Name: Yeni Bir 3D Baskılı Tutucu Kullanarak Bozulmamış Ex Vivo Kürelerin Canlı Hücre Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Keşfedin, 3D baskılı tutucu kullanarak yaralı kornea epitelinde canlı hücre görüntüleme ve kalsiyum sinyalleşmesini gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu protokol, doku canlılığını koruyarak yüksek kaliteli görüntüler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH'ye aşağıdaki hibe desteği için teşekkür ederiz: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) ve 5T32GM008541-24 (KS). Ayrıca Massachusetts Lions Göz Araştırma Fonu ve New England Kornea Nakli Fonu'na da teşekkür ederiz.

Hayvan denekleri içeren prosedürler, Oftalmik Bakım ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği ve Boston Üniversitesi IACUC protokolü (201800302) tarafından onaylanmıştır.
1. 3D baskılı tutucuların ve kapak çubuğunun tasarlanması
<ol><li>Fare kürelerinin ortalama çapını hesaba katan 3B baskılı tutucuları ve kapak çubuğunu tasarlayın ve tasarımı 3B yazdırın (Şekil 1A, B).</li>
	<li>Bireysel farelerin farklı boyutlarını hesaba katmak için tutucunun iç duvarının çapını, dünyanın ortalama çapından biraz daha büyük tutun. Tutucunun yüksekliğini dünya çapının yaklaşık yarısında tutun ve 3D baskılı kapak çubuğu ile sabitlendiğinde dünyaya sıkıca oturmasını sağlayın.</li>
	<li>Tutucu kapak çubuğunu, tutucu çapının 1/4 ila 1/2'si genişliğinde tutucunun dış çapının uzunluğuna göre boyutlandırın. Kapak çubuğu, hidrasyon ve deneyin sonunda gözün çıkarılması için tutucuya sabitlendiğinde küreye erişime izin verecek şekilde boyutlandırılmıştır.</li>
	<li>Tutucuyu ve kapak çubuğunu yazdırın.</li>
</ol>2. Örnek toplama
<ol><li>Ötenazi fareler (bu çalışma için 9-12 haftalık ve 27 haftalık erkek C57BL / 6 fareler kullanılmıştır) kurumsal kılavuzlara uygun olarak belirlenmiş protokolleri kullanarak. Bu protokol için, karbondioksit ile ötenazi ve ardından kafa kesme işlemini gerçekleştirin.</li>
	<li>Fare kafasını çıkarın ve dokunun canlılığını korumak için hemen buzun üzerine yerleştirin. Doku hasarını önlerken diseksiyon aletleri kullanarak küreleri enüklee edin.</li>
	<li>Cımbız kullanarak dünyayı proptozlayın. Optik siniri, cımbız tarafından tutulduğu yerin hemen altındaki diseksiyon makası kullanarak kırpın. NOT: Daha fazla önlem için, laminer akış başlığında aşağıdaki adımları uygulayın.</li>
	<li>Düşük ışık koşullarına sahip 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde 1 saat boyunca kalsiyum göstergesi ve/veya hücre zarı lekesi içeren bir p35 hücre kültürü kabındaküreleri 2 mL ortamda inkübe edin. Düzgün boyama için kürelerin boyama ortamına batırıldığından emin olun.<ol><li>Burada yapılan deneyler için, kalsiyum göstergesi, Fluo4-(1:100)2 ve hücre zarı karşı boyası, koyu kırmızı plazma membran boyası (1:10.000)2, aşağıdaki büyüme takviyeleri ile 2 mL keratinosit serumsuz ortamda (KSFM) %1 (v/v) DMSO ve %0,1 (w/v) pluronik asit nihai konsantrasyonu ile: 25 μg/mL sığır hipofiz ekstresi, 0.02 nM epidermal büyüme faktörü, 0.3 mM CaCl2 ve penisilin-streptomisin (sırasıyla 100 ünite / mL ve 100 μg / mL). NOT: Kuluçka koşulları ve süreleri, kalsiyum göstergesine, doku tipine ve numune hacmine bağlı olarak değişir. Pluronik asit kullanırken, dokuyu geçirgen hale getirdiği için dikkatli olunması önerilir. Bu protokol% 10 pluronik asit gerektirir. Daha düşük pluronik asit konsantrasyonlarının etkisiz olduğu deneysel olarak belirlenmiştir ve daha yüksek konsantrasyonlar dokuya zarar verme riski taşır.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Numune tutucuların hazırlanması
<ol><li>Tutucuları, daha önce kullanılmamış tutkalla temiz bir cam tabanlı kapak kapağına yapıştırın. Bu protokolde kullanılan yapıştırıcı, steriliteyi sağlamak için tek kullanımlık kaplardan gelir ve her seferinde yeni, açılmamış bir kap kullanılır.</li>
	<li>Tutucuyu% 70 etanol içinde yıkayın. Tutucuya yapıştırıcı yerleştirin ve tutucuyu cam alt kapak kapağına yapıştırın. Tutkalın tutucunun iç alanında olmadığından emin olun, çünkü yapıştırıcı floresan yapabilir ve görüntülemeyi zorlaştırabilir.</li>
