İmmünohistokimya ile Anormal Prion Proteininin Saptanması

Bu teknik, dokularda PrP scrapie tekniği ile prion hastalıklarının doğrulayıcı tanısına, bilinen PrP scrapie birikim profiline cezai sapmayı değerlendirmek için PrP scrapie tiplerinin ve dağılımının analiz edilmesine olanak tanır. Teknik standartlaştırılmıştır ve dokularda PrP scrapie birikiminin görselleştirilmesini sağlayan PrP scrapie'ye spesifik antikorlar kullanır. Teknik ayrıca nöroanatomik alan ve hücrelerin tipi hakkında bilgi verir.

Slaytları doku bölümleriyle birlikte paslanmaz çelik bir boyama sepetine yerleştirerek başlayın. Sepeti bir ksilen banyosunda ortaya çıkarın. Üç dakika sonra, sepeti çıkarın ve bir kez daha daldırın.

Ksileni çıkarmak ve bölümleri yeniden sulandırmak için, sepeti mutlak bir etanol banyosuna batırın. Üç dakika sonra, sepeti çıkarın ve bir kez daha daldırın. Bölümleri bir dakika boyunca% 90 etanol banyosuna koymadan önce hava ile kurutun.

Daha sonra, bölümü bir dakika daha% 70 etanol banyosuna aktarın. Her etanol banyosu işlemi için, sürgü sepetini iki kez hafifçe çalkalayın ve bir sonraki transferden önce sepeti boşaltın. Sepeti bir dakika boyunca% 50 etanol banyosuna aktarın.

Doku bölümlerini oda sıcaklığında% 98 formik aside 30 dakika boyunca dikkatlice batırın. Bölümleri musluk suyunda beş dakika durulayın, ardından damıtılmış suda iki kez durulayın. 10 milimolar sitrat tamponunu 98 santigrat derecede 20 dakika boyunca ön işlemden geçirmek için 500 mililitre damıtılmış suyla doldurulmuş basınç odasında paslanmaz çelik bir boyama kabı kullanın.

Kalite kontrol amacıyla, sıcaklık ve basıncı izlemek için sepete yapışkan otoklav gösterge bandının bir bölümünü yerleştirin. Alarm, ekipmanın program süresine ve sıcaklığına ulaştığını gösterdiğinde, sepeti slaytlarla daldırın. Ardından, Nokta 2'yi ayarlamak için basınç odasındaki programı başlatın ve bu programın ilk ve son basıncını kaydedin.

Endojen peroksidazın inaktivasyonu için, numune bölümlerini içeren sürgü sepetini 30 dakika boyunca metanol içinde% 3 hidrojen peroksit banyosuna daldırın. Bölümleri akan su altında beş dakika boyunca köprüleyin Boşalttıktan sonra, bölümleri beş dakika daha Tris tamponlu tuzlu suya batırın. İmmün tespiti için, her bir slaydı Tris tamponlu salin ile önceden nemlendirilmiş ticari olarak temin edilebilen bir kapak plakası tutucusuna, doku tarafı tutucuya bakacak şekilde ve tutucunun iki alt noktasıyla çakışan sürgü kenarları olacak şekilde yerleştirin.

Hava kabarcıklarından kaçındığınızdan emin olun. Sürgü tutucu tertibatı başparmak ve işaret parmağı arasında tutun. Bir parmağınızı örnek slaytın üstünde, diğerini tutucunun altında tutun, ardından tertibatı sistemin galerisine yerleştirin.

Setin iyi monte edildiğinden emin olmak için, numune sürgüsü ile tutucu arasındaki kuyuyu, taşmadan Tris tamponlu salin ile doldurun. Bu noktadan itibaren, tutucu ile slayt arasında yaklaşık 80 mikrolitre Tris tamponlu salin tutulması gerektiğinden emin olun. Bölümlerin kurumasına izin vermeyin.

Tris tamponlu salin içindeki sekonder antikor konakçısı ile aynı türden% 20 normal serum ile slayt örneklerini 30 dakika boyunca ön inkübe ederek birincil antikor ile tedaviden önce arka plan boyamasını azaltın. Bölümleri yıkamadan, 200 mikrolitre birincil antikor çözeltisini doğrudan slayt tutucu setinin her bir kuyucuğuna uygulayın ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin. Bölümleri yıkamak için, kuyucukları Tris tamponlu salin ile doldurun ve beş dakika bekleyin.

Yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra, biyotinile sekonder antikoru Tris tamponlu salin içinde 1 ila 200 konsantrasyonda% 10 at serumu ile seyreltin. Tedavi edilecek bölüm sayısına bağlı olarak gerekli hacmi onarın.

Sürgülü tutucu setinin her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi uygulayın. Oda sıcaklığında 30 dakikalık inkübasyondan sonra, Tris tamponlu tuzlu su yıkamasını tekrarlayın. Avidin-biyotin kompleks peroksidaz ile inkübasyon için, reaktifi kullanımdan 30 dakika önce hazırlayın ve sürgülü plaka tutucunun her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre çözelti uygulayın.

İşiniz bittiğinde, plaka tutucuyu oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Bilinen transmissibl süngerimsi ensefalopatiler-negatif kontrol hayvanlarında spesifik olmayan immünoetiketleme düzeyi, spesifik anormal prion proteinlerinin immün etiketlemesini doğru şekilde yorumlamak için belirlenmiştir. Anti-PrP antikorları tarafından hedef dışı etiketlemenin, ayrık intranöronal ince partikül boyama, nöropilde düzensiz ince doğrusal leke iplikleri, bazı gri ve beyaz cevher alanlarında yaygın partikül olmayan etiketleme ve nöronların yaygın sitoplazmik etiketlenmesi olarak ortaya çıktığı kaydedildi.

Tablo, sığır süngerimsi ensefalopatisinde, klasik ve atipik scrapie'de gözlenen immün işaretli anormal prion protein tiplerinin ve pozitif tanı için servidlerin kronik israf hastalığının tanımını ve negatif, sonuçsuz ve uygun olmayan sonuçlar için belirlenmiş kriterleri özetlemektedir. Tüm adımlar çok önemlidir. Çözeltilerin pH'ı ve oda sıcaklığı bu tekniğin başarısı için önemli özelliklerdir.

Hem PrP scrapie'yi hem de hücre tipini saptamak için immünohistokimyanın geliştirilmesi, asal patogenezde rol oynayan her hücre hakkında bilgi verebilir.