Bir Mikrodiyaliz Sistemi Kullanarak Bilinçli Sıçanlardan Hipokampal Hücre Dışı Sıvının Gerçek Zamanlı Dinamik Toplanması
21 Ekim 2022
Buradaki protokol, bir mikrodiyaliz sistemi kullanarak uyanık sıçanların hipokampüsünden hücre dışı sıvının ayrıntılı bir gerçek zamanlı dinamik örneklemesini sağlar.
Hipokampal hücre dışı sıvı ve beyin mikrodiyaliz tekniği ile kalabalık, santral sinir hastalıklarının hastalığa özgü mikro monitörizasyonuna katkıda bulunur. Beyin mikrodiyalizi tekniği, anestezi yapılmamış sıçanların belirli beyin bölgelerinde interstisyel beyin sıvısının dinamik ve sürekli engizisyonunu sağlar. Anestezi uygulanan sıçanı stereotaksik bir beyin bulucuya sabitleyerek başlayın ve traş edilen cerrahi bölgeyi operasyondan önce üç kez povidon iyot ve etanol çubukla silin.
Daha sonra cerrahi makasla ortada 1,5 santimetrelik bir kraniyal yüz kesisi yapın ve cerrahi makas ve oftalmik forseps kullanarak periosteumu çıkarın. Bregma'yı bazal pozisyon olarak düşünürsek, kafatası matkabı kullanmak, hipokampal CA1 bölgesinde iki milimetrelik bir açıklığı delmek için endokranyumu delin. Şimdi kateter stiletini stereotaksik bir beyin bulucunun tutucusuna sabitleyin ve mikrodiyaliz muhafazasının anteroposterior, mediolateral ve dorsal ventral pozisyonlardaki konumunu ayarlayın.
Beyin stereo bulucusunun dorsoventral kapağını ayarlayın ve mikrodiyaliz muhafazasını CA1 bölgesine 3,5 milimetre derinlikte implante edin. İki milimetre çapında üç diyafram açıklığı daha açın, böylece üç açıklık prob açıklığının merkezi olarak yerleştirildiği bir üçgen oluşturur. İmplant, açıklıklara bir milimetre derinlikte vidalar yerleştirir ve prob kateterini diş çimentosu ile sabitler.
Daha sonra cildi kapatmak için 4-O cerrahi bir dikiş kullanın. Mikrodiyaliz pompası mikroşırıngasını ACSF uyanık aktivite cihazı ve kriyojenik numune toplayıcı ile üreticinin talimatlarına göre bağlayın. Daha sonra, boru hattındaki havayı boşaltmak için, mikrodiyaliz pompasını dakikada bir mikrolitre hızına ayarlayın.
Daha sonra boru hattını ve beyin mikrodiyaliz probunu bağlayın ve probun yüzeyi hafif nemli olana kadar proba ACSF enjekte etmek için mikrodiyaliz pompasını dakikada bir mikrolitre hızında çalıştırın. Probu daha sonra kullanmak üzere bir heparin sodyum enjeksiyon çözeltisine daldırın. HECF'yi uyanık sıçandan toplamak için, beyin mikrodiyaliz probunu prob kateterine yerleştirin ve sıçanların hareket etmekte özgür olmalarını sağlamak için sıçanı dolgulu bir odaya yerleştirin.
Sıçanın serbest hareketi sırasında mikrodiyaliz boru hatlarının iç içe geçmesini önlemek için çok kanallı döner kontrolörü açın. Ardından mikroşırınga pompasını açın ve ACSF'yi dakikada bir mikrolitre hızında pompalayın. Mikrodiyaliz HECF toplama sisteminin 60 dakikalık bir dengesinden sonra, periyodik olarak HECF toplayın.
Örnekleme sonlandırmadan sonra, beyin mikrodiyaliz probunu prob kateterinden çıkarın. Probu deiyonize suya batırın ve boru hattından ve probdan mahsur kalmış tuz birikimlerini gidermek için 12 saat boyunca deiyonize suyla lavajlayın. Probu çıkarın ve dört santigrat derecede% 0.05'lik bir tripsin çözeltisine yerleştirin.
Beyin mikrodiyaliz tekniği ile elde edilen hipokampal hücre dışı sıvı, belirlenen örnekleme hızında su benzeri, renksiz ve saydamdır. En önemli prosedürler mikrodiyalizin CA1 bölgesine dikkatlice implante edilmesi ve probun pop kateterine yerleştirilmesidir. Mikrodiyaliz basit tekniği, belirli beyin bölgelerindeki hastalık belirteçlerinin dinamik değişimine, ilacın etkinliğinin maddesine ve ilaç bileşenlerinin doku katabolizmasına yardımcı olmayı mümkün kılar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, beyin mikrodiyaliz tekniği kullanılarak uyanık sıçanlardan hipokampal hücre dışı sıvının (HECF) gerçek zamanlı dinamik örneklemesi için bir protokol sunmaktadır. Bu işlem, denekleri anesteziye tabi tutmadan belirli beyin bölgelerinden sürekli örnekleme elde ederek araştırmacıların merkezi sinir sistemi hastalıklarındaki hastalığa özgü belirteçleri izlemesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Nörodejeneratif Hastalıklar
- Mikrodiyaliz Teknikleri
Arka Plan
- Hücre dışı sıvı dinamiğinin anlaşılması, nöronal mekanizmaların ve plastisitenin incelenmesi için kritik öneme sahiptir.
- Mevcut yöntemler tipik olarak biyolojik bağlamı etkileyebilecek invaziv teknikler içerir.