	<li>Tutkal katılaşana kadar bekleyin. Tutucunun kapak fişine karşı güvenli olduğunu onaylayın. NOT: Bu makalede sunulan deneyler için cam tabanlı kapaklı P35 hücre plakaları kullanılmıştır. Diğer cam tabanlı slaytlar ve / veya plakalar, deneyin ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir.</li>
</ol>4. Göz kürelerinin yaralanması
<ol><li>Küreleri steril göz damlalıkları kullanarak boyama çözeltisinden çıkarın, ilgilenilen bölgeye doku hasarını önlemeye özen gösterin. Fazla lekeyi çıkarmak için küreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca steril fosfat tamponlu salin kullanarak yıkayın ve küreleri mikroskopa taşımak için ortama yerleştirin.</li>
	<li>İlgilenilen bölgede steril bir 25 G iğne kullanarak küreleri yaralayın.<ol><li>Steril bir göz damlalığı kullanarak, dünyayı gözün arkasından alın ve tutun. Bu, dünyayı sabit tutacak, yuvarlanmasını önleyecek ve tutarlı yaraların oluşmasına izin verecektir. Bu kurulumu kullanarak, optik sinir göz damlalığı nozulunun içinde olacak ve kornea dışa dönük olacaktır.</li>
		<li>Çizik yarası için, steril bir 25 G iğneyi açıkta kalan kornea boyunca yavaşça hareket ettirin. Delinme yarası için, iğneyi doğrudan merkezi korneaya hafifçe bastırın. Yaranın korneayı delmediğinden emin olun. NOT: Deney için bir yara yanıtı veya yaralı ortam gerekmiyorsa bu adımı atlayın. Önceki çalışmalar, bu yöntem kullanılarak yapılan murin kornealarına hem çizik yaralarının hem de delinme yaralarının hem çap hem de derinlik10 bakımından tutarlı olduğunu göstermiştir. Bağımsız küreler arasındaki yara boyutlarının doğrulanması, bir ilgi alanı analizi kullanılarak gerçekleştirildi.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tutucuya numune yerleştirme
<ol><li>Kornea veya limbal bölgesi, tutucunun iç bölgesindeki örtü kapağının üzerine yerleştirin ve 3D baskılı kapağı kullanarak stabilize edin (Şekil 1C-H).</li>
	<li>Dünyanın doğru konumlandırıldığını ve ilgilenilen alanın cam kapak fişi ile temas halinde olduğunu onaylayın. Dünya tutucuya yerleştirildikten sonra, dünyayı çıkarmaya çalışmayın, çünkü bu doku hasarına neden olabilir.</li>
	<li>3D baskılı kapağı tutkal kullanarak tutucuya yapıştırın ve stabilizasyonu sağlayın. Kapak çubuğunun küreye değil, tutucuya yapıştığından emin olun. NOT: Protokol ters çevrilmiş bir mikroskopta kullanılmak üzere yazıldığı için görüntülenecek alan aşağıya yerleştirilir. Protokol, daha küçük bir iç yarıçapa sahip tutucular ve kapak çubuğunun çıkarılması kullanılarak dik mikroskoplar için uyarlanabilir. Bu, daha az dünya istikrarı ile sonuçlanacaktır.</li>
</ol>6. Örnek görüntüleme
<ol><li>Mikroskop ve çevre odasını açın ve odanın nemlendirildiğini doğrulayın. Deney süresince çevre odasını 35 °C ve %5 CO2'ye ayarlayın. NOT: Dehidrasyonu önlemek ve dünyayı optimum sıcaklıklarda tutmak için bu prosedür için çevre odacıklı mikroskoplar tercih edilir, ancak gerekli değildir.</li>
	<li>Canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak kapak kaymasını, tutucuyu ve stabilize edilmiş küreyi çevre odası ve görüntüsü içindeki mikroskop sahnesine yerleştirin9.</li>
	<li>Dehidrasyonu önlemek ve doku canlılığını korumak için kapak kayması üzerine ilave büyüme ortamı ekleyin. Kuyuda, tutucudaki dünyayı örtmek için yeterli ortam olduğundan emin olun. Görüntüleme süresine bağlı olarak, deney boyunca gerektiğinde taze ortam ekleyin.</li>
	<li>Canlı hücre görüntüleme tekniklerini ve protokollerini kullanarak deneylere başlayın. Uzun süreli deneylerde dokuyu korumak ve doku hasarını önlemek için düşük güçlü lazer ayarları kullanın. Uzun çalışma mesafeleri için uygun hedefleri kullanın. Bu makaledeki deneyler 20x hedefi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. NOT: Lazerin gücü ve kazancı, deneysel süre, yer ve görüntüleme düzlemi, deneysel parametrelere bağlı olarak değişkenlerdir. Süresi 1 saat ile 4 saat arasında değişen bozulmamış küreler üzerinde yapılan görüntüleme deneyleri geçmiş yayınlarda başarıyla gerçekleştirilmiştir10.</li>
	<li>Verileri tercih edilen dosya biçiminde kaydedin ve kaydedin. Mikroskop tarafından kullanılan yazılım, veri kaydı için .czi dosyaları üretir.</li>
	<li>Küreleri, protokolün sonundaki standart kurumsal protokollere göre elden çıkarın.</li>
</ol>

