Name: Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile Rickettsia spp.yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin, Rickettsia parkeri'yi elektroporasyon yöntemiyle dönüştürerek floresan protein ifadesini sağlayan bu protokolü. Kene hücre hatlarında gen fonksiyon çalışmaları için güvenilir bir teknik sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Timothy J. Kurtti ve Benjamin Cull'a anlayışlı tartışmaları ve önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH'den U.G.M.'ye (2R01AI049424) ve Minnesota Tarımsal Deney İstasyonu'ndan (MIN-17-078) U.G.M.'ye verilen bir hibe ile finansal olarak desteklenmiştir.

1. R. parkeri'nin kene hücre kültüründen yayılması ve saflaştırılması
NOT: Tüm hücre kültürü prosedürleri sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Hazırlanıyor R. parkeri-enfekte kene hücreleri<ol><li>25cm2 hücre kültürü şişelerinde ISE6 hücrelerini, 5 mL'lik L15C300 orta17'de 34 ° C'de büyütün,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 5 triptoz fosfat suyu (TPB) ve% 0.1 lipoprotein konsantresi (LPC) ile desteklenir. NOT: ISE6 (Ixodes scapularis embriyo kaynaklı hücre hattı), birçok laboratuvarda yaygın olarak kullanılan bir kene hücre hattıdır ve bu nedenle kene-patojen etkileşimlerini incelemek için gerekli bir modeldir17,18,19. ISE6 hücrelerinin büyüme hızı, memeli hücrelerininkinden daha yavaştır ve popülasyon ≥72 saatlik süreyi ikiye katlar. Örneğin, %100 akıcı kültürden 1:5 oranında alt yetiştirilen ISE6 hücrelerinin %100 akıcılığı yeniden kazanması 3-4 hafta sürecektir. Sağlıklı ISE6 hücreleri genellikle çok sayıda yapışkan filament ile yuvarlanır17.</li>
		<li>ISE6 hücrelerini ışık mikroskobu altında bir hemositometre ile sayın. ~ 106 hücre / mL konsantrasyonunda kullanın (% 100 birleşik).<ol><li>Şişedeki hücreleri ortamla nazikçe durulayın ve homojen bir hücre süspansiyonu oluşturmak için pipetleme yaparak hücreleri dağıtın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak için hemositometre arasına 20 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve camı örtün.</li>
		</ol></li>
		<li>25 cm2 hücre kültürü şişelerinde ISE6 hücre kültürlerine konakçı hücresiz vahşi tip R. parkeri 20 (ortalama sayı: 5 × 107-10 × 107) ekleyin. Enfekte R. parkeri hücre kültürlerini, L15C300 ortam, %10 FBS, %5 TPB, %0,1 LPC, %0,25 sodyum bikarbonat (NaHCO 3) ve 25 mM HEPES'ten oluşan 5 mL'lik tam ortamda, hücrelerin %90-%100'ü enfekte olana kadar34 °C'de inkübe edin. NOT: R. parkeri'nin ISE6 hücrelerindeki enfeksiyon oranı Giemsa boyama ile belirlenir ve inkübasyon süresinin %90-%100 enfeksiyona ulaşması ortalama 5 gün ile 7 gün arasında değişmektedir.</li>
		<li>Giemsa boyama ile enfeksiyon oranını belirleyin.<ol><li>Biyogüvenlik kabininde, enfekte olmuş hücre kültürlerini yeniden askıya alın ve süspansiyonun 50 μL'sini 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.</li>
			<li>Süspansiyonu tam bir ortamla (1:5 seyreltme) seyreltin ve 5 dakika boyunca 113 × g'lık bir santrifüj kullanarak cam mikroskop slaytlarına 100 μL santrifüj yapın. R. parkeri'yi canlı tutmak için, santrifüjden çıkarılmak üzere tasarlanmış sızdırmaz rotorlu bir santrifüj kullanın. Bu, sızdırmaz rotorun kaputun içine ve dışına taşınmasını sağlar. NOT: R. parkeri santrifüjlemeden önce hala hayatta olduğundan, rickettsia öldürülene kadar numunenin tutulması gerekir. Bu nedenle, R. parkeri kültürünü kızak üzerine döndürmek için kullanılan santrifüj, santrifüjden çıkarılmak üzere tasarlanmış sızdırmaz bir rotora sahip olmalıdır. Rotor laminer akış başlığındayken, numuneleri huni-mikroskop slayt tertibatına yükleyin, rotoru yeniden kapatın ve sızdırmaz rotoru tekrar santrifüje yerleştirin. Ardından, santrifüjü açın ve örnekler mikroskop slaytlarına bırakılır. Çalışma bittikten sonra, sızdırmaz rotoru santrifüjden çıkarın ve laminer akış başlığına yerleştirin. Orada, rotor kapağını açın ve huni-mikroskop sürgü tertibatını kaputun içine boşaltın. Kuruduktan sonra, cam mikroskop slaytlarını tüm patojenleri öldüren mutlak metanole batırın. Huniler ve metal taşıyıcılar, R. parkeri'yi öldüren seyreltilmiş DMQ'ya batırılır.</li>
			<li>Slaytları hava ile kurutun ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca mutlak metanol içinde sabitleyin.</li>
			<li>Slaytları Giemsa boyası (Sørenson tamponunda% 4, pH 6.6) ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca sabitleyin ve 5 saniye boyunca suyla durulayın.</li>
			<li>Işık mikroskobu ile enfeksiyon yüzdesini (rickettsia / 100 hücre ile enfekte olmuş hücre sayısı) belirleyin. NOT: Şekil 1'de tipik Giemsa lekesi sonuçları gösterilmektedir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Hücresiz R. parkeri hazırlama NOT: Kültürdeki hücrelerin %90-%100'ü enfekte olduğunda, riketsiya ISE6 hücrelerinden izole edilmeli ve elektroporasyon yapılmalıdır.<ol><li>Yaklaşık 0,2 mL'lik bir hacme steril 2 mL mikrosantrifüj tüplerine steril 60-90 silikon karbür kum ekleyin.</li>
		<li>% 100 R. parkeri ile enfekte kültürlerden 2 mL orta çıkarın (adım 1.1.3) ve kalan 3 mL ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın.</li>
		<li>Bu süspansiyonun eşit kısımlarını adım 1.2.1'de hazırlanan tüplere aktarın.</li>
