Name: Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Keşfedin: Organoid ve sferoidleri hidrojel içinde kültüre etme, dondurma, çözme, işleme ve görüntüleme protokolü. HEPG2 hücreleri kullanılarak yapılan bu yöntem, 3D yapıların bütünlüğünü koruyarak hastalık modellemesi ve biyobelirteç analizi için güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diyagramların hazırlanması için Chicago Üniversitesi'nden Dale Mertes'e, İstanbul Medipol Üniversitesi Sağlık Bilimleri ve Teknolojileri Araştırma Enstitüsü'ndeki teknik desteği için Dr. Mehmet Serif Aydın'a ve makalenin editörlüğünü yaptığı için Maltepe Üniversitesi'nden Dr. Rana Kazemi'ye minnettarız.

1. Organoidlerin ve sferoidlerin kültürlenmesi
<ol><li>Çözülmesi için hidrojeli gece boyunca (buzdolabında veya soğuk bir odada) buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Ticari olarak temin edilebilen çok amaçlı cihazı (MD; bakınız Malzeme Tablosu) deneyden 1 gün önce (37 °C, %5 CO2) inkübatöre ısıtın.</li>
	<li>Steril geniş uçlu pipet uçlarını buzdolabına 4 °C'de yerleştirin. NOT: Adım 1.1-1.3 0. Günde, 1.4-1.11 adımları ise 1. Gün gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Hidrojeli 15 dakika boyunca laminer bir akış başlığında buzun üzerine yerleştirin.<ol><li>İsteğe bağlı: Hidrojeli üreticinin tavsiyesine göre soğuk hücre kültürü ortamında seyreltin.</li>
	</ol></li>
	<li>HepG2 hücrelerinin bir peletini (ticari olarak elde edilen hepatosellüler karsinom hücre hattı; bakınız Malzeme Tablosu) içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Plaka 30-35 μL% 100 hidrojel bir jel damlası oluşturmak için önceden ısıtılmış cihazın nişi içinde.</li>
	<li>Her hidrojel damlasının üst kısmının ortasına 10.000 HepG2 hücresi yerleştirin (Şekil 2) ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Hidrojel damlasını% 10 Fetal Sığır Serumu ile 200 μL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile örtün.</li>
	<li>Gaz akışına izin vermek için MD'nin kapağını doğru konumda örtün ve cihazı inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri her gün% 10 FBS ile 200 μL DMEM ile besleyin.</li>
	<li>Sferoidlerin büyümesini ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin (Şekil 3). Küresel oluşum 3. günden sonra başlar. Video 1 , bir hidrojel kubbede farklı seviyelerde sferoidlerin yerini göstermektedir. NOTLAR: Hidrojeli çevreleyen sıvının nazikçe aspire edilmesi ve hidrojel damlalarının zarar görmesini önlemek için yeni sıvının yavaşça çevreye eklenmesi şiddetle tavsiye edilir.</li>
</ol>2. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin hematoksilin ve Eozin boyanması
<ol><li>Fiksatifi ısıtın (% 4 paraformaldehit; PFA), PBS ve hematoksilin (bkz. malzeme tablosu) 37 °C'ye kadar.</li>
	<li>Hidrojel damlasını çevreleyen ortamı bir pipetle aspire edin, sabitlemek için 100-200 μL% 4 PFA ekleyin ve 37 ° C'de 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>% 4 PFA'yı aspire edin ve 37 ° C'de her biri 5 dakika boyunca 3x'i yıkamak için 200 μL PBS ekleyin. Daha sonra, PBS'yi aspire edin ve 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca 200 μL Hematoksilin çözeltisi ile inkübe edin.</li>
	<li>Hematoksilin'i aspire edin ve 37 ° C'de her biri 10 dakika boyunca 3x'i yıkamak için200μL dH 2 O ekleyin. dH2O'yu aspire edin ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 200 μL etanol ile inkübe edin.</li>