<ol><li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Ca2%2B+mobilizations%3A+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422(2019).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2%2B+waves+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+changes+in+Ca%282%2B%29+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li>
<li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li>
<li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li>
<li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73(2018).</li>
<li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin1%3A+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338(2021).</li>
<li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721(2022).</li>
<li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14(2020).</li>
<li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca%282%2B%29+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li>
<li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li>
</ol>

Açıklanacak çıkar çatışmamız yok.

Bu protokol, bozulmamış hayvan gözlerini stabilize etmek ve hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı bir tutucu kullanan canlı bir hücre görüntüleme tekniğini tanımlar. Ex vivo kornea dokusunun önceki canlı hücre görüntüleme protokolleri ile tanınan birkaç önemli dezavantajı atlatmak için tasarlanmıştır. Bu protokol, bozulmamış kürelerin canlı hücre görüntülemesi için birçok avantaj sunar. Deneysel olarak indüklenen çizik yaralarına yara iyileşmesi tepkisine müdahale edebilecek gereksiz doku hasarını önemli ölçü...

Kornea Kornea gözün ön yüzeyini kaplayan, görmeyi sağlamak için ışığı kıran ve gözün içini hasardan koruyan berrak, avasküler bir yapıdır. Kornea çevreye maruz kaldığından, hem mekanik nedenlerden (çizilme) hem de enfeksiyondan kaynaklanan hasarlara karşı hassastır. Aksi takdirde sağlıklı bir hastada kornea yaralanması tipik olarak 1-3 gün içinde iyileşir. Bununla birlikte, limbal kök hücre eksikliği ve tip II diyabet gibi altta yatan koşulları olan hastalarda, kornea yarası iyileşme süreci büyük ölçüde uzayabilir1. Kornea oldukça innervatlı olduğundan, bu iyileşmeyen kornea ülserleri ve tekrarlayan kornea erozyonları çok ağrılıdır ve bunları yaşayan hastaların yaşam kalitesini büyük ölçüde azaltır1.
Hücre sinyalizasyonu Aksi takdirde sağlıklı bir kornea yaralandığında, yaraya bitişik hücrelerdeki kalsiyum sinyal olayları, yara yatağına hücresel göçten önce gelir ve hızlı bir şekilde göç eder, buradayara izi 2,3 riski olmadan yaralanmayı kapatırlar. Bu sinyal olayları, canlı hücre görüntüleme2 kullanılarak kornea epitel hücre kültürü modellerinde iyi karakterize edilmiştir. Ön deneyler, diyabetik olmayan hücrelerde yaralanma sonrası diyabetik hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha fazla kalsiyum sinyallemesi olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, ex vivo kürelerdeki hücre sinyal olaylarının karakterizasyonunun teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır.
Canlı hücre görüntüleme Önceki çalışmalar, kornea yara iyileşmesinin in vitro hücre kültürü modellerinden kalsiyum sinyal olaylarını başarıyla kaydetmiştir 4,5,6. Bu sinyal olaylarının ex vivo dokuda yüksek kaliteli görüntülerini üretmek için bir metodoloji geliştirmek büyük ilgi çekicidir, çünkü bu olayların daha karmaşık ve gerçekçi bir sistemde incelenmesine izin verecektir. Önceki yaklaşımlar korneanın diseksiyonunu ve ardından UV kaynaklı PEG jeli 7,8,9'da immobilizasyonu içeriyordu. İmmobilizasyon, canlı doku ile çalışırken önemli ama zorlu bir adımdır, çünkü deney boyunca canlı ve hidratlı kalması gerekir. Ayrıca, immobilizasyon dokuya zarar vermemelidir. PEG çözeltisi dokuyu hareketsiz hale getirirken, üretilen görüntülerin çözünürlüğü ve kalitesi tutarlı değildi. Bu nedenle, daha az doku hasarı riski taşıyan daha yüksek kaliteli görüntüler üretmek için bozulmamış küreleri hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı tutucular geliştirilmiştir.