		<li>Her tüpü 30 s boyunca yüksek hızda vorteks yapın ve ardından tüpleri buzun üzerine yerleştirin. Kumların yerçekimi ile saniyeler içinde yerleşmesine izin verin.</li>
		<li>Sınıf II biyogüvenlik kabininde, steril bir 5 mL Luer-lock şırıngasını piston uzatılmışken ve pistonun ucu 15 mL konik tüpler için polistiren bir tabana sabitlenmiş olarak hazır bulundurun.</li>
		<li>Uygun bir pipetleyiciye takılı steril, 1 mL bariyer pipet ucu kullanarak, vorteksli hücre lizatının süpernatantını tüpten çıkarın ve herhangi bir kuma emmemeye dikkat edin. Pipet ucunu şırınga göbeği açıklığına yerleştirin ve içeriği hafif bir basınçla şırıngaya çıkarın. Alternatif olarak, kauçuk ampulle çalıştırılan steril, bariyerli 2 mL Pasteur pipet kullanın.</li>
		<li>Şırınga göbeğinin üzerine sterilize edilmiş 2 μm gözenek boyutunda bir filtre takın ve R. parkeri kültürünü adım 1.2.6'dan steril 1,5 mL tüplere filtreleyin.</li>
		<li>R. parkeri'yi 5 dakika boyunca 4 ° C'de 13.600 × g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Peleti 1,2 mL buz gibi soğuk 300 mM sakkarozda tekrar askıya alın ve 5 dakika boyunca 4 ° C'de 13.600 × g'de tekrar santrifüj yapın. Toplam iki sakkaroz yıkaması için yeniden süspansiyonu ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.</li>
		<li>R. parkeri peletlerini, dönüşüm başına 50 μL buz gibi soğuk 300 mM sakkarozda soğutulmuş, steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. R. parkeri'nin 25 cm2'lik bir şişesi iki ila üç dönüşüm için yeterli rickettsiae sağladığından, 100-150 μL 300 mM soğuk sakkaroz ekleyin. NOT: İstenirse, rickettsiae sayısı bir Petroff-Hausser sayım odası kullanılarak hesaplanabilir. 5 × 107 -10 × 107 hücresiz R. parkeri'nin ilk aşılamasını kullanırken,% 90-100 enfeksiyona ulaşmak ortalama 5-7 gün sürecek ve yaklaşık 5 × 107-10 × 10hücresiz R. parkeri verecektir.</li>
		<li>Pelet, iyice dağılana kadar pipetle indirerek yavaşça askıya alın. Numuneyi soğutulmuş, steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde 50 μL porsiyonlara bölün. NOT: İstenirse, riketsiyal canlılık, floresan boya 21 ile boyama işleminden sonra akış sitometrisi ile değerlendirilebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. R. parkeri'nin pRAM18dSFA plazmidi ile dönüşümü
<ol><li>Buz üzerinde, 50 μL R. parkeri süspansiyonu içeren her tüpe 3 μg endotoksin içermeyen pRAM18dSFA plazmid DNA 13,15,20 ekleyin ve karışımı pipet ucu ile nazikçe ama iyice karıştırın. NOT: Plazmid DNA'sını hazırlarken, endotoksin içermeyen plazmid DNA23'ü elde etmek için endotoksin çıkarma adımı içeren bir saflaştırma kiti kullanın. 50 μL R. parkeri süspansiyonu başına 1 μg ile 3 μg arasında bir plazmid konsantrasyonu aralığının başarılı dönüşümlerle sonuçlandığını, plazmid miktarının ise 10 μg'ye çıkarılmasının transformasyonu engellediğini bulduk.</li>
	<li>Yukarıdaki DNA ve R. parkeri karışımını soğutulmuş, steril 0,1 cm boşluklu bir elektroporasyon küvetine aktarın (karışım eşit dağılana kadar küvete hafifçe dokunun) ve 10-30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin.</li>
	<li>Ortamı, ISE6 hücrelerinin %100 kaynaşma kültüründen çıkarın ve hücre katmanlarını NaHCO 3 ve HEPES tamponu ile 1,5 mL taze ortamda yeniden askıya alın (yukarıda adım 1.1.3'te açıklanmıştır). Transformasyon başına bir şişe birleştirilmiş hücre kullanın.</li>
	<li>Yeniden askıya alınan hücreleri steril bir 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (ISE6 hücrelerinin25 cm2 şişesi başına bir tüp).</li>
	<li>R. parkeri/pRAM18dSFA karışımını bir elektroporatör kullanarak 1,8 KV, 200 ohm, 25 μF'de elektroporat yapın.</li>
	<li>Steril, uzatılmış ince uçlu bir transfer pipeti kullanarak, az miktarda ISE6 hücre süspansiyonunu (adım 2.4) küvete aktarın ve küveti yıkamak için sıvıyı yavaşça yukarı ve aşağı çekin. Karışımı, ISE6 hücre süspansiyonunun geri kalanını içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve transformasyon karışımını hücrelerle yavaşça karıştırın.</li>
	<li>Dönüştürülmüş numuneleri RT'de 2 dakika boyunca 700 × g'da santrifüj yapın ve ardından RT'de 1 dakika daha santrifüj hızını 13.600 × g'a yükseltin. NOT: İki santrifüjleme hızı, hücrelerle riketsiyal bağlanmayı ve hücrelere girişi teşvik eder: ISE6 hücrelerini aşağı çekmek için 700 × g kullanılırken, riketsiyaları aşağı çekmek için 13.600 × g kullanılır. </li>
	<li>Numuneleri RT veya 34 °C'de 15 dakika ila 1 saat bekletin.</li>
	<li>ISE6 hücrelerindeki transformantları (iki veya üç) bir pipetleyiciye takılı steril 2 mL bariyer pipet ucu ile yeniden askıya alın veNaHCO 3 ve HEPES tamponu ile 3,5 mL taze ortam içeren iki veya üçadet 25 cm2 hücre kültürü şişesine aktarın. Alternatif olarak, kauçuk ampulle çalıştırılan steril, bariyerli 2 mL Pasteur pipet kullanın.</li>
	<li>Karışımı eşit şekilde yaymak için şişeleri sallayın ve ardından 34 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>16-24 saat sonra, adım 2.10'da her şişeye 10 μL spektinomisin (50 mg / mL) ve 10 μL streptomisin (50 mg / mL) ekleyin.</li>
</ol>3. Dönüştürülmüş R. parkeri'nin gözlemlenmesi
NOT: 3-7 gün sonra adım 2.11'de hazırlanan şişeleri gözlemlemek için rodamin/TRITC filtreli bir epifloresan mikroskop kullanın. Plaklar kültürlerde (5-14 gün) belirginleştiğinde, pRAM18dSFA plazmidinde kodlanmış kırmızı floresan protein mKATE'yi ifade eden dönüştürülmüş R. parkeri görülebilir.