	<li>Etanol aspire edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca 200 μL Eozin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin. Eozini aspire edin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika yıkamak için200μL dH 2 O ekleyin.</li>
	<li>dH2O'yu aspire edin ve hidrojel damlasını montaj ortamı olarak örtmek için 100 μL gliserol ekleyin.</li>
	<li>İsteğe bağlı: Nişi bir kapak kayması ile monte edin. Bu adım, önemli büyüklükteki organoidlerin / sferoidlerin sıkılmasını önlemek için atlanabilir.</li>
	<li>Muayeneye kadar kurumasını önlemek için MD'nin kapağını sıkıca kapatın. Numune en az 6 ay boyunca muayene için stabildir.</li>
</ol>3. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin immünohistokimyası
<ol><li>İmmünohistokimya için ticari olarak elde edilen çözeltiyi (S-IHC; bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'ye ısıtın.</li>
	<li>Hidrojeldeki organoidleri veya sferoidleri, 37 ° C'de 5 dakika boyunca200μL dH 2 O'da% 3 hidrojen peroksit (H2 O 2) ile inkübe edin.</li>
	<li>Hidrojen peroksit çözeltisini aspire edin ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca dH2O'da yıkayın. dH2O'yu aspire edin ve her biri 10 dakika boyunca 37 ° C'de 100 μL S-IHC ile iki kez inkübe edin.</li>
	<li>S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 1-2 saat boyunca S-IHC'de seyreltilmiş 100 μL birincil antikor (bkz. Malzeme Tablosu) ile inkübe edin (üreticinin çalışma seyreltmesi ile ilgili tavsiyelerini takiben).</li>
	<li>Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin.</li>
	<li>100 μL S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca biyotinile ikincil bir antikor (bakınız Malzeme Tablosu) ile inkübe edin.</li>
	<li>Sekonder antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin. S-IHC'yi aspire edin ve streptavidin etiketli 100 μL yaban turpu peroksidaz (HRP) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>HRP etiketli streptavidini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin.</li>
	<li>S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 100 μL DAB / AEC kromojen çözeltisi karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.</li>
	<li>Boyama yoğunluğunu bir ışık mikroskobu altında izleyin.</li>
	<li>Her biri 2 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.</li>
	<li>İsteğe bağlı: 37 ° C'de 5 dakika boyunca nükleer karşı boyama için 100 μL Hematoksilin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.</li>
	<li>Hematoksilin aspire edin ve dH2O'da 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>dH2O'yu aspire edin ve hidrojel damlasını montaj ortamı olarak 100 μL gliserol ile örtün.</li>
	<li>Mikroskobik incelemeye kadar MD'nin kapağını sıkıca kapatın. NOTLAR: Antijen alımı ve protein bloke etme adımları bu protokolde ihmal edilir, çünkü S-IHC bu adımları ortadan kaldırır.</li>
</ol>4. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin/sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi
<ol><li>Aşağıdaki malzemeleri 37 °C'ye ısıtın:% 4 PFA, PBS, S-IF, S-IF'de birincil antikor çözeltisi, S-IF'de ikincil antikor çözeltisi, nükleer leke ve gliserol (bkz.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını aspire edin ve 37 ° C'de 15-30 dakika boyunca 200 μL% 4 PFA ile sabitleyin. Fiksatifi aspire edin ve her biri 37 ° C'de 10 dakika boyunca S-IF 3x'te yıkayın.</li>
	<li>Aşağıdaki adımlar sırasında nem sağlamak için nişi çevreleyen tarafa dH2O ekleyin.</li>
	<li>Hidrojel damlasını çevreleyen S-IF'yi aspire edin ve hidrojel damlasını 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca S-IF'de 100 μL birincil antikor çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.</li>