Yaklaşım Canlı hücre görüntüleme için bozulmamış ex vivo küreleri hareketsiz hale getirmek için benzersiz bir 3D baskılı tutucu geliştirilmiştir. Bu tutucu iki ana kaynaktan gelen hasarı önler: korneayı diseke etmeye gerek kalmadan enüklee edilmiş bir kürenin görüntülenmesini sağlar ve UV ışığına maruz kalmayı ortadan kaldırır. Bu hasar kaynakları olmadan, elde edilen görüntüler deneysel olarak yapılan çizik yaralanmalarına verilen cevabı daha doğru bir şekilde temsil ediyordu. Ayrıca, 3D baskılı tutucu, murin gözünün hassas boyutlarına göre kalibre edildi. Bu, PEG çözeltisinde immobilizasyondan çok daha iyi bir uyum sağladı ve doku hareketinin azalması nedeniyle daha düşük güçlü hedeflerde daha yüksek kaliteli bir görüntüye yol açtı. Tutucunun üst kısmına tutturulmuş bir kapak çubuğu, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını ve hidrasyon ve canlılığı korumak için büyüme ortamı uygulandığında dünyanın yer değiştirmemesini sağlar. Tutucuyu hassas boyutlara basma yeteneği, yaş veya hastalık durumu nedeniyle farklı boyutlardaki murin gözleri için en uygun uyumu sağlamamızı sağlar. Bu teknoloji, boyutlarına göre farklı türlerin gözleri için tutucular geliştirmek için daha geniş çapta uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>1.75 mavi polilaktik asit (PLA) plastik</td><td>Creality (Shenzen, Çin)</td> <td>Yok</td><td>Tutucu için malzeme</td></tr><tr><td>35 mm Çanak, No. 1.5 Lamelli, 14 mm cam çapı, Poli-D-Lizin Kaplı</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td> <td>P35GC-1.5-14-C</td><td>Görüntüleme için iyi.</td></tr><tr><td>Autodesk Fusion 360 yazılımı</td><td>Autodesk (San Rafael, CA).</td><td>N/A Tutucuları</td><td>yazdırmak için kullanılan yazılım.</td></tr><tr><td>BD 25 G 7/8 steril iğneler tek kullanımlık 100 iğne/kutu</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>305124</td><td>Kürelerde deneysel olarak indüklenen yaralar için</td></tr><tr><td>CellMask DeepRed</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>C10046</td><td>Hücre zarı karşı boyası. Kalsiyum göstergesi. 1:10.000 konsantrasyon ve nihai konsantrasyon %1 (h/h) DMSO ve %0.1 (a/h) pluronik asit</td></tr><tr><td>Komple Ev Süper Yapıştırıcı</td><td>Walgreens (Deerfield, IL)</td><td>N/A Tutucuyu</td><td>görüntüleme kuyusuna takmak için</td></tr><tr><td>Ender 3 Pro 3D yazıcı&nbsp;</td><td>Creality (Shenzen, Çin)</td><td>N/A FIJI</td>/ImageJ <td>tutucuyu yazdırmak için</td></tr><tr><td></td><td>ImageJ (Bethesda, MD)</td><td>Lisans Numarası: GPL2</td> Yazılımıİlgi Bölgesi analizi Fluo-4 Invitrogen (Carlsbad, CA)F14201 Kalsiyum göstergesi <td>kullanılarak bağımsız küreler arasındaki yara derinliği ve çapının tutarlılığını doğrulamak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>. %1 (h/h) DMSO ve %0.1 (a/h) pluronik asit nihai konsantrasyonu ile 1:100 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Keratinosit Serumsuz Orta</td><td>Gibco (Waltham, MA)</td><td>17005042</td><td>25 mg / mL sığır hipofiz ekstresi, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl 2 ve penisilin-streptomisin (100 ünite / mL, 100 & mikro; sırasıyla g/mL) orta</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> eklenir <td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td><td>21-040-CV</td><td>Görüntülemeden önce kornealardaki fazla lekeyi yıkamak için kullanılır</td></tr><tr><td>AiryScan ile Zeiss Confocal 880 Mikroskop</td><td>(Thornwood, NY)</td><td>N/A</td><td>20x büyütme objektifi kullanıldı</td></tr></tbody></table>