<ol><li>Konfokal mikroskopi<ol><li>Hücre kültürlerini adım 2.11 şişelerinden yeniden askıya alın ve bu hücre kültürlerinin 100 μL'sini karanlıkta RT'de 10-30 dakika boyunca 5 μL Hoechst 33342 çözeltisi ile karıştırın. NOT: Hoechst 33342, canlı kene hücresi DNA'sına bağlanan ve mavi floresan yayan hücre geçirgen bir nükleer karşı boyadır.</li>
		<li>Karışımın 50 μL'sini cam mikroskop üzerine santrifüjleyin, 3 dakika boyunca 5 × g'da bir santrifüj kullanarak kaydırırlar.</li>
		<li>Slaytta biriken hücrelerin noktasına 3 μL 1x PBS ekleyin, bir kapak kayması ile örtün ve bir konfokal mikroskopla görüntüleyin (60x hedef). Floresan görüntüleme için aşağıdaki uyarma ve emisyon parametrelerini kullanın: 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) için, 350 nm'de uyarma, 470 nm'de emisyon; tetrametilrodamin (TRITC) için, 557 nm'de uyarım, 576 nm'de emisyon.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+rickettsial+evolution%3A+Insight+from+Rickettsia+felis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266(2007).</li>
<li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures%3A+How+tree-like+is+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Biology%22%5BJournal%5D)">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li>
<li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-borne+rickettsioses+around+the+world%3A+Emerging+diseases+challenging+old+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li>
<li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li>
<li>Von Wintersdorff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 173(2016).</li>
<li>Winkler, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+species+%28as+organisms%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia species (as organisms).</a> Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).</li>
<li>Wood, D. O., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+rickettsiae%3A+A+preview%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of rickettsiae: A preview.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).</li>
<li>Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+diversity+of+Rickettsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The emerging diversity of Rickettsia.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).</li>
<li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+obligate+intracellular+bacteria%3A+Progress%2C+challenges+and+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).</li>
<li>Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Rickettsia+prowazekii+to+rifampin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance.</a> Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).</li>
<li>Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+Rickettsia+typhi+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).</li>
<li>Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+conorii+O+antigen+is+the+target+of+bactericidal+Weil-Felix+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).</li>
<li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+shuttle+vectors+for+transformation+of+diverse+Rickettsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species.</a> PLoS One. 6 (12), 29511(2011).</li>
<li>Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+epitope-tagged+virulence+protein+in+Rickettsia+parkeri+using+transposon+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion.</a> PloS One. 7 (5), 37310(2012).</li>
<li>Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+characteristics+are+altered+for+Rickettsia+bellii+transformed+to+overexpress+a+heterologous+rickA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).</li>
<li>Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+expressing+Rickettsia+buchneri+and+Rickettsia+peacockii+for+tracking+symbiont-tick+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 34(2016).</li>
<li>Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li>
<li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+%28black-legged+tick%29+ISE6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li>
<li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152(2020).</li>
<li>Wang, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrion-dependent+apoptosis+is+essential+for+Rickettsia+parkeri+infection+and+replication+in+vector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells.</a> mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).</li>
<li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE%2FDEAD+BacLight+Kit+in+combination+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).</li>
<li>Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li>
<li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li>
<li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+buchneri+sp.+nov.%2C+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965(2015).</li>
<li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li>
<li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li>
<li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+%28Acari%3A+Argasidae%3A+Ornithodorinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li>
<li>Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan edilmez.

