Name: Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Öğrenin, primer T-hücrelerinde T-hücre reseptörü kaynaklı kalsiyum akışını tam spektrumlu akış sitometrisi ile aynı anda ölçün. Bu yöntem, hücre izolasyonu yapmadan alt küme ve yüzey fenotipini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01AI132419, CU | AMC İmmünomikro Akış Sitometrisi Paylaşılan Kaynak, RRID: SCR_021321, Aurora ve SpectroFlo yazılımı üzerinde tam spektral sitometrik analizin sürekli tartışmaları için Cytek'teki meslektaşlarımıza çok teşekkür ederiz. Figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.

<ol><li>Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+T3+surface+molecules+in+human+T-cell+activation%3A+T3-dependent+activation+results+in+an+increase+in+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).</li>
<li>Huang, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+calcium+mobilization+study+%28flow+cytometry%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Cell calcium mobilization study (flow cytometry).</a> Bio-Protocol. 2 (9), 171(2012).</li>
<li>June, C. H., Moore, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).</li>
<li>Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+ions+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular ions by flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: An overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li>
<li>Nolan, J. P., Condello, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral flow cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit1.27 (2013).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801(2021).</li>
<li>Zhong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Interleukin-2-inducible+T-cell+Kinase+%28ITK%29+and+Resting+Lymphocyte+Kinase+%28RLK%29+using+a+novel+covalent+inhibitor+PRN694%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).</li>
<li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).</li>
<li>Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+signaling+regulated+by+the+tec+family+kinase%2C+Itk%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287(2010).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neurosciene%22%5BJournal%5D)">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).</li>
<li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf">https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf</a> (2022).</li>
<li>SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022).</li>
<li>FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.flowjo.com/solutions/flowjo">https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</a> (2022).</li>
<li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+points+in+early+T-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li>
<li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression%2C+but+triggers+cytokine-related+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri rakip çıkarları yoktur.

Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi 7,8 kullanarak titre edilmiş Hint-1 oranmetrik indikatör boyası ile yüklenen primer murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmış optimize edilmiş bir tahlili açıklamaktadır. Tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak kalsiyum akısı testleri yapmanın avantajı, Indo-1 floresansının değerlendirilmesi ile birlikte yüzey hücresi belirteci boyamasını çoklama yeteneğidir. Tam spektrumlu akış sitometrisi, ...

T-hücresi reseptörü (TCR) ile indüklenen kalsiyum akışı, T-hücresi aktivasyonunun yararlı bir ölçüsüdür ve sıklıkla bir T-hücresi popülasyonunun TCR sinyal yolu1'in proksimal adımlarında bozulmuş yanıtlara sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Kalsiyum akışının ölçümleri genellikle T hücrelerinin bir veya bir çift floresan kalsiyum gösterge boyası ile önceden etiketlenmesi ve daha sonra TCR çapraz bağlama 2,3,4'ten sonra gerçek zamanlı olarak akış sitometrisi kullanılarak floresan sinyallerinin incelenmesiyle gerçekleştirilir. Orantı-metrik bir kalsiyum boyası olan Indo-1, kalsiyum bağlanma5'e bağlı iki farklı dalga boyunda pik emisyonlara sahip UV lazer tarafından uyarılır ve canlı lenfositlerde kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizi için yaygın olarak kullanılan bir gösterge boyasıdır. Hint-1'in emisyon profili oldukça geniş olduğundan, Hint-1 değerlendirmesini bant geçişli akış sitometrisi ile çoklu hücre yüzey belirteçlerinin eşzamanlı analizi ile birleştirmek zor olabilir. Bu sınırlama, önceden saflaştırılmış T hücresi popülasyonlarına veya sınırlı sayıda hücre yüzey molekülü tarafından tanımlanan popülasyonlara kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizinin kullanımını kısıtlar.
Primer lenfositlerin heterojen popülasyonları üzerindeki kalsiyum yanıtlarının bant geçişli akış sitometrisi kullanılarak ölçülmesinin sınırlamalarını ele almak için, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak Hint-1 floresansını ölçmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu yöntem, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanarak, Hint-1'in hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoğullanmasına izin verir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin geleneksel akış sitometrisine göre avantajı, floresan sinyallerini yüksek oranda örtüşen boyalardan ayırt etme kabiliyeti ve böylece her numunede aynı anda değerlendirilebilen yüzey belirteçlerinin sayısını arttırmasıdır. Geleneksel akış sitometrisi bandpass filtreleri kullanır ve dedektör sistemi6 başına bir florokrom ile sınırlıdır. Tam spektrumlu akış sitometrisi, beş lazerli spektral akış sitometri sistemi 7,8 üzerinde 64 dedektör kullanarak florokromun tüm spektrumu boyunca sinyaller toplar. Ek olarak, tam spektrumlu akış sitometrisi, geleneksel akış sitometrelerinde bulunan fotoçarpan tüp dedektörlerine göre artan duyarlılığa sahip APD (Çığ Fotoğraf Diyot) dedektörlerinden yararlanır8. Sonuç olarak, bu yaklaşım, kalsiyum boya etiketlemesinden önce spesifik T hücresi popülasyonlarının izolasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırdığından, periferik kan mononükleer hücreleri veya murin sekonder lenfoid organ hücresi süspansiyonları gibi heterojen hücre popülasyonları için idealdir. Bunun yerine, veri toplandıktan sonra hücre yüzey belirteci ekspresyon profilleri ve akış sitometrisi geçişi, ilgilenilen her popülasyondaki kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu raporda gösterildiği gibi, Hint-1, sekiz florokrom konjuge antikorla kolayca birleştirilebilir ve bu da toplam 10 benzersiz spektral imza ile sonuçlanır. Ayrıca, bu yöntem konjenik olarak farklı fare çizgilerinden gelen hücre karışımlarına kolayca uygulanabilir ve bu da gen hedefli bir fare hattından gelenlere kıyasla vahşi tip T hücrelerindeki kalsiyum tepkilerinin eşzamanlı analizine izin verir.