yeni bir 3d baskılı tutucu kullanarak bozulmamış ex vivo kürelerin canlı hücre görüntülemesi

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

Kornea epitelyal yara iyileşmesi, epitel hücrelerinde eksprese edilen pürinerjik reseptörlerin aktivasyonu ile başlayan bir göç sürecidir. Bu aktivasyon, hücreden hücreye yayılan, yara yatağına hücresel hareketliliği başlatmak için gerekli olan ve etkili yara iyileşmesini teşvik eden kalsiyum mobilizasyon olaylarıyla sonuçlanır. Trinkaus-Randall laboratuvarı, ex vivo murin kürelerinde kornea yarasının iyileşme yanıtını gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir metodoloji geliştirdi. Bu yaklaşım, sağlam bir küreyi, belirlenmiş protokollere göre ötenazi yapılmış bir fareden çekirdeksizleştirmeyi ve dünyayı derhal bir kalsiyum gösterge boyası ile inkübe etmeyi içerir. Hücrenin diğer özelliklerini lekeleyen bir karşı boya, görüntülemeye yardımcı olmak ve hücresel yer işaretlerini göstermek için bu aşamada uygulanabilir. Protokol, aktini boyamak için SiR aktinini ve hücre zarını boyamak için koyu kırmızı plazma zarı boyası da dahil olmak üzere karşı boyama için kullanılan birkaç farklı canlı hücre boyasıyla iyi çalıştı. Bir yaraya verilen cevabı incelemek için, kornea epiteli 25 G'lik bir iğne kullanılarak yaralanır ve küreler 3D baskılı bir tutucuya yerleştirilir. 3D baskılı tutucunun boyutları, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını sağlamak için kalibre edilir ve farklı boyutlardaki gözlere uyacak şekilde değiştirilebilir. Yara yanıtının canlı hücre görüntülemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak zaman içinde doku boyunca çeşitli derinliklerde sürekli olarak gerçekleştirilir. Bu protokol, konfokal mikroskopta 20x hava hedefi kullanarak yüksek çözünürlüklü, yayın kalitesinde görüntüler üretmemizi sağlar. Bu protokol için başka hedefler de kullanılabilir. Ex vivo murin kürelerde canlı hücre görüntüleme kalitesinde önemli bir iyileşmeyi temsil eder ve sinirlerin ve epitelin tanımlanmasına izin verir.