Burada, mekik plazmidi pRAM18dSFA üzerinde kodlanmış eksojen DNA'yı elektroporasyon kullanarak rickettsiiae'ye sokmak için bir yöntem gösteriyoruz. Bu prosedürde, hücresiz rickettsiae, konakçı hücrelerden arındırıldı, riketsiyal mekik vektörü ile dönüştürüldü ve enfeksiyon için kene hücrelerine salındı. Ayrıca kene hücrelerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden R. parkeri'yi tespit etmek için konfokal bir immünofloresan prosedürü de tanımlanmıştır. Benzer yöntemler diğer Rickettsia türleri için de...

Rickettsiozlar, Rickettsia cinsine (Rickettsiaceae familyası, Rickettsiales sırası) ait çok çeşitli zorunlu hücre içi bakterilerden kaynaklanır. Rickettsia cinsi, filogenetik özelliklere göre dört ana gruba ayrılır1,2: en şiddetli ve ölümcül kene kaynaklı rickettsiozlara neden olan rickettsiiae'leri içeren benekli ateş grubu (SFG) (örneğin, Rocky Mountain Benekli Ateşinin etken maddesi olan Rickettsia rickettsii), tifüs grubu (TG, örneğin, Rickettsia prowazekii, epidemik tifüsün ajanı), geçiş grubu (TRG, örneğin, pire kaynaklı benekli ateşin etken maddesi olan Rickettsia felis) ve atasal grup (AG, örneğin, Rickettsia bellii).
Bilinen en eski vektör kaynaklı hastalıklar arasında, riketsiyozlar esas olarak patojenlerin keneler, pireler, bitler ve akarlar dahil olmak üzere enfekte eklembacaklı vektörlerinin ısırıkları yoluyla bulaşmasını takiben edinilir 3,4. Etkili antibiyotiklerin keşfi tedavi sonuçlarını iyileştirse de, ortaya çıkan ve yeniden ortaya çıkan epidemik riketsiyozlar geleneksel önleme ve kontrol stratejilerine meydan okumaya devam etmektedir. Bu nedenle, riketsia / konakçı / vektör etkileşimlerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sonuçta bu eski hastalıkları önlemek ve iyileştirmek için yeni yaklaşımlar geliştirmek için güçlü bir temel oluşturacaktır.
Doğada, bakterilerde yatay gen transferi (HGT) konjugasyon, transdüksiyon ve transformasyon yoluyla gerçekleşir5. İn vitro bakteriyel transformasyon bu HGT kavramlarını kullanır, ancak rickettsiiae'nin hücre içi doğası bazı zorluklar sunar. Rickettsiae'nin farklı türlerinde kısıtlı büyüme koşulları ve iyi anlaşılmamış konjugasyon ve transdüksiyon sistemleri, rickettsiae 6,7,8'de konjugasyon ve transdüksiyon yöntemlerinin uygulanmasını engellemiştir. Diğer zorunlu hücre içi bakteri cinsleriyle (örneğin, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma ve Ehrlichia) karşılaştırıldığında, Rickettsia cinsi, benzersiz yaşam tarzı özellikleri nedeniyle rickettsiiae'nin genetik modifikasyonuna özel zorluklar getiren hücre sitoplazmasındaki büyüme ve replikasyon stratejileri açısından farklılık gösterir9.
Rickettsiae'nin genetik modifikasyonunu denerken üstesinden gelinmesi gereken ilk engel, başarılı bir dönüşüm elde etmektir. Bu nedenle, yüksek dönüşüm verimliliğine sahip uygulanabilir bir yaklaşım tasarlamak, rickettsia için genetik araçlar geliştirmek için son derece değerli olacaktır. Burada, Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii ve Rickettsia buchneri10,11,12 dahil olmak üzere çeşitli rickettsia türlerine eksojen DNA'yı başarılı bir şekilde tanıtmak için kullanılan, yaygın olarak tanınan bir transformasyon yöntemi olan elektroporasyona odaklanıyoruz. ,13,14,15,16.
Bu yazıda, R. parkeri suşu Tate's Hell'in (katılım: GCA_000965145.1) mekik vektörü pRAM18dSFA ile elektroporasyonu için bir prosedür açıklanmaktadır Rickettsia amblyommatis suşu AaR/SC plazmid pRAM18'den türetilen mekik vektörü pRAM18dSFA ile spektinomisin ve streptomisin direnci13,15,20 sağlayan aadA, çok kırmızı bir floresan proteini olan mKATE'yi kodlamak üzere tasarlanmıştır. Transforme R. parkeri, kene hücre hatlarında antibiyotik seçimi altında uygulanabilir ve istikrarlı bir şekilde korunur. Ek olarak, konfokal mikroskopi yoluyla canlı kene hücrelerinde transforme R. parkeri'nin lokalizasyonunun, vektör hücre hatlarındaki dönüşüm oranlarının kalitesini değerlendirmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>0,1 cm boşluklu gen pulser elektroporasyon küveti</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>2 & mu; m gözenek boyutu filtresi&nbsp;</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri Whatman</td><td>6783-2520</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-lock şırınga&nbsp;</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>60-90 silisyum karbür kumu&nbsp;</td><td>LORTONE, inc</td><td>&nbsp; 591-056</td><td></td></tr><tr><td>MUTLAK METANOL&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A457-4</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptoz fosfat suyu&nbsp;</td><td>BD</td><td>260300</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin santrifüj Cytospin4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Rotor çıkarılabilir, böylece bulaşıcı numuneleri yüklemek için tüm rotor davlumbaza yerleştirilebilir</td></tr><tr><td>Endotoksin içermeyen pRAM18dSFA plazmid</td><td></td> genişletilmiş ince uçlu transfer pipeti elde etmek için kullanılan <td>QIAGEN</td><td>12362</td></tr><tr><td>;</td><td>Perfector Scientific</td><td>TP03-5301</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td>FBS partisi, ISE6 hücrelerinin içinde iyi büyüyeceğinden emin olmak için test edilmelidir.</td></tr><tr><td>Nabız Kontrol Cihazlı Gene Pulser II elektroporatör PLUS</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105 & 165-2110</td><td></td></tr><tr><td>hemositometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td>Ulusal Sağlık</td><td></td> Enstitüsü <td>ham görüntü düzenleme</td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa boya&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 2021-10-30</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 orta boy</td><td>Gibco</td><td>41300039</td><td></td></tr><tr><td>lipoprotein konsantresi&nbsp;</td><td>MP Biyomedikal</td><td>191476</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Diaphot</td><td>Nikon</td><td></td><td>epifloresan mikroskobu</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagent&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Disk Tarama Ünitesi (DSU) konfokal mikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser Sayım Odası</td><td>Hausser Scientific</td><td>&nbsp; Oda 3900</td><td></td></tr><tr><td>sodyum bikarbonat</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