	<li>Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve 37 ° C'de her biri 10 dakika boyunca S-IF 3x'te yıkayın.</li>
	<li>S-IF'yi aspire edin ve karanlıkta 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca S-IF'de 100 μL ikincil antikor çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.</li>
	<li>İkincil antikor solüsyonunu aspire edin ve karanlıkta 37 °C'de her biri 10 dakika boyunca PBS 3x ile yıkayın.</li>
	<li>PBS'yi aspire edin ve karanlıkta 37 ° C'de montaj ortamı veya gliserol içeren 100 μL nükleer-DNA lekesi ile inkübe edin.</li>
	<li>Kurumasını önlemek için nişi gliserol ile doldurun.</li>
	<li>İsteğe bağlı: Nişi bir kapak fişi ile örtün. Organoidlerin / sferoidlerin sıkılmasını önlemek için bu adım atlanabilir.</li>
	<li>MD'yi sıkıca kapatın. MD'lerdeki numuneler, en az floresan kaybı ile karanlıkta en az 6 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>Konfokal mikroskobik inceleme için aşağıdaki ayarları kullanın: tüm kanalların iğne deliği değerini 20,1 olarak ayarlayın, kazanç ana sabitini 488 nm için 550, 550 nm için 485 ve 594 nm için 450 olarak tutun, tüm deneyler için lazer gücünü sabit tutun ve en düşük yüzdeyi 2,0'da tutun. NOTLAR: Primer antikorlar: Anti-Na-K ATPaz (1:100), Anti-Arginaz (1:50), Anti-Albümin (1:50), Anti-Beta-galaktosidaz (1:25), Antimitokondriyal antikor (1:100), Anti-Golgi Antikoru (1:50), Anti-Sitokeratin 5 (1:100), Ov6 antikoru (1:100). İkincil antikorlar: Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) - 488, Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) -550, Keçi anti-Fare IgG (H + L) -488, Keçi anti-Fare IgG (H + L) -550, Keçi anti-Tavuk IgY (H + L) -647. Tüm sekonder antikorlar için seyreltme 1:100'dür. Ek olarak, konjuge bir antikor olan FITC-Phalloidin (1:100 ) de kullanılır (bkz.</li>
</ol>5. Bir hidrojel içinde canlı organoidlerin ve sferoidlerin plazma zarı ve çekirdeğin etiketlenmesi
<ol><li>Üreticinin tavsiyelerine göre (bkz. Malzeme Tablosu) Hank'in dengeli tuz çözeltisinde Alexa flor buğday tohumu aglutinin (5.0 μg / mL) ve Hoechst (2 μM) içeren etiketleme çözeltisi hazırlayın ve 37 ° C'ye kadar ısıtın.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını aspire edin ve hidrojel damlasını örtmek için 100 μL etiketleme çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Etiketleme solüsyonunu çıkarın ve PBS 2x'te her biri 37 °C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. İsteğe bağlı: 37 °C'de 15 dakika boyunca 200 μL %4 formaldehit ile sabitleyin.</li>
	<li>Hidrojel damlasını montaj ortamı olarak gliserol ile örtün. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak camı ile monte edin.</li>
	<li>MD'nin kapağını sıkıca kapatın ve floresan / konfokal mikroskobik incelemeye kadar karanlıkta buzdolabında saklayın. En az 6 ay boyunca stabildir.</li>
</ol>6. Tüm monte organoidlerin / sferoidlerin bir hidrojel içinde dondurulması ve çözülmesi
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek organoidleri dondurun.<ol><li>Ticari olarak elde edilen dondurma çözeltisini (FS; bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'ye ısıtın.</li>
		<li>Hidrojel kubbeyi çevreleyen hücre kültürü ortamını nazikçe aspire edin.</li>
		<li>Yavaşça 200 μL FS ekleyin. Numuneyi FS ile 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