Bu protokol sürekli olarak yayın kalitesinde veri ve görüntü üretmek için kullanılmıştır10. Elde edilen görüntüler önceki yaklaşımlara kıyasla önemli bir iyileşmeyi temsil etmektedir (Şekil 2). 3D baskılı tutucu kullanılarak, kornea katmanları boyunca görüntüler yakalanabilir ve farklı z-düzlemlerinde kalsiyum mobilizasyonu gözlemlenebilir (Şekil 3). Bu yaklaşım, genç ve yaşlı farelerde bir yarada apikal ve bazal hücre katmanları arasında...

Bu çalışma, enüklee edilmiş kürelerin yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemesini sağlamak için 3D baskılı bir tutucu kullanan yeni bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Bu protokol sayesinde, ex vivo kürelerden yaralı kornea epitelindeki hücresel kalsiyum sinyal aktivitesi gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Yeni Bir 3D Baskılı Tutucu Kullanarak Bozulmamış Ex Vivo Kürelerin Canlı Hücre Görüntülemesi

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

Bu protokolde kullanılan 3D baskılı tutucu, yaralı kornealarda kısa süreli hücre sinyallemesini ve uzun süreli hücresel göç olaylarını gerçek zamanlı olarak izlememizi sağlar. Dünyayı sağlam, canlı ve hareketsiz tutarak, bu protokol epitel ve sinirler de dahil olmak üzere kornea hücrelerinin yüksek kaliteli canlı görüntülerini üretir. 3D baskılı tutucu, çeşitli boyut ve türlerdeki küreler için kolayca değiştirilebilir.Ayrıca gözleri diğer bölgeleri görüntülemek veya nano girinti deneyleri yapmak için farklı şekilde yönlendirebiliriz. Başlamak için, ötenazi yapılmış bir farenin kafasını çıkardıktan sonra, dokunun canlılığını korumak için hemen buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra cımbız kullanarak küreleri pervane dozerleyerek enüklee edin.Ve optik siniri, cımbız tarafından tutulduğu yerin hemen altındaki diseksiyon makası kullanarak kırpın. Küreleri, bir P-35 hücre kültürü kabında, 37 santigrat derecede bir inkübatörde bir saat boyunca bir kalsiyum göstergesi ve / veya hücre zarı boyası ve düşük ışık koşullarında% 5 karbondioksit de dahil olmak üzere ortamın iki mililitresinde inkübe ederek kürelerin düzgün boyama için leke ortamına batırılmasını sağlayın. Tutucuları temiz bir cam alt kapak kaymasına yapıştırmak için, tutucuyu% 70 etanol içinde yıkayın ve tutucunun üzerine yapıştırıcı yerleştirin.Ardından, tutucuyu cam alt kapak kaymasına yapıştırın, tutkalın tutucunun iç alanında olmadığından emin olun, çünkü yapıştırıcı floresan yapabilir ve görüntülemeyi zorlaştırabilir. Tutkal katılaştıktan sonra, tutucunun kapak kaymasına karşı sağlam olduğunu onaylayın. Steril damlalıkları kullanarak küreleri boyama çözeltisinden çıkarın, ilgilenilen bölgeye doku hasarını önlemeye özen gösterin.Fazla lekeyi çıkarmak için steril fosfat tamponlu salin kullanarak küreleri oda sıcaklığında beş dakika yıkayın ve küreleri mikroskopa taşımak için ortama yerleştirin. İlgilenilen bölgede steril bir 25 gauge iğne kullanarak küreleri sarmak için, dünyayı sabit tutmak ve yuvarlanmasını önlemek için steril bir damlalık kullanarak dünyayı gözün arkasından alın ve tutun. Çizik yarası için, steril bir 25 gauge iğneyi açıkta kalan kornea boyunca yavaşça hareket ettirin veya delinme yarası için iğneyi doğrudan merkezi korneaya hafifçe bastırarak yaranın kornea bazal membranını delmemesini sağlayın.Kornea veya limbal bölgesi, tutucunun iç bölgesindeki kapak kayması üzerine