- Mikrodiyaliz, denek uyanıkken interstisyel sıvının toplanmasına olanak tanıyarak daha ilgili veriler sağlar.
- Bu protokol, canlı modellerde beyin sıvısı kompozisyonunun sürekli izlenmesi ihtiyacını karşılamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Girişimsel olmayan bir örnekleme yaklaşımı uygulayarak hipokampustaki hastalık belirteçlerinin izlenmesini geliştirmek.
- Araştırmacıların prosedürü tekrarlayabilmeleri için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunmak.
- İlaç etkilerini ve metabolik değişiklikleri zaman içinde gözlemlemek için güvenilir bir sistem kurmak.
Kullanılan Yöntemler
- Çalışmada, hipokampusun CA1 bölgesine implante edilmiş bir mikrodiyaliz sistemi kullanılmaktadır.
- HECF örneklemesi için biyolojik model olarak uyanık, anestezi uygulanmamış sıçanlar kullanılmıştır.
- Mikrodiyaliz tekniği, sıvıyı dakikada bir mikrolitre hızla ölçmektedir.
- Kritik adımlar arasında hassas kateter implantasyonu, dengelenme ve düzenli örnekleme aralıkları yer almaktadır.
- Veri bütünlüğünü sağlamak amacıyla, örnekleme sonrası mikrodiyaliz probunun temizliği gerçekleştirilir.
Ana Sonuçlar
- Toplanan HECF berrak ve renksizdir, bu da hastalık belirteçlerinin analizine olanak tanır.
- Kapsamlı metodoloji, nöronal ortamlardaki dinamik değişiklikler üzerinde deney yapılmasına imkan sağlar.
- Bu yöntemle elde edilen bilgiler, ilaç etkinliğinin değerlendirilmesine ve doku katabolizmasının anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, beyin sıvı dinamiği ve hastalık süreçlerine dair anlayışımızı geliştirmede mikrodiyalizin potansiyelini ortaya koymaktadır.
- Sürekli izleme kapasitesi, ilaç etkisi ve metabolik durumlardaki gerçek zamanlı değişikliklerin değerlendirilmesine olanak tanır.
- Bu bulgular, nörolojik hastalıklarla mücadele stratejilerinin geliştirilmesi açısından kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bilinçli sıçanlarda hipokampal hücre dışı sıvının (HECF) gerçek zamanlı dinamik toplanması, MSS hastalık ilerlemesi ve ilaç etkinliği ile ilgili nörokimyasal değişimlerin doğrudan izlenmesine olanak tanır. Bu yetenek, hastalıkla ilişkili beyin bölgelerinden kantitatif, zaman çözünürlüklü biyobelirteç verileri sağlayarak translasyonel nörobilimdeki öngörü güvenilirliğini artırır. Bu yaklaşım, hipokampal yolları hedefleyen nöroterapötik portföyler için erken keşfi ve mekanistik risk azaltmayı destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- CNS hastalık mekanizmalarının altında yatan nörokimyasal dinamiklerin in vivo incelenmesine olanak tanır.
- Hipokampustaki ilaç ve metabolit etkilerini nicelleştirerek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Hastalıkla ilgili hücre dışı belirteçlerin doğrudan ölçümü yoluyla mekanistik risk azaltmayı kolaylaştırır.
Tarama & Analiz Geliştirme
- Alt bileşik taramaları için beyin hücre dışı sıvısının doğrulanmış, kantitatif örneklemesini sağlar.
- Uyanık hayvan modellerinde nörokimyasal verilerin tekrarlanabilir ve standardize edilmiş şekilde toplanmasına olanak tanır.
- MSS-aktif bileşiklere verilen farmakodinamik yanıtların değerlendirilmesi için assay geliştirmeyi destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Preklinik biyobelirteç ölçümlerini, translasyonel nörobilimdeki hastalıkla ilgili sonlanım noktalarıyla uyumlu hale getirir.
- İlaç etkilerini in vivo olarak takip ederek, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Gerçek zamanlı nörokimyasal veriler temelinde, riski ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu mikrodiyaliz yöntemi, uyanık sıçanlarda hipokampal hücre dışı sıvının gerçek zamanlı, kantitatif analizine olanak tanıyarak keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürece entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Dinamik biyobelirteç değişimlerini izleyerek, MSS hedefleri için hipotez testlerini ve yolak aydınlatmalarını destekler.
- Tarama: Bileşik değerlendirmesi için analize hazır, tekrarlanabilir nörokimyasal veriler sağlar.
- Analitik: Deneysel koşullar genelinde ilaç etkilerini ve hastalık durumlarını karşılaştırmak için kantitatif çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç ölçümünü klinik sonlanım noktalarıyla hizalayarak preklinik ve translasyonel çalışmalar arasında köprü kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: MSS ilaç keşfi ve biyobelirteç doğrulama iş akışları için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: MSS hedef doğrulamasında öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Nörokimyasal örneklemeyi standartlaştırır ve çalışmalar arasındaki tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Uygulanabilir biyobelirteç verileri sağlayarak go/no-go kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Dinamik in vivo kanıtlara dayanarak nöroterapötik adayların riskle uyumlu önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Stereotaksik cerrahi ve mikrodiyaliz probu implantasyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Mikrodiyaliz örneklemesi ve kantitatif analiz için özel enstrümantasyon gereklidir.
- Örnekleme hızlarının ve analitik protokollerin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı beyin bölgelerine veya hastalık modellerine adaptasyon, protokol optimizasyonu gerektirebilir.
- Prob kesme (cutoff) spesifikasyonları nedeniyle örnekleme, 20 kDa altındaki analitlerle sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