kene hücre hatlarında floresan protein İfade eden mekik vektörü ile rickettsia spp.'yi dönüştürmek için bir elektroporasyon yöntemi

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Rickettsioses, enfekte eklembacaklı vektörlerin ısırığı yoluyla omurgalı konakçılara bulaşabilen Rickettsia cinsine ait çok çeşitli zorunlu hücre içi bakterilerden kaynaklanır. Bugüne kadar, ortaya çıkan veya yeniden ortaya çıkan epidemik riketsiozlar, tanı yöntemleri sınırlı olduğu ve standartlaştırılmadığı veya evrensel olarak erişilebilir olmadığı için tanıdaki zorluk nedeniyle halk sağlığı riski olmaya devam etmektedir. Belirti ve semptomların tanınmamasından kaynaklanan yanlış tanı, gecikmiş antibiyotik tedavisine ve kötü sağlık sonuçlarına neden olabilir. Rickettsia özelliklerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sonuçta hastalığın daha iyi kontrol ve önlenmesi ile klinik tanı, değerlendirme ve tedaviyi geliştirecektir. 
Riketsiyal genlerin fonksiyonel çalışmaları, patogenezdeki rollerini anlamak için çok önemlidir. Bu yazıda, Rickettsia parkeri suşu Tate's Hell'in mekik vektörü pRAM18dSFA ile elektroporasyonu ve kene hücre kültüründe dönüştürülmüş R. parkeri'nin antibiyotiklerle (spektinomisin ve streptomisin) seçimi için bir prosedür açıklanmaktadır. Vektör hücre hatlarındaki transformasyonu kontrol etmek için yararlı bir teknik olan konfokal immünofloresan mikroskopi kullanılarak kene hücrelerinde transforme R. parkeri'nin lokalizasyonu için bir yöntem de tanımlanmıştır. Benzer yaklaşımlar diğer rickettsiae'lerin dönüşümü için de uygundur.

Giemsa boyamasından sonra ışık mikroskobu altında ISE6 hücrelerinde R. parkeri'nin morfolojisi Şekil 1'de gösterilmiştir. Şekil 2'de, ISE6 hücrelerinde kırmızı floresan proteini eksprese eden dönüştürülmüş R. parkeri , konfokal mikroskopi kullanılarak gösterilmiştir. ISE6 hücrelerinde (mavi, çekirdeğe karşılık gelir) transforme R. parkeri'nin (kırmızı) enfeksiyon oranında, inkübasyonun (A) 7. gününden (B</stron...

Elektroporasyon, eksojen DNA'yı Rickettsia cinsine sokmak için hızlı, geniş çapta benimsenmiş bir yöntemdir. Bu protokol, Rickettsia cinsindeki zorunlu hücre içi bakterilerin dönüşümü için yararlı bir elektroporasyon yöntemi sağlar.

Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile Rickettsia spp.'yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Rickettsia genlerinin fonksiyonel çalışmaları, patogenezdeki rollerini anlamak için çok önemlidir, bu nedenle genleri kontrollü bir şekilde değiştirmek için güvenilir yöntemlere ihtiyacımız vardır. Protokolümüz, eksojen DNA'yı Rickettsia cinsinin zorunlu hücre içi bakterilerine sokmak için elektroporasyon kullanır, böylece tanıtılan DNA'nın etkilerini incelememize izin verir. Bugün benimle birlikte prosedürü gösterecek olan Lisa Price, Dr. Munderloh ve Dr. Kurtti'nin laboratuvarından bir araştırmacı olacak.Başlamak için, metinde açıklandığı gibi% 90 ila% 100 Rickettsia parkeri ile enfekte olmuş ISE6 hücre kültürü hazırlayın. Daha sonra, Giemsa boyama ile enfeksiyon oranını belirlemek için, hücre süspansiyonunu tam ortam ile 1: 5 oranında seyreltin ve hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini beş dakika boyunca 113 G'de santrifüjleme yoluyla bir cam mikroskop sürgüsüne yatırın. Slaytın havayı kurumasına izin verdikten sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca mutlak bir metanol sabitleyin.Ardından, slaytı ve Giemsa lekesini 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, kaydırağı suda durulayın ve kuruduktan sonra, yağ hedefleri olan hafif bir mikroskop altında görüntüleyin. Enfekte olmuş ve enfekte olmayan hücreleri sayarak enfekte olmuş hücrelerin yüzdesini belirleyin.Hücresiz Rickettsia parkeri'yi hazırlamak için, iki mililitrelik steril mikrosantrifüj tüplerine yaklaşık 0,2 mililitre steril 60 ila 90 silikon karbür kum dökün ve tüpleri bir kenara koyun. Beş mililitre ortam içeren daha önce aşılanmış bir Rickettsia parkeri ile enfekte olmuş şişeden, hücre tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamın iki mililitresini çıkarın. Ardından, hücreleri ortamın kalan üç mililitresi ile yeniden askıya alın.Bu süspansiyonu hazırlanan iki silikon karbür kum tüpü arasında eşit olarak bölün ve tüpü 30 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin. Ardından, onları buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, pistonu uzatarak steril bir beş mililitrelik luer kilit şırıngası hazırlayın ve piston ucunu 15 mililitrelik konik tüpleri tutmak için kullanılan bir polistiren tabana yerleştirin.Kauçuk bir ampulle çalıştırılan iki mililitrelik bir bariyer Pasteur pipeti kullanarak, vorteks hücrelerinin süpernatantını herhangi bir kum emmeden dikkatlice çıkarın. Ardından, pipet ucunu şırınga göbeği açıklığına yerleştirin ve içeriği hafif bir basınçla şırıngaya çıkarın. Daha sonra, Rickettsia parkeri kültürünü, şırınga göbeğine takılı steril iki mikrometrelik gözenek boyutundaki bir filtreden steril 1,5 mililitrelik tüplere filtreleyin ve tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 13.600 G'de santrifüj edin.Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini iki kez 1.2 mililitre 300 milimolar buz gibi soğuk sakkaroz çözeltisi ile yıkayın. Numuneyi santrifüj edin ve yıkamalar arasında süpernatantı çıkarın. Santrifüjlemenin sonunda, havuzlanmış hücre peletini sırasıyla iki ila üç transformasyon numunesi için 100 ila 150 mikrolitre buz gibi soğuk sakkaroz çözeltisi ile yeniden askıya alın.Daha sonra, numuneyi önceden soğutulmuş, steril, 1.5 mikrolitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 50 mikrolitrelik alikotlara bölün. Üç mikrogram endotoksin içermeyen