yerleştirin, aynı zamanda kürenin doğru konumlandırıldığını ve ilgilenilen bölgenin cam kapak kaymasıyla temas halinde olduğunu onaylayın. Tutucuya yapıştırılmış 3D baskılı kapağı yapıştırıcı kullanarak stabilize edin. Ve dünyayı çıkarmaya çalışmayın, çünkü bu doku hasarına neden olabilir.Mikroskobu açın ve çevre odasını 35 santigrat dereceye ve% 5 karbondioksite ayarlayın ve nemlendirilmiş odayı doğrulayın. Kapak kayma tutucusunu ve stabilize edilmiş küreyi, canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak çevre odası ve görüntüsü içindeki mikroskop aşamasına yerleştirin. Dehidrasyonu önlemek ve doku canlılığını korumak için kapak kaymasına ek büyüme ortamını inceleyerek, kuyuda tutucudaki dünyayı örtmek için yeterli ortam olmasını sağlayın.Dokuyu korumak ve doku hasarını önlemek için düşük güçlü lazer ayarları ve uzun süreli deneyler için uygun hedefleri kullanırken canlı hücre görüntüleme tekniklerini kullanarak deneylere başlayın. Veri kaydı için CZI dosyalarının tercih edilen dosya biçiminde verileri kaydedin ve kaydedin. X vivo kornea için, korneanın apikal, bazal ve stromal tabakalarında kalsiyum sinyal olaylarını gösteren, 3D baskılı tutucu ile stabilize edilmiş çok katmanlı yapıda yüksek kaliteli görüntüleme verileri elde edildi.3D baskılı tutucuda hareketsiz hale getirilmiş bir korneanın Z-yığını görüntüleri, kornea katmanları boyunca hücre zarlarını ve kalsiyum sinyalini ve farklı Z düzlemlerinde kalsiyum mobilizasyonunu görselleştirmek için bir çizik yarası elde edildi. İyileşme yanıtı sırasında yara yatağına hücresel göçü incelemek için bir korneanın zaman serisi deneyi yapıldı ve dünyanın X, Y veya Z yönlerinde çok az hareketini ortaya çıkardı. Kürenin tutucuya yerleştirilmesiyle korneanın hem merkezi hem de kornea limbal bölgesinde farklı bölgelerinin görselleştirilebileceği gözlenmiştir.Bu protokol, yara iyileşmesinde farklılıklar gösteren hastalık modellerinden gözleri görüntülememizi sağlar. Hücre sinyalizasyonundaki anormallikleri ve canlı dokudaki hareketliliği karakterize edebiliriz.

live-cell-imaging-intact-ex-vivo-globes-using-novel-3d-printed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Xenopus embriyonik epitel, epitel morfolojilerinden sırasında kutup geliştirme ve şekil değişikliği gibi hücre davranışlarını incelemek için ideal bir model sistem . Geleneksel sabit örnekleri histoloji giderek canlı hücre konfokal görüntüleme tarafından tamamlanmaktadır. Burada, kurbağa dokularda izole ve canlı hücre konfokal mikroskopi kullanılarak canlı epitel hücreleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için yöntemler göstermektedir.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Hücre göçü gibi hücresel süreçleri, geleneksel iki boyutlu, sert plastik yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu rapor doğrudan protein lokalizasyon görselleştirme ve daha fizyolojik ilgili üç boyutlu bir matris içinde göç eden hücrelerin protein dinamiklerini analiz etmek için bir teknik anlatılmaktadır.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Gerçek zamanlı görüntüleme embriyonik doku uzun süre boyunca meydan okuyor. Burada yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip uzun süre civciv omurilik hücresel ve alt hücresel değişikliklerin izlenmesi için bir test sunuyoruz. Bu teknik, sinir sistemi ve geliştirme embriyo diğer bölgeleri için adapte edilebilir.