<table><tbody><tr><td>12 kuyulu TC muameleli plakalar</td><td>Hücre Tedavisi</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik</td><td>Greiner Bio1</td><td>41-12-17-03</td><td>50 mL Kapaklı polipropilen santrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>5 mL polisteren akış tüpleri</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>5 mL şırınga</td><td>BD şırınga 309646</td><td></td><td>sadece piston kullanılır sheith atılır</td></tr><tr><td>70uM filtre</td><td>Greiner bio1</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>aCD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>AKC lizis Tamponu</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Aurora Spektral Akış Sitometresi</td><td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banyo Boncukları</td><td>coleparmer</td><td>Ürün # UX-06274-52</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>Tonbo</td><td>50-0193-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD1d Tetramer APC</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD25 PECy7</td><td>ebioscience</td><td>15-0251</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC Cy7</td><td>Tonbo</td><td>25-0042-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>Hücre İnkübatörü</td><td>Resmi Bilimsel</td> Diseksiyon Araçları <td></td><td></td></tr><tr><td>forseps</td><td>McKesson</td> <td># 487593</td><td>Doku Forseps McKesson Adson 4-3 / 4 İnç Uzunluk Ofis Sınıfı Paslanmaz Çelik NonSteril Olmayan Kilitlenmez Başparmak Kolu 1 X 2 Diş</td></tr><tr><td>Diseksiyon Araçları Makas</td><td>McKesson</td> <td># 970135</td><td>Ameliyat Makası McKesson Argent & trade; 4-1 / 2 İnç Cerrahi Sınıf Paslanmaz Çelik Parmak Yüzük Kolu Düz Keskin Uç / Keskin Uç</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>DPBS&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>NC1280093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclond</td><td>SH30071.03</td><td>lot AE29165301</td></tr><tr><td>FlowJo Yazılımı</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Indo1-Ester Boya</td><td>ebioscience</td><td>65-085-39</td><td>Kalsiyum Yükleme Boyası&nbsp;</td></tr><tr><td>iyonomisin</td><td>Millipore</td><td>407951-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Canlı / Ölü Hayalet 540</td><td>Tonbo</td><td>13-0879-T100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri 1.7mL</td><td>Light Labs</td><td>A-7001</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin / L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PRN694</td><td>Med Chem Express</td><td>Hy-12688</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Anti-Fare CD16 / CD32 (FC Kalkanı) ( 2.4G2)</td><td>Tonbo</td><td>70-0161-M001</td><td>FC Blok</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>1875093</td><td>&nbsp;+ fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>RPMI fenol içermeyen</td><td>Gibco</td><td>11835030</td><td>&nbsp;-fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>Masa üstü santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra612</td><td></td></tr><tr><td>TCR & beta; PerCP Cy5.5</td><td>ebioscience</td><td>45-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>TCR&gamma;/&delta; Pe Cy5</td><td>ebioscience</td><td>15-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu Reaktif Paketi</td><td></td><td>Ürün No: C06019</td><td>Tripan</td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su</td><td>Banyosu Fisher Marka Kuru banyo</td><td></td><td></td></tr> içerir</tbody></table>

primer murin t-hücrelerinde t-hücresi reseptörü kaynaklı kalsiyum akışının tam spektrumlu akış sitometrisi ile analizi

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

T hücresi reseptör stimülasyonuna yanıt olarak kalsiyum akışı, T hücresi sinyallemesinin yaygın bir ölçüsüdür. Kalsiyum sinyalizasyonunu bant geçişli akış sitometrisi ile değerlendirmek için çeşitli kalsiyum indikatör boyaları geliştirilmiştir. Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak birincil murin T-hücrelerindeki kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmıştır. Toplam splenositler, orantısal kalsiyum indikatör boyası Indo-1 ve hücre yüzey moleküllerine florokrom konjuge antikorlardan oluşan bir panel ile etiketlenir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin yeteneklerinden yararlanmak, Hint-1 ile kombinasyon halinde çok çeşitli hücre yüzeyi lekelerini kullanmak için bir platform sağlar. Hücreler daha sonra T hücresi reseptörünü uyarmak için bir anti-CD3 antikorunun eklenmesinden önce ve sonra 37 ° C'de gerçek zamanlı olarak analiz edilir. Spektral sinyallerin karıştırılmasından sonra, kalsiyuma bağlı kalsiyumun kalsiyumsuz Hint-1'e oranı hesaplanır ve her kapılı splenosit popülasyonu için zaman içinde görselleştirilebilir. Bu teknik, çoklu hücre popülasyonlarında kalsiyum yanıtlarının eşzamanlı analizine izin verebilir.

Çoklu yüzey lekelerine sahip bir Hint-1 oranmetrik boya kullanarak birincil murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Fare splenositlerini tek bir hücre süspansiyonuna topladıktan ve işledikten sonra, hücreler bir Hint-1 esteri ile boyanır ve yüzey florokroma bağlı antikorlarla boyanır. Boya yüklemesi ve antikor boyama işlemi tamamlandıktan sonra, lenfosit örnekleri biyolojik bir sıcaklığa (37 ° C) kadar ısıtılır. Numuneler dah...

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Protokol, araştırmacıların birincil T hücrelerindeki kalsiyum yanıtını aynı anda ölçmelerine ve alt kümelerini ve yüzey fenotiplerini değerlendirmelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, kalsiyum yanıtlarını incelemeden önce hücrelerin belirli alt kümelerini izole etme ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır. Başlamak için, 50 mikrogram Hint-1 içeren bir şişeye 50 mikrolitre DMSO ekleyerek Hint-1'nin mikrolitre stok çözeltisi başına bir mikrogram hazırlayın. Stok çözeltisini uygun bir cRPMI hacmine ve mililitre başına altı mikrogramlık bir konsantrasyona seyreltin.Ortamı 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, mililitre başına beş ila 6 milyon hücre elde etmek için önceden hazırlanmış bir hücre süspansiyonunu bire bir oranda seyreltmek için bu ortamı kullanın. Daha sonra, 12 kuyucuklu bir doku kültürü plakasına, deneysel durum başına kuyu başına bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.Indo-1 boya yüklü hücrelere EGTA ekleyerek kalsiyumsuz Indo-1 için tek bir lekeli kontrol örneği hazırlayın. Florofor veya Hint-1 boyası olmadan biyolojik negatif kontrol için bir kuyu hazırlayın. Akış sitometresindeki boya yüklü hücre süspansiyonuna 50 mikromol konsantrasyonunda iyonomisin ekleyerek bir Hint-1 pozitif kontrol hazırlayın.Ayrıca, antikor konjuge floroforlar kullanarak ek hücre popülasyonları için tek leke kontrolleri için bir kuyu hazırlayın. Ardından, milyon hücre başına iki mikrogram FC reseptörü bloke edici antikor ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için her 15 dakikada bir dokunarak plakayı 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüm hücre hacmini plakadan karıştırın ve çıkarın ve 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.Süpernatanı santrifüj edin ve boşaltın. Hücreler bir mililitre önceden ısıtılmış cRPMI ile yıkandıktan sonra, pelet tekrar ve süpernatanı boşaltın. Hücreleri bir mililitre cRPMI'de yeniden askıya alın ve her tüpü inkübe edin, tüpün üstünü gaz değişimi için hafifçe açık bırakarak hücre içi esterlerinin tamamen deesterifikasyonuna izin verin.Daha sonra, kullanıcı tanımlı tüm florokrom konjuge antikorların ana karışımını hazırlayın ve hücre hacminin bir mililitresi için kalan hücrelere ekleyin. Dinlendikten sonra, hücreleri pelet edin ve dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş bir mililitre cRPMI'de yeniden askıya alarak peleti yıkayın. Bu adımı tekrarlayın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin.Kapaklı beş mililitrelik polistiren akış tüpü kullanarak 500 mikrolitre fenol kırmızısız cRPMI'de bireysel numuneleri yeniden askıya alın. Kalsiyum akısı analizini kullanarak sıcaklığı korumak için, küçük bir su banyosuna banyo boncukları ekleyerek bir boncuk banyosu hazırlayın ve 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. 50 mililitrelik bir kronikleşme tüpünü dikkatlice ikiye bölün ve tüpün üstünü atın.Kalan tüpün dörtte üçünü banyo boncuklarıyla doldurun ve boncuk banyosunda 37 santigrat dereceye ulaşmasına izin verin. Boncuk banyosunu, tüpü konumlandırmak için bir strafor rafla birlikte bir akış sitometresinin yanına yerleştirin. Akış sitometresindeki analizden önce, tüpleri yedi dakika boyunca ayrı ayrı 37 santigrat dereceye ısıtın.Akış sitometresi yazılımına giriş yapın ve Kütüphane sekmesine tıklayın. Ardından, kalsiyuma bağlı Hint-1 ve kalsiyumsuz Hint-1 eklemek için floresan etiketleri seçin. Ardından floresan etiket grupları altında UV lazeri seçin ve floresan etiket adı eklemek için ekle'ye tıklayın.Lazer uyarma ve emisyon dalga boyunu seçin ve ardından Kaydet'e tıklayın. Deneme kurulumuna devam edin. Edinme sekmesine tıklayın, Yeni bir deneme açın/oluşturun ve istediğiniz floresan etiketlerini denemeye ekleyin.Deneme için bir başvuru grubu ve yeni bir örnek grup oluşturun ve her iki grubu da etiketleyin. Almalar sekmesi altında, olayları 10 milyonda en fazla 10 milyona, durdurma ses düzeyini en fazla 3000 mikrolitre hacme ve durma süresini en fazla 36.000 saniyeye kaydedecek şekilde ayarlayın. Çok renkli panelde bulunan kullanıcı tanımlı konjuge antikorlar ve Indo-1 fonksiyonel boya için tek lekeli kontroller elde edin.Kalsiyuma bağlı Hint-1 pozitif kontrol ve vortekse 50 mikromol iyonomisin ekleyin. Akış tüpünü numune enjeksiyon panosuna ekleyin ve Kaydet'e tıklayın. Ardından akış sitometresine kalsiyumsuz Indo-1 negatif kontrolü ekleyin ve Kaydet'e tıklayın.Tek lekeli kontrollerin karışımını Karıştır düğmesine tıklayarak çıkarın. Karıştırmayı kaldırma işlemi tamamlandıktan sonra, karıştırılmamış çalışma sayfasını kullanarak örnekteki kalıntıları kaldırmak için SSC-A ve SSC-A ile SSC-H gibi sıralı grafikler oluşturun. Ardından Arsa'ya tıklayarak kapılar oluşturun.Çalışma sayfasına bir grafik ekleyin ve aşağı akış kapılı bir popülasyon oluşturmak için kapının içine çift tıklayın. İlgilenilen tüm popülasyonlar hesaba katılana kadar devam edin. Daha sonra, sıralı analiz için önceden hazırlanmış tek lekeli kontrol numunelerini 37 santigrat dereceye ısıtın.Akış sitometri yazılımını kurun ve akış sitometresinin akışkan stabilitesini sağlamak için DI'yi buzlu suda iki ila üç dakika çalıştırın. İlgilenilen popülasyonu dahil etmek için çokgen dikdörtgenini veya elips kapısı düğmelerini kullanarak kapılar oluşturarak karıştırılmamış çalışma sayfasında sıralı grafikler ayarlayın. Kapının içine çift tıklayın ve y ve x ekseni parametrelerini SSC-A ve SSC-H olarak değiştirin.Eksene sol tıklayarak eksen parametrelerini tanımlamayı tamamlayın. SSC-A ve canlılık boya sinyali ile bir grafik oluşturun. Amin boyası boyaması için negatif olan canlı hücreleri açın.Canlı ölü boyama için negatif olan canlı hücreler hem y hem de x ekseninde sıfır işaretinde kümelenecektir. Sadece tek hücreli canlı lenfositleri içeren yeni bir arsa oluşturmak için iç grafiğe çift tıklayın. Kalsiyum akışının görselleştirilmesi için Y eksenini X eksenindeki zamana karşı Hint-1 olarak değiştirin.Daha sonra ısıtılmış biyolojik numuneyi makinenin SIT içine yerleştirin. Sınırlı sayıda hücre popülasyonunda kalsiyum akışını görselleştirmek için örnekleri orta akış hızında saniyede 2.500 ila 3000 olayda çalıştırın. Bir sonraki tüpü satın alma kontrolünde boncuk banyosuna ekleyin.Numunede bazal düzeyde kalsiyum sinyallemesi elde etmek üzere ilk verileri 30 saniye boyunca kaydetmek için Kaydet'e basın. Ardından Durdur'a tıklayın ve tüpü numune enjeksiyon portundan çıkarın. Kalsiyum akışını başlatmak için 30 mikrogram konjuge edilmemiş anti-CD3'ü doğrudan numune tüpüne ekleyin.Tüpü hızlı bir şekilde numune enjeksiyon portuna geri yerleştirin ve yazılımda Kaydet'e basın. Yazılımdaki edinme kontrolleri altında geçen süreyi izleyerek yedi dakika boyunca verileri kaydedin. Ardından yazılımda Durdur'a basın.Mililitre iyonomisin başına bir mikrogram ekleyin ve ilgili hücrelerde maksimum kalsiyum sinyalini elde etmek için 30 saniye boyunca kaydedin. Sonraki örneğe geçin ve tüm örnekler toplanana kadar iş akışını yineleyin. Denemeyi kaydedin ve dışa aktarma zip dosyasına tıklayın.Karıştırılmamış dosyalar harici akış sitometri analiz yazılımına yüklenir. Yan saçılmaya karşı bir zaman grafiğindeki kararlı tutarlı bir sinyal, akışkan stabiliteyi gösterdi. Lenfosit popülasyonu kapılıydı ve bunu takiben, yan saçılma yüksekliği ile alan arasındaki bir arsa üzerinde singletlerin ayırt edilmesi izledi.Singlet'lar uygulanabilirlik açısından değerlendirildi. Daha sonra CD19-negatif popülasyonda geçit uygulandı. Bu T-hücresi alt kümeleri, kalsiyuma bağlı Hint-1 floresansını zamana karşı görselleştirerek CD4 ve CD8'e karşı antikorlar kullanılarak değerlendirildi.Bireysel hücre popülasyonlarında, kalsiyuma bağlı Hint-1'in zamana karşı grafiği, stimülasyondan önce bir taban çizgisi gösterdi. Hücre içi kalsiyum seviyeleri azaldıkça pik yanıt ve iyonomisin eklenerek kalsiyum yanıtı ortaya çıktı. Anti-CD3 antikor ilavesinden önce, zayıf bir kalsiyuma bağlı Indo-1 sinyali tespit edildi.Tepe tepkisi sırasında, hücreler güçlü bir kalsiyuma bağlı Hint-1 sinyali gösterdi ve kalsiyumsuz Hint-1'i azalttı. Zirveden beş dakika sonra, Hint-1 floresansı neredeyse taban çizgisine geri döndü. İyonomisin ilavesinden sonra, hücrelerin yeterli boya yüklemesini gösteren sağlam bir kalsiyum bağlı Hint-1 sinyali görselleştirildi.Nadir popülasyonların analizi, ilgilenilen her popülasyona geçit verdikten sonra kalsiyuma bağlı Hint-1'e karşı kalsiyumsuz Hint-1'i çizerek gerçekleştirildi. Ve her bir alt küme için tüm zaman boyunca kalsiyum tepkisini analiz etmek. Tam spektrum profillemesi kullanan kalsiyum akısı, çeşitli immün alt kümelerde yüksek parametreli akış sitometrik analizine yol açabilir.T-hücresi alt kümelerinin tarafsız kümelenmesi için yüksek boyutlu analiz, gelişmiş analiz için yüksek parametreli akış sitometrisi ile birlikte kullanılabilir. Bu teknik, toplu bir numunede birbirleriyle bağlantılı olarak çoklu bağışıklık alt kümelerinin analizi için geliştirilmiştir.

analysis-t-cell-receptor-induced-calcium-influx-primary-murine-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genetik mühendisliği ya da büyük örneklem büyüklüğü gerektirmeden, hassas bir doğal protein-protein etkileşimleri, sağlam, biyokimyasal değerlendirme sağlar IP-FCM yöntem sunulmuştur.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem...

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Bu video, antijenik lipozomların kullanımı yoluyla B hücresi aktivasyonunun değerlendirmesini göstermektedir. Kalsiyuma duyarlı Hint-1 boyası ile muamele edilen B hücreleri, akış sitometrisi kullanılarak ayırt edilir ve mor-mavi floresan oranları analiz edilir. Hücreler antijenik lipozomlarla karşılaştıkça, kalsiyum akışı yoluyla B hücresi aktivasyonunu tetikler ve zamanla mor-mavi floresan sinyal oranını aşamalı olarak arttırır.

Kalsiyum Akı Testi Kullanılarak Antijenik Lipozomlarla B Hücresi Aktivasyonunun İzlenmesi

Bu video, T hücrelerinde T hücresi reseptörünün neden olduğu kalsiyum akışını analiz eder. Anti-CD3 antikorları, T hücresi sinyal yollarını aktive ederek Indo-1 boyası ile bağlanan hücre içi kalsiyum iyonlarında bir artışa yol açar. Akış sitometrisinde, kalsiyumsuz durumdan kalsiyuma bağlı duruma bir spektrum kayması, T hücresi reseptörünün neden olduğu kalsiyum akışı ile ilişkilidir.

Kalsiyum İndikatör Boyası Kullanarak T Hücresi Reseptörü ile İndüklenen Kalsiyum Akışının Değerlendirilmesi

Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Bu kağıt sitometrisi görüntüleme akışı kullanarak T hücrelerinin karışık bir popülasyonda alloreaktivitesini ölçülmesi için bir yöntemi tarif etmektedir.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Burada, biz birincil insan T hücreleri ve antijen sunan hücreler arasındaki bağışıklık sinapslarda nitel ve nicel analizi için tam bir iş akışı tanımlamak. Yöntem alma ve nispeten kısa bir süre içinde birkaç bin hücre görüntülerin değerlendirme sağlar görüntüleme akış sitometresi temel alır.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

Tek hücreli duyarlılığı sağlayarak, gerçek zamanlı Akış Sitometresi multimodal reseptör işlevleri canlı kültürlerin ölçmek için benzersiz olarak uygundur. Yetişkin nöral progenitör hücreler kullanarak, P2X7 reseptör işlevi tarafından elde kalsiyum göstergesi boya, transmembran gözenek oluşumu etidyum bromür alımı ve floresan lateks boncuk kullanarak fagositoz ile kalsiyum akını ile değerlendirildi.

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Burada, floresan mikroskobu kullanarak birincil murin ve insan T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları olarak bilinen ilk yerel Ca 2+ sinyallerini çözmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, bağışıklık hücreleri içindeki Ca2+ sinyal yolaklarını inceleyen ve işlevlerini daha da çözen araştırmacılar için değerli bir kaynak görevi görür.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Öğrenin, primer T-hücrelerinde T-hücre reseptörü kaynaklı kalsiyum akışını tam spektrumlu akış sitometrisi ile aynı anda ölçün. Bu yöntem, hücre izolasyonu yapmadan alt küme ve yüzey fenotipini değerlendirir.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Daha fazla video keşfet