pRAM18sSFA plazmid DNA'sında, buz üzerinde 50 mikrolitre Rickettsia parkeri içeren her tüpe transformasyon için ve bir pipet ucu ile hafifçe karıştırın. Karışımı 0,1 santimetre boşluk boyutuna sahip önceden soğutulmuş steril bir elektroporasyon küvetine aktarın.Karışımı eşit şekilde dağıtmak için küvete hafifçe dokunun ve 10 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Bu arada, ortamı daha önce kültürlenmiş tam olarak akışkanlaştırılmış bir ISE6 hücre kültürü şişesinden çıkarın ve hücreleri sodyum bikarbonat ve HEPES tamponu içeren 1.5 mililitre taze ortam ile nazikçe durulayarak hücre tabakasını yeniden askıya alın. Homojen bir hücre süspansiyonu oluşturduktan sonra, tüm hacmi tek bir steril iki mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Daha sonra, bir elektroporatör kullanarak Rickettsia parkeri ve plazmid DNA karışımını elektroporatlayın. Elektroporasyondan sonra, az miktarda ISE6 hücre süspansiyonunu küvete aktarmak için steril genişletilmiş ince uçlu bir pipet kullanın ve elektroporated Rickettsia parkeri'yi geri kazanmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet kullanın. Ardından, küvetin içeriğini ISE6 hücre süspansiyonunun geri kalanını içeren iki mililitrelik tüpe aktarın.Daha sonra, numuneyi oda sıcaklığında, önce ISE6 hücrelerini aşağı çekmek için iki dakika boyunca 700 G'de, ardından Rickettsia'yı aşağı çekmek için bir dakika boyunca 13.600 G'de santrifüj yapın. Tüpü 15 dakika ila bir saat boyunca 34 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bir dönüşümün yeniden askıya alınmış içeriğini, sodyum bikarbonat ve HEPES tamponu ile 3,5 mililitre taze ortam içeren 25 santimetrekarelik bir hücre kültürü şişesine aktarın.Karışımı eşit şekilde yaymak ve 34 santigrat derecede kuluçkaya yatırmak için şişeyi sallayın. 16 ila 24 saat sonra, inkübe edilmiş şişeye spektinomisin ve streptomisin her biri 10 mikrolitre ekleyin. Şişeyi inkübatöre geri döndürmeden önce antibiyotikleri ortama eşit şekilde karıştırmak için şişeyi sallayın.Vahşi tip Rickettsia parkeri ve ISE6 hücrelerinin başarılı bir şekilde yayılması, Giemsa boyaması ile belirgindi. ISE6 hücrelerinin çekirdekleri, hücre içi Giemsa ve hücre dışı Rickettsi ile koyu mor renkte boyanmıştır. ISE6 hücrelerinde kırmızı floresan proteinini eksprese eden Rickettsia parkeri'nin transformasyonu, yedi günlük inkübasyondan sonra konfokal mikroskopi ile doğrulandı.10 gün sonra enfeksiyon oranında önemli bir artış gözlendi. Tüm prosedür boyunca her şeyi steril tutun. Detaylara dikkat edin ve sabırlı olun, çünkü bazı Rickettsia türlerinin dönüşmesi, özellikle de yavaş büyüyen endosimbiyontların dönüşmesi uzun zaman alır.Bu protokol, Rickettsia biyolojisinin birçok yönünün ve eklembacaklı vektörleri ve memeli konakçıları ile etkileşimlerinin incelenmesini sağlamıştır. Örneğin, floresan proteini eksprese eden Rickettsi, hareketliliği ve simbiyont kene hücresi etkileşimlerini izlemek için kullanılmıştır.

an-electroporation-method-to-transform-rickettsia-spp-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lyme hastalığı araştırma çalışmaları, genellikle bir süreç genellikle birkaç hafta sürer patojen Borrelia burgdorferi ile enfekte kenelerin nesil gerektirir. Burada saat içinde yapılabilir mikroenjeksiyon tabanlı bir kene enfeksiyonu prosedürü göstermektedir. Ayrıca keneler içinde B. burgdorferi in situ lokalizasyonu için immünofloresan yöntemi göstermektedir.

Hızlı Aktarım ve Lyme Hastalığı Patojenler lokalizasyonu için işaretleyin Gut içinde Yöntemleri

Kaynak: Aigrain, L. ve diğerleri. Elektroporasyon yoluyla canlı mikroorganizmalarda floresan biyomoleküllerin içselleştirilmesi ve gözlemlenmesi.  J. Vis. Exp. (2015)Video, elektroporasyon kullanılarak floresan biyomoleküllerin elektro yetkili mikrobiyal hücrelere nasıl teslim edildiğini gösteriyor. Süreç, florofor etiketli DNA veya proteinlerin soğutulmuş hücre süspansiyonuna eklenmesiyle başlar. Daha sonra yüksek voltajlı bir darbe uygulanarak geçici membran gözenekleri oluşturulur ve...

Floresan Biyomoleküllerin Bakteriyel Hücrelere Elektroporasyon Tabanlı Teslimatı

Bu video, floresan protein kodlayan plazmit DNA'sını fare birincil serebellar granül hücre öncülerine sokan elektroporasyon tekniğini göstermektedir.

Elektroporasyon Aracılı İn Vitro Gen İletimi: Floresan Raportör Protein Kodlayan Plazmitleri Kültürlenmiş Hücrelere Sokmak İçin Bir Elektrik Darbe Tekniği

Bu videoda, floresan raportör proteini kodlayan plazmit DNA'sını tavuk Eimeria parazitinin sporozoit formuna iletmek için elektroporasyon tabanlı bir transfeksiyon prosedürü olan nükleofeksiyonu açıklıyoruz.

Parazit Formlarının Nükleofeksiyonu: Floresan Protein Kodlayan Plazmitleri Sporozoit Çekirdeğine Vermek için Elektroporasyon Tabanlı Bir Transfeksiyon Yöntemi

Bu videoda, bakteriyel efektör proteinlerin elektroporasyon yoluyla memeli hücrelerine girişini gösteriyoruz. Bakteriyel efektör proteinlerin hücre içi lokalizasyonu, spesifik florofor konjuge antikorlarla boyamayı takiben konfokal mikroskopi ile tespit edilir.

Bakteriyel Efektör Proteinlerin Elektroporasyon ile Memeli Hücrelerine Sokulması

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Elektroporasyon, saflaştırılmış bakteriyel virülans efektör proteinlerini doğrudan canlı ökaryotik hücrelere yerleştirmek için kullanıldı. Protein lokalizasyonu konfokal immünofloresan mikroskopi ile izlendi. Bu yöntem, ökaryotik hücrelerde heterolog ekspresyon ihtiyacını ortadan kaldırarak, aktif eksojen proteinleri kullanarak kaçakçılık, fonksiyon ve protein-protein etkileşimleri üzerine çalışmalara izin verir.

Memeli Hücreleri içinde fonksiyonel Bakteriyel Efektör elektroporasyonu

Tip III sekresyon sistemi yoluyla konak hücrelere efektör translokasyonu, gram negatif bakteriler arasında yaygın bir virülans stratejisidir. Translokasyonun kantitatif analizi için beta-laktamaz efektör füzyon bazlı bir test uygulandı. Yersinia ile enfekte olmuş hücrelerde, bir FRET raportörünün beta-laktamaz tarafından dönüşümü lazer tarama mikroskobu kullanılarak izlenir.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Mevcut protokol, kene embriyolarının enjekte edilmesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Embriyo enjeksiyonu, transgenik çizgiler oluşturmak için genetik manipülasyon için tercih edilen tekniktir.

Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Bakteriyofajın DNA'yı bakteri hücreleri arasında hareket ettirme yeteneği, onları bakteriyel konakçılarının genetik manipülasyonu için etkili araçlar haline getirir. Burada, Borrelia burgdorferi'nin bir bakteriyofajı olan φBB-1'i, Lyme hastalığı spiroketinin farklı suşları arasında heterolog DNA'yı dönüştürmek için indüklemek, iyileştirmek ve kullanmak için bir metodoloji sunulmaktadır.

Lyme Hastalığının Faj Aracılı Genetik Manipülasyonu Spiroket Borrelia burgdorferi

Öğrenin, Rickettsia parkeri'yi elektroporasyon yöntemiyle dönüştürerek floresan protein ifadesini sağlayan bu protokolü. Kene hücre hatlarında gen fonksiyon çalışmaları için güvenilir bir teknik sunar.

Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile Rickettsia spp.yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi (Video) | JoVE Journal

Kene Hücre Hatlarında Floresan Protein İfade Eden Mekik Vektörü ile Rickettsia spp.'yi Dönüştürmek için Bir Elektroporasyon Yöntemi

Daha fazla video keşfet