayabilir.Bu tür kök hücre kaynaklı retinal organoidler ve RPE hücreleri, göz gelişimini ve kalıtsal retina hastalıklarını incelemek için in vitro modeller gibi yararlıdır. Bu yöntem, insan IPSC kültürlerini ele almaya aşina olan araştırma laboratuvarları tarafından kolayca çoğaltılabilir. Görsel gösterim, göz alanlarının tanımlanmasını ve nöro retinal bardakların mekansal konumlarına ve morfolojik özelliklerine göre izole edilmesini büyük ölçüde desteklemektedir.Başlamak için, harcanan ortamı% 70 ila% 80 arasında aspire edin.İnsan IPSC kültürleri altı kuyucuklu plakalarda. Kuyucuklara PBS ekleyin, onları döndürün ve yıkama tamponunu aspire edin. Daha sonra her bir kuyucuğa bir mililitre hücre ayrışma çözeltisi veya CDS ekleyin ve hücreler toplanana kadar plakayı beş ila yedi dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.CDS'yi aspire edin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplayın. Tüpü oda sıcaklığında dört dakika boyunca 1.000 RPM'de döndürün. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1.2 mililitre Essential 8 ortamında yeniden askıya alın.1,5 mililitre IPSC kültür ortamı ve 10 mikromolar Y27632 içeren matris kaplı altı delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın. 12 ila 24 saat sonra, harcanan ortamı çıkarın ve kültürleri korumak için Y27632 olmadan önceden ısıtılmış tam yükseliş ortamı ekleyin. Kültürler% 70 ila% 80 birleşime ulaşana kadar her 24 saatte bir kültür ortamını değiştirin.Sıfır gününde, insan IPSC bakım ortamını aspire edin ve altı kuyucuklu plakaya mililitre BFGF başına bir nanogram ve mililitre Noggin başına bir nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin. Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. İlk gün, harcanan ortamı aspire edin ve mililitre BFGF başına bir nanogram ve mililitre Noggin başına 10 nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin.Hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede tekrar inkübe edin. İkinci ve üçüncü günde, harcanan ortamı çıkarın ve mililitre Noggin başına 10 nanogram içeren farklılaşma indüksiyon ortamı ekleyin. Altı delikli bir plakaya kuyu ortamı başına iki mililitre ekledikten sonra, hücreleri% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin ve ortamı her 24 saatte bir değiştirin.Dördüncü günde, harcanan ortamı çıkarın ve retinal farklılaşma ortamını veya RDM'yi ekleyin. Altı delikli bir plakaya kuyu ortamı başına iki mililitre eklemek ve kültürleri inkübe etmek için aynı prosedürü izleyin. Ortamı her gün değiştirin.14. ve 18. günlerde, erken göz alanı progenitörlerinden oluşan nöral rozet benzeri alanların ortaya çıkması için kültürleri mikroskop altında 10X büyütmede gözlemleyin. 21 ve 28. günlerde, nöro epitel ve oküler yüzey epitelinin bitişik çıkıntıları ile çevrili merkezi bir dairesel 3D nöro retinal yapı adası ile kendi kendini organize eden farklı EFP'lerin ortaya çıkışını gözlemlemek için kültürleri mikroskop altında 4X ve 10X büyütmede gözlemleyin. Steril bir Pasteur pipet alın ve tabanı bir elinizde ve kılcal ucu diğer elinizde tutun.Alev, kılcal ucun ortasına yakın bölgeyi, cam esnek hale gelene kadar dönme hareketleriyle sterilize eder ve ısıtır. Ardından alevden uzaklaşın ve kapalı lümenli ince bir kılcal uç oluşturmak için kılcal ucu hızla dışarı doğru çekin. İnce ucu alevin önünde yatay olarak tutun ve pürüzsüz bir kanca veya L şeklinde bir kılcal uç oluşturmak için alevin içinden dışa doğru bir hareketle hızla geçirin.Bir stereo mikroskop altında, kılcal kancanın pürüzsüz dış eğrilik bölgesini ince bir kepçe olarak kullanarak iyi biçimlendirilmiş nöro retinal kapları bireysel EFP'lerden manuel olarak seçin. 25. ve 30. günlerde, kültüre düşük bir bağlantı 60 milimetrelik bir kapta dört mililitre önceden ısıtılmış retinal farklılaşma ortamı ekleyin ve 3D retinal organoidler üretmek için retinal kapları koruyun. Bu, nöro retinal bardakların toplanmasından önce yapılmalıdır.100 mikrolitreyi aspire etmek için bir milimetrelik bir mikropipet ayarlayın ve yüzen retinal kapları aspire etmek ve daha önce hazırlanan taze, düşük yapışkanlı kültür yemeklerine aktarmak için geniş delikli açıklıklara sahip bir mililitre mikro uç kullanın. RDM'deki retinal kapları yapışkan olmayan süspansiyon kültürleri olarak tutun ve% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. 30. ve 45. günlerde, kısmi bir besleme yöntemini izleyerek, harcanan ortamın hacminin yarısını çıkarın ve eşit miktarda taze ortam ile değiştirin.45. ve 60. günlerde, nöro retinal progenitörlerin daha iyi sağkalımını ve soy farklılaşmasını ve olgun retinal hücre tiplerinin gelişimini desteklemek için 100 mikromolar taurin içeren RDM'de retinal organoidleri iki hafta daha kültürleyin. Retinal organoidler, RT-PCR ve immünohistokimya kullanılarak çeşitli retinal progenitör belirteçlerin ekspresyonu için olgunlaşmanın farklı aşamalarında karakterize edilir. RT-PCR sonuçları, bir aylık retinal organoidlerde ve iki aylık retinal organoidlerde nöro retinal belirteçlerin indüksiyonunu ve ekspresyonunu doğruladı.Burada nöro retinal progenitör belirteçleri Chx10, PAX6 ve Otx2'ye karşı antikorlar kullanan olgunlaşmamış retinal organoidlerin immün işaretli kesitlerinin konfokal görüntüleri ve fotoreseptör öncü belirteçleri recoverin ve CRX'e karşı antikorlar kullanan olgun retinal organoidlerin konfokal görüntüleri gösterilmiştir. Farklılaşan fotoreseptör hücrelere sahip retinal organoidlerin belirgin dış tabakası yakınlaştırılır ve bu görüntülerde gösterilir. İlkel iç segment benzeri uzantılar beyaz oklarla işaretlenmiştir.Merkezde nöroretinal fincan bulunan EFP kümeleri ve göç eden RPE çıkıntıları, ön kenarlar boyunca pigmentasyon gösterir. Burada nöro retinal adanın her yerindeki çoklu EFP'lerden iyi diferansiye pigmente epitel çıkıntıları gösterilmiştir. Bir EFP'nin daha yüksek büyütmesi, RPE progenitörlerinin göç bölgesini ve bir nöro retinal kabı çevreleyen oküler yüzey epitelini gösterir.Hem pigmentli hem de pigmentli olmayan hücreleri içeren olgunlaşmamış RPE hücrelerinin monokatmanlarını geliştiren genişletilmiş yapışkan kültürler burada gösterilmiştir. Tam olgun ve pigmentli RPE hücrelerinin tek katmanlı kültürleri 60. günde parke taşı morfolojisi gösterir. PAX6, MITF ve RPE65'i eksprese eden RPE hücreleri bu şekilde gösterilmiştir.Bu görüntüler, retinal progenitörlerin anormal agregaları olan EFP'leri, çarpık laminasyon ve çizik eksikliği ile temsil eder. Minyatür nöroretinal fincan ile EFP, ancak RPE ve oküler yüzey epitelinin çevresindeki bölgeden yoksun olarak bu şekilde gösterilmiştir. Temsili görüntü, süspansiyon kültüründe oluşan düzensiz nöroretinal agregaları göstermektedir.Üç ila dört hafta içinde göz alanlarının verimli bir şekilde indüksiyonunu sağlamak için IPC'lerin neredeyse birleşen büyüyen kültürlerini kullanarak farklılaşma sürecine başlamak çok önemlidir. Normal ve hastaya özgü IPC'lerden üretilen retinal organoidler ve RPE hücreleri, retina hastalığı modelleri olarak ve yeni terapötik ilaçların test edilmesinde kullanılabilir.

generation-retinal-organoids-from-healthy-retinal-disease-specific

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Pluripotent kök hücrelerden özel Retina hücrelerinin üretimini geliştirme retina hastalıkları için kök hücre tabanlı tedavisinin bir dönüm noktası olduğunu. Mevcut kağıt Retina organoids ve Retina pigmentli epitel verimli bir nesil için temel, çevirim ve klinik araştırma için basit bir yöntem açıklanır.

Tanımlanmış Xeno-alerjik ve besleyici-Alerjik kültür koşulları üretimi insan IPSC kaynaklı Retina hücre modelleri için

Burada, olgun insan retinal organoidleri üretmek ve bunları yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için farmasötik adayları tanımlamak için bir fotoreseptör toksisite testinde kullanmak için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Farmasötik Keşif için İnsan Retinal Organoidlerinde Toksisite Taramaları

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Mevcut protokol, retinal organoidlerin yapışmasını ve füzyonunu yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle azaltan optimize edilmiş bir 3D nöral retina indüksiyon sistemini tanımlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Nöral Retina Üretimi

Kök hücre kaynaklı retina pigment epitel (RPE) hücreleri, retina dejenerasyonu için hücre bazlı tedaviler, hastalık modellemesi ve ilaç çalışmaları dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılabilir. Burada, kök hücrelerden RPE'nin tekrarlanabilir bir şekilde türetilmesi için basit bir protokol sunuyoruz.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

Bu raporun amacı, embriyoid organlarının farklı boyutlarda kullanılarak uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden retina pigment epiteli (RPE) elde etmek protokolleri tanımlamaktır.

Embriyoid Kuruluşlarının Farklı Boyutları tarafından uyarılmış pluripotent kök gelen Retina pigment epiteli (RPE) türetilmesi (iPS) Hücreler

Bu el yazması, koparılmış saçlardan insan keratinositlerinin türetilmesi ve sürdürülmesi ve ardından epizomal vektörler tarafından entegrasyon gerektirmeyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) üretilmesi için adım adım bir prosedür sağlar.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Burada sunulan yöntem, pluripotent kök hücrelerinden insan hepatosit benzeri hücreler üretmek için ölçeklenebilir ve iyi üretim uygulamaları (GMP) 'ya hazır farklılaşma sistemini anlatmaktadır. Temel ve Uygulamalı İnsan karaciğer araştırma için insan hepatosit benzeri hücrelerin oluşturmak için bir düşük maliyetli ve standart bir sistem olarak hizmet vermektedir.

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Keşfedin, insan pluripotent kök hücrelerinden nöro retina organoidleri üretmek için yapışkan ve süspansiyon kültür yöntemlerini. Bu protokol, retina dejeneratif hastalıklarının araştırılması ve hücre bazlı tedaviler için değerli bir model sunar.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Daha fazla video keşfet