Gelişmekte Neuroepithelium Hücre Davranış Yüksek çözünürlüklü Canlı Görüntüleme

Biz fare embriyonik deri diseksiyonu ve ex vivo kültürünü açıklamak. Kültür sistemi doku yüzeyi boyunca bir hava-sıvı arayüz korur ve bir ters mikroskop görüntüleme sağlar. Melanoblastlardan, gelişmekte olan derinin bir bileşeni olarak, flüoresan olarak davranışları konfokal mikroskopi kullanılarak gözlemlenebilir izin etiketlenir.

Fare Embriyonik Cilt ve Melanoblast Göç Canlı görüntüleme ex vivo Kültür

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Biz hücreleri ve embriyolar incelemek için bir cihaz ve yeni bir yöntem sunulmuştur. Tek hücreler tam microcavity dizileri sıralanır. Onların 3D hapsi fizyolojik koşullarda karşılaşılan 3D ortamlarda yolunda atılmış bir adımdır ve organel yönünü verir. Hücre şekli kontrol ederek, bu kurulum standart deneylerde bildirilen değişkenlik en aza indirir.

Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Biz bir tekrarlanabilir model formasyonu elde etmek için 3D bir hücre dışı matriks ilk hücre kümesi şeklinde kontrol etmek için bir yordam mevcut. İki farklı hydrogels içeren bir küp aygıtı doku Desen oluşumu için çok yönlü görüntüleme elde etmek için istihdam edilmektedir.

İlk 3D hücre küme denetimi içinde a Hybrid jel küp aygıt için tekrarlanabilir model oluşumları

Bu protokol, sinir sistemi gelişimi sırasında H 2 O2'ninfizyolojik sinyal rollerini değerlendirmek için kültürlü zebra balığı nöronlarında ve larvalarında genetik olarak kodlanmış bir hidrojen peroksit (H 2 O2)-biyosensör kullanımını açıklar. Farklı hücre tiplerine uygulanabilir ve genel gelişimde reaktif oksijen türlerini (ROS) incelemek için deneysel tedavilerle değiştirilebilir.

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Kardiyak progenitör hücrelerin 3D + zaman görüntülemesini sağlayan fare embriyo kültürü ve görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu video araç seti, başarılı canlı görüntüleme için gereken temel becerileri ele alır, aksi takdirde yalnızca metin yayınlarından elde edilmesi zordur.

Fare Embriyosundaki Erken Kardiyak Progenitörlerin Canlı Görüntülenmesi

Civciv embriyoları, insan glioblastoma (GBM) beyin tümörlerini ovo ve in vivo beyin dilimi ko-kültürlerinde incelemek için kullanılır. GBM hücre davranışı, ex vivo ko-kültürlerde hızlandırılmış mikroskopi ile kaydedilebilir ve her iki preparat da deneysel son noktada ayrıntılı 3D konfokal analiz ile analiz edilebilir.

Civciv Embriyo Beynini, İnsan Glioblastoma Hücre Davranışının In Vivo ve Ex Vivo Analizleri için Bir Model Olarak Kullanma

Keşfedin, 3D baskılı tutucu kullanarak yaralı kornea epitelinde canlı hücre görüntüleme ve kalsiyum sinyalleşmesini gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu protokol, doku canlılığını koruyarak yüksek kaliteli görüntüler sağlar.

Yeni Bir 3D Baskılı Tutucu Kullanarak Bozulmamış Ex Vivo Kürelerin Canlı Hücre Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet