Name: Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Öğrenin, bitki yaprak dokusu ve siyanobakterilerden plastoglobül lipid damlacıklarını hızlı ve verimli bir şekilde izole etme yöntemini. Bu teknik, biyokimyasal analizler için saflaştırılmış örnekler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lundquist laboratuvar grubundaki araştırmalar, NSF (MCB-2034631) ve USDA'dan (MICL08607) P.K.L.'ye verilen hibelerle desteklenmektedir. Yazarlar, siyanobakteriyel plastoglobül izolasyon yönteminin geliştirilmesindeki desteği için Dr. Carrie Hiser'e (MSU) teşekkür eder.

1. Ham plastoglobül izolasyonu
<ol><li>Stressiz mısır yaprağı dokusundan ham plastoglobül ekstraksiyonu<ol><li>Yaklaşık 3 haftalık ve yaklaşık V5 büyüme aşamasında, yaklaşık 120 g ağırlığında altı sağlıklı mısır fidanı edinin.</li>
		<li>Sapın tabanındaki tüm yaprakları kesin, hızla bir buz banyosuna batırın ve soğuk odaya taşıyın.</li>
		<li>Yeşil bir güvenlik lambası altında çalışırken, mısır yapraklarını buz banyosundan çıkarın ve makas kullanarak daha küçük parçalara (yaklaşık 5 cm x 5 cm) ayırın.</li>
		<li>Kırpılmış yaprak dokusunun yarısını ticari bir karıştırıcıda 350 mL öğütme tamponunda nazikçe ama iyice öğütün (Tablo 1). Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı 5x-6x'i başlatın-durdurun. Karıştırıcıda seviye 7'den daha yüksek kullanmayın.</li>
		<li>Homojenatı büyük bir huni üzerindeki bir kat 25 μm naylon bezden dört adet 250 mL santrifüj şişesine filtreleyin. Ardından, kırpılmış yaprak dokusunun ikinci yarısı ile adım 1.1.4'ü tekrarlayın.</li>
		<li>Filtrazı dört şişe arasında eşit olarak bölün ve 4 ° C'de 1.840 x g'de 6 dakika boyunca santrifüj yapın. Yaprak filtrasyonunun bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun.</li>
		<li>Elde edilen süpernatantı dökün ve peleti, fırçanın nazik hareketleriyle döndürerek ve sulandırarak 0.2 M sakkaroz içeren 12 mL orta R 0.2'de (Tablo 1) yavaşça yeniden askıya alın. Her peleti yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu bir sonraki şişeye taşıyın ve yeniden süspansiyonu tekrarlayın. Süspansiyonları bir şişede toplayın.</li>
		<li>Havuzlanmış süspansiyonu altı adet 3 mL ultrasantrifüj tüp arasında dağıtın ve her tüpte maksimum 2,5 mL hacme ulaşın.</li>
		<li>Her tüpü 4x, her seferinde 10 s için,% 100 genlikte bir uç sonikatör kullanarak sonikleştirin. Köpüğü önlemek için sonicator kornasını suya batırılmış ve sıvı yüzeyden uzak tutmaya dikkat edin.</li>
		<li>Her tur boyunca sonicator kornasını süspansiyon içinde yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dört tüp arasında geçiş yapın, numunenin soğumasına izin vermek için her tüpü her sonikasyondan sonra bir buz kovasına geri döndürün.</li>
		<li>Sonik ham thylakoid süspansiyonunu 150.000 x g'de 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin. Elde edilen ham plastoglobüllerin yüzer pedini, bir şırınga ve 22 G iğne kullanarak, yastığın yüzeyini iğnenin açılmasıyla sıyırarak, her tüpten yaklaşık 500 μL geri kazanarak, sakkaroz yastığının yüzeyinden (kolayca sarı, yağlı bir ped olarak görülür) toplayın. 2,0 mL'lik bir tüpe koyun.</li>
		<li>Plastoglobüllerin sonikasyonundan ve salınımından önce ve sonra ham tilakoidin alikotlarını toplayın. Adım 2.1'e geçin. Alternatif olarak, ham plastoglobülleri -80 ° C'de saklayın ve daha sonra saflaştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kurutulmuş E. nindensis yaprak dokusundan ham plastoglobül ekstraksiyonu<ol><li>Tamamen kurutulmuş, 8-9 haftalık E. nindensis'ten (yaklaşık 40 g doku) oluşan bir saksı (saksı başına üç ayrı bitkiden oluşan) edinin.</li>
		<li>Tüm yaprak dokusunu bitkinin tabanından, toprağın hemen üstünden, makas kullanarak kesin ve derhal bir buz banyosuna batırın. Dokuyu soğuk odaya taşıyın.</li>
		<li>Yeşil bir emniyet lambası altında çalışırken, E'yi kırpın. nindensis, makas kullanarak daha küçük parçalara (yaklaşık 5 cm x 5 cm) ayrılır.</li>
		<li>Yaprakları ticari bir karıştırıcıda 100 mL öğütme tamponu (Tablo 1) ile nazikçe ama iyice öğütün. Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı birkaç kez başlatın-durdurun. Karıştırıcıda seviye 7'den daha yüksek kullanmayın.</li>
		<li>Homojenatı büyük bir huni üzerindeki 25 μm naylon bezden bir tabaka boyunca 250 mL konik şişeye süzün. Yaprak filtrasyonunun bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun.</li>
		<li>0,5 M'lik son konsantrasyona getirmek için uygun miktarda sakkaroz ekleyin ve çözeltiyi 250 mL santrifüj tüplerine dağıtın. NOT: Z. mays preparatına kıyasla daha yüksek bir sakkaroz konsantrasyonu, tilakoid bağlı plastoglobüllerin sonraki sonikasyonundan / salınımından önce sitozolik lipit damlacıklarının yüzdürülmesini sağlamak için kullanılır.</li>
		<li>Tüpleri 4 ° C'de 30 dakika boyunca 45.000 x g'de santrifüj yapın. Plastoglobüllerin ve sitozolik lipit damlacıklarının bir karışımı, sakkaroz yastığının yüzeyinde veya yakınında sarı, yağlı bir ped olarak kolayca görülecektir (Şekil 1B). Yastığın yüzeyini iğnenin açılmasıyla sıyırarak 22 G'lik bir iğne ile bir şırınga kullanarak yüzen malzemeyi toplayın ve bir tüpe koyun.</li>
		<li>Serbest yüzen plastoglobül / lipit damlacık karışımını topladıktan sonra kalan süpernatantı atın.</li>
		<li>Artık tilakoide bağlı plastoglobülleri izole etmek için, peleti fırçanın nazik hareketleriyle döndürerek ve sulandırarak 12 mL orta R 0.2'de yeniden askıya alın. Süspansiyonları bir şişede toplayın. 1.1.8 adımına geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Siyanobakterilerden ham plastoglobül ekstraksiyonu<ol><li>50 mL'lik bir Synechocystis sp. PCC 6803 kültürünü sabit faza (yaklaşık 7-10 gün) büyütün ve bir spektrofotometre kullanarak hücre yoğunluğunu OD750 / 2.0'a ayarlayın. Kültür koşulları için, BG-11 ortamını kullanın ve bir inkübatörde 150 μmol foton / m 2 / s, %2 CO 2,32 ° C ışık yoğunluğunda ve 150 rpm'de sürekli sallanarak büyüyün.</li>
		<li>Polisakaritleri çıkarmak için, 50 mL kültürü 6.000 x g'de 4 ° C'de 45 dakika boyunca santrifüj ederek ve daha sonra süpernatanı çıkararak hücreleri yıkayın. Hücreleri 50 mL tampon A'da iki kez yıkayarak devam edin (Tablo 1). Hücre homojenatının bir alikotunu çıkarın ve temsili bir toplam hücre örneği olarak saklanmak üzere santrifüjlemeden önce bir kenara koyun</li>
		<li>Yıkanmış peleti 25 mL Tampon A'da yeniden askıya alın ve 1.100 psi'de bir Fransız basınç hücresi kullanarak hücreleri kırın, lized rengi beyaz ışık altında yeşilden kırmızı-mavi-yeşile değişene kadar işlemi 3x tekrarlayın (protein denatürasyonunu önlemek için numuneyi her döngü arasında buz üzerine koyun). Önceden soğutulmuş bir hücre kullanın ve bu adımı soğuk odada gerçekleştirin.</li>
		<li>Elde edilen homojenatı her tüpte maksimum 2,5 mL'ye kadar doldurulmuş sekiz adet 3 mL ultrasantrifüj tüpü arasında dağıtın ve ardından 400 μL orta R ile dikkatlice kaplayarak bir adım gradyanı üretin. NOT: Sakkaroz gradyan preparatı25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang, et al. ve Kelekar, et al.</li>
		<li>Gerektiğinde ilave orta R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin ve 4 ° C'de 150.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın. Tilakoid ve diğer ağır organeller (herhangi bir polihidroksiyalkanoat cismi dahil) pelet olurken, plastoglobüller sakkaroz gradyanının üstünde veya yakınında sarı, yağlı bir ped olarak kolayca görülecektir (Şekil 1C).</li>
		<li>Elde edilen ham plastoglobüllerin yüzer pedini bir şırınga ve 22G iğne ile hasat edin ve 2 mL'lik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri ultrasantrifüj tüp duvarının yan tarafından gerekirse iğne ucu ile kazıyın.</li>
		<li>Adım 2.2'ye geçin. Alternatif olarak, ham plastoglobülleri -80 ° C'de saklayın ve daha sonra saflaştırın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Saf plastoglobüllerin toplanması
<ol><li>Bitki dokusu işleme<ol><li>Toplam 1 mL hacme ulaşmak için adım 1.1 veya adım 1.2'den 500 μL ham plastoglobüllerle 500 μL ham plastoglobüllerle katmanlanarak 2.5 mL ultrasantrifüj tüplerinde sakkaroz gradyanları üretin, toplam 1 mL'lik bir hacme getirin, ardından 400 μL orta R 0.2 ile örtün, ardından 400 μL orta R ile üst üste bindirildi. NOT: Sakkaroz gradyan preparatı25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang ve ark. ve Kelekar ve ark.'ya bakınız.</li>
		<li>Gerektiğinde üst katmana fazla orta R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin. Daha sonra 4 ° C'de 1,5 saat boyunca 150.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Elde edilen yüzer saf plastoglobüllerin (Şekil 1A) pedini bir şırınga ve 22G iğne ile toplayın ve 2 mL'lik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri gerekirse iğne ucu ile santrifüj tüpü duvarının üstünden kazıyın.</li>
		<li>Aliquot saf plastoglobüller ve flaş sıvı azot içinde donar. Doğrudan -80 ° C'de saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Siyanobakterilerin işlenmesi<ol><li>İlk önce 1.3. adımdan itibaren ham plastoglobüllerin 500 μL'si ile katmanlanmış dört adet 2.5 mL ultrasantrifüj tüpünde bir sakkaroz gradyanı üretin, ardından 750 μL orta R 0.2 ile örtün. NOT: Sakkaroz gradyan preparatı25,26'nın ayrıntılı açıklamaları için Yang ve ark. ve Kelekar ve ark.'ya bakınız.</li>
		<li>Sakkaroz gradyanını 4 ° C'de 90 dakika boyunca 150.000 x g'de santrifüj yapın. Saf plastoglobülleri (Şekil 1C) bir şırınga ve 22 G iğne ile sakkaroz gradyanının üst fazından toplayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Saf plastoglobülleri aliquot ve sıvı azotta flaş-dondurun. Doğrudan -80 ° C'de saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li>
<li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening%2C+modified+prenyl-lipids%2C+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li>
<li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocopherol+cyclase+%28VTE1%29+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Plastoglobuli+von+Spinat%2C+ihre+Gr%C3%B6%CE%B2e%2C+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+%28L%29+Mill%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li>
<li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Pflanzenphysiologie%22%5BJournal%5D)">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li>
<li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li>
<li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+function+of+plastoglobuli+%3A+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li>
<li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+%28Pisum+sativum+L.%29+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li>
<li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobule+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li>
<li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li>
<li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298(2014).</li>
<li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069(2020).</li>
<li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867(2020).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2%2B-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762(2022).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signalling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213(2021).</li>
<li>Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBesagni%2C+C+%22Chloroplast+Research+in+Arabidopsis%22">Chloroplast Research in Arabidopsis</a>. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).</li>
<li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+preparation%2C+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014(2022).</li>
<li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelekar%2C+P+%22Cilia%3A+Motors+and+Regulation.+Methods+in+Cell+Biology%22">Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology</a>. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li>
<li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547(2012).</li>
<li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
</ol>

Beyan edilecek çıkar çatışması yoktur.

Malzemedeki fizyolojik / biyokimyasal değişiklikleri en aza indirmek ve plastoglobüllerin zengin bir bileşeni olan bazı foto-ve termo-kararsız prenil-lipid pigmentlerini korumak için, izolasyonun 4 ° C'de yapılması ve ışıktan korunması kritik öneme sahiptir. Yukarıda belirtildiği gibi, ilk adımlar soğuk odada yeşil yayan bir ampul kullanılarak bir güvenlik lambasının altında gerçekleştirilir. Laboratuvarda gerçekleştirilen sonraki adımlar soluk ışıklar altındadır ve buz veya soğutulmuş santrifüjleme kullanır. Benzer nede...

Plastoglobül kompozisyonu ve fonksiyonunun güncel anlayışı ayrıntılı proteomik ve lipidomik çalışmalarla ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5. Bu tür çalışmalar, sakkaroz gradyanları kullanılarak verimli ayırma için çok düşük yoğunluklarına dayanan hızlı ve etkili bir izolasyon yöntemi ile büyük ölçüde desteklenmiştir. Plastoglobul izolasyonunun ilk yöntemleri, kayın ağacı (Fagus sylvatica), viski süpürgesi (Sarothamnus scoparius), soğan (Allium cepa), ıspanak (Spinacia oleracea), hercai menekşe (Viola tricolor), biber (Capsicum annuum) ve bezelye (Pisum sativum) 6,7,8,9,10,11 gibi türlerden elde edildi. ,12,13. Kloroplast plastoglobülleri daha verimli ve daha iyi verimli bir şekilde izole etmek için güncellenmiş bir yöntem daha sonra Ytterberg ve ark.3,14 tarafından sunulmuştur. Başlangıçta Arabidopsis thaliana yaprak kloroplastlarının plastoglobüllerinin incelenmesi için kullanılırken, bu güncellenmiş yöntemi, mısır (Zea mays), domates (Solanum lycopersicum), lovegrass (Eragrostis nindensis), mor sahte brom (Brachypodium distachyon) ve yabani tütün (Nicotiana benthamiana) dahil olmak üzere hem monokot hem de dikot gibi diğer bitki türlerinin sağlıklı yaprak dokusu için başarıyla kullandık. ; yayınlanmamış sonuçlar). Ayrıca, izolasyon yöntemi, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Anabaena sp. PCC 712015 ve diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusu E. nintensis dahil olmak üzere siyanobakterilerin plastoglobüllerine başarıyla uyarlanmıştır.
Sağlıklı yaprak dokusunun kloroplast plastoglobülleri tilakoid membranlara fiziksel olarak bağlıdır16. Bu fiziksel sürekliliğe rağmen, iki kloroplast alt bölmesi farklı lipit ve protein bileşimlerini korur, ancak iki bölme arasındaki düzenlenmiş lipit ve protein değişimiönerilmiştir 2,4,17,18,19. Aslında, son zamanlarda kloroplastlar ve sitosol19 arasındaki nötr lipitlerin kaçakçılığı için ilginç bir hemifüzyon modeli önerilmiştir. Plastoglobüllerin ve tilakoidlerin fiziksel sürekliliği nedeniyle, sağlıklı yaprak dokusu ile izolasyon yöntemi, daha sonra plastoglobülleri tilakoidlerden ayırmak için sonikleştirilen peletlenmiş ham tilakoid preparatının toplanmasıyla başlar, bu da sitozolik lipit damlacıklarını izole etmek için kullanılan yöntemlerin aksinedir20 . Bir sakkaroz yastığı üzerindeki ultrasantrifüjleme daha sonra düşük yoğunluklu plastoglobülleri sakkaroz boyunca yüzdürür ve onları tilakoidlerden, çekirdeklerden ve diğer yüksek yoğunluklu malzemelerden etkili bir şekilde ayırır. Buna karşılık, siyanobakterilerdeki plastoglobüllerin yanı sıra kurutulmuş yaprak dokusundakiler, serbest yüzen bir formda in vivo olarak açıkça bulunur. Bu nedenle, izolasyonları doğrudan bir sakkaroz gradyanı üzerinde yüzmeyi içerir. Bu makale, sağlıklı yaprak dokusundan izolasyon yöntemini göstermektedir ve ayrıca plastoglobülleri kurutulmuş yaprak dokusundan veya siyanobakteriyel kültürlerden izole etmek için kullanılabilecek iki varyasyonu göstererek, plastoglobüllerin çalışılabileceği fizyolojik genişliği ve evrimsel bağlamı büyük ölçüde genişletmektedir.
İzole plastoglobüller daha sonra moleküler özellikleri araştırmak için herhangi bir sayıda aşağı akış analizi için kullanılabilir. A. thaliana yaprak dokusundan izole plastoglobülleri, farklı çevresel koşullar veya genotipler altında kapsamlı proteomik ve lipidomik analiz için kullandık ve stres 2,4,21,22'ye adaptasyonda protein ve lipit bileşiminin seçici modifikasyonunu gösterdik. Ek olarak, izole plastoglobüllerle ilişkili trans-fosforilasyon aktivitesini gösteren in vitro kinaz testleri22, protein bileşenlerinin oligomerik durumları doğal jel elektroforezi 21 kullanılarak araştırıldı ve proteaz tıraş testleri23 yapıldı.
Bu yöntemin birincil yararı, prosedürün göreceli hızıdır. Deneyimlerimize göre, aşağıda özetlenen protokoller yaklaşık 4 saat içinde tamamen tamamlanabilir. Plastoglobülleri yaprak dokusundan izole etmek için alternatif bir yöntem tanımlanmıştır, bu da diğer kloroplast alt bölmelerinin eşzamanlı izolasyonuna izin verir24. Bu alternatif yöntem, diğer kloroplast alt bölmeleriyle kantitatif karşılaştırma gerektiğinde veya istendiğinde bazı açık avantajlar sunar. Bununla birlikte, bu alternatif yöntem aynı zamanda daha sıkıcıdır ve karşılaştırılabilir miktarlarda yaprak dokusundan izole plastoglobüllerin önemli ölçüde daha düşük verimini sağlayacaktır. Plastoglobüllerin odaklanmış bir çalışması amaçlandığında, burada özetlenen metodoloji en uygun seçimdir. Bununla birlikte, numune hazırlama sırasında toplam yaprak ve ham tilakoid alikotlar toplanabilir ve daha sonraki karşılaştırmalar için referans numunelere sahip olmak için bunu yapmanız şiddetle tavsiye edilir.

<table><tbody><tr><td>AEBSF</td><td>Milipore Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Antipain.2HCl</td><td>Bachem</td><td>H-1765.0050BA</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Milipore Sigma</td><td>A6106</td><td></td></tr><tr><td>Askorbat</td><td>BDH</td><td>BDH9242</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Gliserofosfat. 2Na5H2O</td><td>EMD Millipore</td><td>35675</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Proliant Biyolojik</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Eragrostis nindensis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Milipore Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Fransız Basınç hücresi (model FA-079)</td><td>SLM/Aminco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Multitron çalkalama inkübatörü</td><td>Infors HT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfo-ramidon.2 Na</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7385</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit</td><td>Fisher Kimyasalları</td><td>M16050</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Florür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Orto-vanadat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr> Azaltılmış <tr><td>Sistein</td> MP Biyo <td>101444</td><td></td><td>kimyasalları</td></tr><tr><td>Sodyum Pirofosfat ve middot; 10H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3889</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sylvania 15 W floresan Gro-Lux tüplü ampul, 18"</td><td>Walmart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Waring Blender (1.2 L)</td><td>VWR</td><td>58977-227</td><td>Ticari blender</td></tr><tr><td>Zea mays N</td><td>/ A</td><td>N / A</td><td></td></tr></tbody></table>

plastoglobül lipid damlacığı İzolasyonu bitki yaprağı dokusu ve siyanobakterilerden

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobül lipit damlacıkları, bitki kloroplastlarının ve siyanobakterilerin dinamik bir alt bölmesidir. Fotosentetik türler arasında her yerde bulunan, hızla değişen çevresel koşullar altında tilakoid membranın adaptasyonunda ve yeniden şekillenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Yüksek saflıktaki plastoglobülleri izole etme kapasitesi, proteomik, lipidomik ve diğer metodolojiler yoluyla çalışmalarını büyük ölçüde kolaylaştırmıştır. Yüksek saflık ve verime sahip plastoglobüllerle, diğer olası moleküler özelliklerin yanı sıra lipit ve protein bileşimlerini, enzimatik aktivitelerini ve protein topolojilerini araştırmak mümkündür. Bu makalede, plastoglobüllerin bitki yaprağı dokusunun kloroplastlarından izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmakta ve plastoglobüllerin ve ilgili lipit damlacık yapılarının mısır yapraklarından, diriliş bitkisinin kurutulmuş yaprak dokusundan, Eragrostis nindensis'ten ve siyanobakteri, Synechocystis'ten izolasyonu için metodolojik varyasyonlar sunulmaktadır. sp. PCC 6803. İzolasyon, bu lipit bakımından zengin parçacıkların düşük yoğunluğuna dayanır ve bu da sakkaroz yoğunluğu yüzdürme ile saflaştırmalarını kolaylaştırır. Bu metodoloji, çeşitli türlerden plastoglobüllerin incelenmesinde değerli olduğunu kanıtlayacaktır.

Protokolün 1. adımının tamamlanmasının ardından, sakkaroz yastığının üst tabakası üzerinde (veya yakınında) yüzen önemli miktarda plastoglobül/lipit damlacık materyali kolayca görülebilmelidir (Şekil 1B-C). Bu aşamada diğer fraksiyonlar da toplanabilir. Örneğin, tilakoidler peletlenecek ve sonraki analizler için orta R 0.2 ile yeniden askıya alınabilir. Sonraki santrifüjlemeden sonra, Şekil 1A, C'de gösterildiği...

Çeşitli fotosentetik organizmalarla ilişkili plastoglobül lipid damlacıklarının izolasyonu için hızlı ve etkili bir protokol sunulmaktadır. İzole plastoglobüllerin başarılı bir şekilde hazırlanması, proteomik ve lipidomik analizler gibi ayrıntılı moleküler araştırmalardan önce gelen çok önemli bir ilk adımdır.

Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Son derece saf plastoglobüllerin izolasyonu, çalışmaları için kritik öneme sahiptir. İzolasyonları için aşağı akış biyokimyasal araştırmalarını kolaylaştıran hızlı ve etkili bir protokol burada sunulmaktadır. Bu yöntemin birincil yararı, prosedürün göreceli hızı ve çok sayıda bitki türüne ve çevresel koşullara uyarlanabilirliğidir.Plastoglobülleri tilakoidlerden sıyırmak için yeterli kuvveti sağlamak için tilakoid resüsitasyonlarını sonikleştirirken ve daha sonra sakkaroz gradyanından plastoglobüllerin çıkarılmasıyla özel dikkat gösterilmelidir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Elsinraju Devadasu ve laboratuvarımda doktora öğrencisi olan Febri Susanto olacak. V5 büyüme aşamasına sahip ve yaklaşık 120 gram ağırlığında altı sağlıklı mısırın üç haftalık fidelerini edinerek başlayın.Sapın tabanındaki tüm yaprakları kesin ve soğuk odaya taşımadan önce hızla bir buz banyosuna batırın. Yeşil bir güvenlik lambası altında çalışırken, mısır yapraklarını buz banyosundan çıkarın ve makas kullanarak daha küçük beşe beş santimetrelik parçalara ayırın. Kırpılmış yaprak dokusunun yarısını, ticari bir karıştırıcıda yediden düşük bir seviyede öğütme tamponunun 350 mililitresinde nazikçe ve iyice öğütün.Tüm yaprakların kesildiğinden emin olmak için karıştırıcıyı beş ila altı kez başlatın ve durdurun. Homojenatı büyük bir huni üzerinde bir kat 25 mikron naylon bezden dört adet 250 mililitrelik santrifüj şişesine filtreleyin. Karıştırma adımını kalan kırpılmış yaprak dokusuyla tekrarladıktan sonra, filtradı dört şişe arasında eşit olarak bölün.Yaprak filtrasyonunun bir aliquotunu çıkarın ve temsili bir toplam yaprak örneği olarak saklanmak üzere bir kenara koyun. Daha sonra, filtratın altı dakika boyunca 1.840 G ve dört santigrat derecede santrifüj yapın. Elde edilen süpernatantı dökün ve fırçanın yumuşak döner hareketleriyle, peleti 0.2 molar sakkaroz içeren 12 mililitre orta R 0.2 içinde yeniden askıya alın.Pelet'i bir şişede yeniden askıya aldıktan sonra, süspansiyonu bir sonraki şişeye ekleyin ve süspansiyonları bir şişede toplamak için yeniden süspansiyonu tekrarlayın. Havuzlanmış süspansiyonu altı adet üç mililitrelik ultrasantrifüj tüp arasında dağıtın ve her tüpte maksimum 2,5 mililitre hacme ulaşın. Ardından, her tüpü her biri 10 saniye boyunca dört kez sonikleştirmek için% 100 genlikte uç sonicator'u kullanın.Köpüğü önlemek için sonicator boynuzunu suya batırılmış ve sıvı yüzeyden uzak tuttuğunuzdan emin olun. Her tur boyunca sonicator kornasını süspansiyon içinde yavaşça yukarı ve aşağı hareket ettirin. Dört tüpü değiştirirken, numunenin soğumasına izin vermek için her sonikasyondan sonra her tüpü bir buz kovasına geri döndürün.Bir kez bittiğinde, sonikleştirilmiş ham tilakoid süspansiyonunu dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 150.000 G'de santrifüj yapın. Bir şırınga ve 22 gauge iğne kullanarak yastık yüzeyini gözden geçirin ve elde edilen sarı ve yağlı yüzer ham plastoglobül pedini sakkaroz yastığından toplayın. Her tüpten yaklaşık 500 mikrolitre geri kazanın ve bunları 2.0 mililitrelik bir tüpe koyun.Plastoglobüllerin sonikasyonundan ve salınımından önce ve sonra ham thylakoid aliquots toplayın. Bir kez yapıldıktan sonra, bitki dokusu işlemeye devam edin veya ham plastoglobülleri eksi 80 santigrat derecede saklayın ve daha sonra saflaştırın. Sabit faza ulaşmak için BG11 ortamında 50 mililitre synechocystis türü PCC 6802 kültürünü 7 ila 10 gün boyunca büyütün.Bir spektrofotometre kullanarak, hücre yoğunluğunu 750 nanometrede 2.0 optik yoğunluğa ayarlayın. Polisakaritleri çıkarmak için, 50 mililitre kültürü santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Hücrelerin 50 mililitre tampon A'da iki kez yıkanmasını tekrarlayın.Yıkanmış peleti 25 mililitre tampon A'da yeniden askıya alın ve hücreleri 1.100 pound inç karede bir Fransız basınç hücresi kullanarak kırın. Lised rengi yeşilden kırmızıya, maviye, yeşile beyaz ışık altında değişene kadar işlemi soğuk koşullarda üç kez tekrarlayın. Hücre homojenatının aliquot'unu çıkarın ve temsili bir toplam hücre örneği olarak saklanmak üzere bir kenara koyun.Elde edilen homojenatı her tüpte maksimum 2,5 mililitreye kadar doldurulmuş sekiz adet üç mililitrelik ultrasantrifüj tüpüne dağıtın. Bu homojenatı 400 mikrolitre orta R ile kaplayın ve bir adım gradyanı üretin. Tüpleri santrifüj etmeden önce gerektiğinde ilave ortam R ekleyerek tüpleri dikkatlice dengeleyin.Herhangi bir polihidroksyalkanoat cismi de dahil olmak üzere tilakoid ve diğer ağır organeller pelet oluşumu gösterirken, plastoglobüller sakkaroz gradyanının üstünde veya yakınında sarı yağlı bir ped oluşturur. Elde edilen yüzer ham plastoglobül pedini, daha önce gösterildiği gibi bir şırınga ile hasat edin ve hasadı iki mililitrelik bir tüpe koyun. Plastoglobülleri ultrasantrifüj tüp duvarının yan tarafından gerekirse bir iğne ucu ile kazıyın.Ya siyanobakteri işlemeye devam edin ya da ham plastoglobülleri eksi 80 santigrat derecede depolayın ve daha sonra saflaştırın. Bitki dokusu işleme yöntemini kullanarak saf plastoglobülleri hasat etmek için, 500 mikrolitre ham plastoglobül, 400 mikrolitre orta R 0.2 ve 400 mikrolitre orta R. Santrifüjlemeden sonra, elde edilen yüzer saf plastoglobül pedini iki mililitrelik bir tüpe toplayın. Saf plastoglobülleri alıkoyduktan ve alikotları sıvı azotta dondurduktan sonra, ya eksi 80 santigrat derecede saklayın ya da kuru bir toza liyofilize edin.Siyanobakterilerden saf plastoglobülleri hasat etmek için, daha önce de belirtildiği gibi, 500 mikrolitre ham plastoglobül, 750 mikrolitre orta R 0.7 ve 750 mikrolitre orta R 0.2 kullanarak bir sakkaroz gradyanı oluşturun. Santrifüjlemeden sonra, saf plastoglobülleri 1.5 mililitrelik bir tüpte toplayın ve saf plastoglobülleri aliquot edin. Tamamlandığında, saf plastoglobüller alikotlarını sıvı azotta flaş dondurun ve doğrudan eksi 80 santigrat derecede saklayın veya kuru bir toza liyofilize edin.Bu yöntemde sakkaroz yastığının üst tabakasında yüzen önemli miktarda plastoglobül veya lipid damlacık materyali görülmüştür. Daha sonraki santrifüjlemeden sonra, saflaştırılmış plastoglobüller sakkaroz gradyanının yüzeyinde veya yakınında elde edildi. Plastoglobüllerin başarılı bir şekilde izole edilmesinden sonra, arabidopsis thaliana fibrilin 1a ve arabidopsis thaliana fotosistem II alt ünitesi D1'e karşı yükseltilen antikorlar kullanılarak saflık değerlendirmesi için geliştirilen immünoblotlar, fibrilin homologlarının öncelikle plastoglobüllerden ziyade tilakoidlerle ilişkili olduğunu göstermiştir.Yüzer pedin verimli ve konsantre bir şekilde ekstraksiyonunu sağlamak için, şırınga iğne deliğini tamamen suya batırılmışken tamponun sıvı yüzeyinin hemen altına yerleştirin, ardından yavaşça yukarı çekin. İzole plastoglobül örnekleri, sonraki proteomik veya lipidomik çalışmalara uygundur ve farklı çevresel koşullar altında hedeflenen protein-lipid bileşimindeki değişiklikleri göstermek için kullanılmıştır. Bu teknik, ilişkili protein kinaz aktivitesinin keşfi ve daha sonraki biyokimyasal araştırmalarla oligomerik protein komplekslerinin varlığı da dahil olmak üzere plastoglobülün yeni çalışmalarını kolaylaştırmıştır.

plastoglobule-lipid-droplet-isolation-from-plant-leaf-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Polar lipid özler bireysel glycerolipids Kompozisyon ve yağ asidi kompozisyonu basit ve sağlam bir lipid profil deneyde belirlenir. Bu amaçla, glycerolipids ince tabaka kromatografisi ile izole edilir ve onların açil grupları transmethylation tabi. Yağ açil methylesters gaz-sıvı kromatografisi ile sayısallaştırılmış.

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde

Kaynak: Shivaiah, K., ve diğerleri. Bitki Yaprak Dokusundan ve Siyanobakterilerden Plastoglobül Lipid Damlacık İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2022)Video, plastoglobüllerin siyanobakterilerden izolasyonunu göstermektedir. Bir siyanobakteri kültürü ile başlar ve mekanik kuvvet kullanarak hücre bozulması yoluyla ilerler. Fotosentetik pigmentlerin salınması, başarılı bir lizizi gösterir. Daha sonra hücresel bileşenleri yoğunluğa göre ayırmak için bir sükroz adım gradyanı kullanılır ve düşük yoğunluklu...

Plastoglobüllerin Fotosentetik Bakterilerden Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Kaynak: Shivaiah, K., ve diğerleri. Bitki Yaprak Dokusundan ve Siyanobakterilerden Plastoglobül Lipid Damlacık İzolasyonu. J. Vis. Uzm. (2022).Bu video, sükroz yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak plastoglobüllerin siyanobakterilerden izolasyonunu göstermekte, lipit açısından zengin, düşük yoğunluklu yapılarını vurgulamakta ve aşağı akış analizi için yapısal korumalarını sağlamaktadır.

Siyanobakteriyel Plastoglobüllerin Yoğunluk Gradyanlı Saflaştırılması

: 1) hücresel lipid damlacıkları izole maya hücreleri ve 2) insan plasenta sunulmuştur için iki teknikleri. Her iki prosedürlerinin merkezinde damlacıkları ihtiva eden elde edilen yüzer tabaka, hali hazırda, göz ile görselleştirilmiştir ekstre edilmiş ve saflık için Western Blot analizi ile tayin edilebilir yoğunluk gradyan santrifüj vardır.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Lipid poliesterler, bitki kütikülü ve suberin içeren difüzyon bariyerleri olmak üzere iki hücre duvarı modifikasyonunun yapısal bileşenlerini oluşturur. Bu videoda, bütün delipide edilmiş yapraklardan kütini depolimerize etmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, kütin veya suberin biyosentezinde tehlikeye giren mutantların araştırılmasına uygulanabilir.

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

Burada, bir protokol fucoxanthin klorofil a/c proteinler (FCP) Diyatomlarla dan ayırmak ve onları uyarma enerji transferi iyon kompozisyon değişiklikleri üzerine çalışmaya doğal lipit kompozisyonları ile lipozomlar içine dahil mevcut.

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

Burada, Arabidopsis yaprakları ve onların üç ana alt bölmeler (zarf, stroma ve thylakoids) sağlam kloroplast arındırmak için bir yöntem tarif fark centrifugations, sürekli Percoll degradeler, bir arada kullanarak ve iş öğelerinin sürekli olmayan sükroz degradeler. Subplastidial ve immunoblotting ve proteomik proteinlerin hücre altı yerelleştirme için önemli bir yöntemdir.

Kloroplast alt bölmeler Arabidopsis üzerinden hazırlanması Protein yerelleştirme Immunoblotting veya proteomik analizi için

Bu iletişim kuralı bir roman yöntemi lipid damlacık tecrit ve arıtma fare karaciğer, bir iyi kurulmuş endoplazmik retikulum izolasyon kit kullanarak üzerinden kurar.

Bir Well-established organel izolasyon Kit kullanarak hızlı Lipid damlacık yalıtım Protokolü

Mevcut protokol, filobobizomların siyanobakterilerden santrifüjleme ile süreksiz bir sakkaroz yoğunluk gradyanı ile izolasyonunu detaylandırıyor. Sağlam fitoidürlerin fraksiyonları 77K floresan emisyon spektrumu ve SDS-PAGE analizi ile doğrulanır. Ortaya çıkan fitobilizom fraksiyonları TEM ve kütle spektrometresi analizinin negatif boyanması için uygundur.

Siyanobakterilerde Bozulmamış Fitoidinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Öğrenin, bitki yaprak dokusu ve siyanobakterilerden plastoglobül lipid damlacıklarını hızlı ve verimli bir şekilde izole etme yöntemini. Bu teknik, biyokimyasal analizler için saflaştırılmış örnekler sağlar.

Plastoglobül Lipid Damlacığı İzolasyonu Bitki Yaprağı Dokusu ve Siyanobakterilerden

Daha fazla video keşfet