		<li>Cihazın kapağını sıkıca kapatın ve bir köpük kutuya yerleştirin. Bu köpük kutusunu, Ek Şekil 3'te gösterildiği gibi başka bir köpük kutuya yerleştirin. Her iki köpük kutuyu da sıkıca kapatın. Birbirinin içindeki iki köpük kutu, -20 °C'lik bir dondurucuda numunenin 1 ila 2°C/dak'lık bir sıcaklık soğutma gradyanı aralığını sağlar.</li>
		<li>Kutuyu 2 saat boyunca -20 °C'ye yerleştirin. Kutuyu -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın ve gece boyunca bırakın.</li>
		<li>Numuneyi kutulardan çıkarın. MD'deki numune -80 °C dondurucuda 6 ay boyunca saklanabilir.</li>
		<li>Numuneyi içeren MD'yi daha uzun süreli depolama için sıvı azot tankına aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek organoidleri çözün.<ol><li>Numuneyi içeren MD'yi dondurucu/azot tankından çıkarın ve doğrudan 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Nişe 200 μL ılık kültür ortamı ekleyin (FS'nin hücre kültürü ortamına oranı 1: 1'dir) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Nişe daha sıcak kültür ortamı ekleyin (FS'nin hücre kültürü ortamına oranı 1: 2'dir) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Ortam ve FS karışımını nazikçe aspire edin. Hidrojeldeki tüm montajlı organoidlerin / sferoidlerin taramalı elektron mikroskobu (adım 7) ve iletim elektron mikroskobu (adım 8) görüntülemesine devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Tüm monte organoidlerin / sferoidlerin taramalı elektron mikroskopisi
<ol><li>Karnovsky'nin fiksatif ve post-fiksatif çözeltisini (bakınız Malzeme Tablosu) oda sıcaklığına (RT) ısıtın.</li>
	<li>MD'deki hidrojeli çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin. Numuneyi MD'de laminer akış başlığındaki buz üzerine 15 dakika boyunca yerleştirin.</li>
	<li>Organoidleri / sferoidleri çevreleyen sıvılaştırılmış hidrojeli çok nazikçe aspire edin. Sınırlı miktarda matrigel, numuneye zarar vermemek ve kaybetmemek için niş içinde kalabilir.</li>
	<li>Karnovsky'nin fiksatif (% 2 PFA,% 2.5 glutaraldehit 0.15 M Kakodilat tamponunda ve 2 mM CaCl2; bakınız Malzeme Tablosu) ile RT'de 1 saat boyunca sabitleyin.</li>
	<li>Fiksatifi nazikçe aspire edin ve her biri 15 dakika boyunca damıtılmış suyla (dH2O) 3x yıkayın.</li>
	<li>dH2O'yu nazikçe aspire edin ve 1 saat boyunca RT'de post-fiksatif çözelti (% 1 sulu osmiyum tetroksit [OsO4]; Malzeme Tablosuna bakınız) ile sabitleyin.</li>
	<li>Post-fiksatifi nazikçe aspire edin ve her biri 15 dakika boyunca damıtılmış su (dH2O) 3x ile yıkayın.</li>
	<li>Derecelendirilmiş bir etanol serisinde dehidrat (% 30,% 50,% 70,% 80,% 90,% 96,% 100), etanol / aseton karışımı (1: 1; 1: 2) ve RT'de her biri 15 dakika boyunca mutlak aseton.</li>
	<li>Kritik noktalı kurutucu ile kurulayın.</li>
	<li>Cihazdaki numuneyi 90 sn boyunca bir püskürtme kaplayıcı kullanarak 6 nm altın / paladyum ile kaplayın (bkz.</li>
	<li>Vakum modunda (5 x 10-6 mA) 2-3 kV'ta lens içi ikincil elektron dedektörü ile taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. 8,1-8,2 mm çalışma mesafesi ve 675x, 1050x ve 1570x büyütmelerde görüntüler çekin. NOTLAR: Tüm adımlar MD'de gerçekleştirilir. Her adım için 200-250 μL çözelti kullanın.</li>
</ol>8. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin iletim elektron mikroskobu
<ol><li>Karnovsky'nin sabitleyicisini 37 ° C'ye ısıtın. MD'deki hidrojeli çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin.</li>
	<li>Numuneyi Karnovsky'nin RT'deki fiksatif ile 1 saat sabitleyin. Her biri 15 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.</li>
	<li>RT'de45 dakika boyunca% 2 sulu OsO 4 ve% 2.5 potasyum ferrosiyanür ile post-fix. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.</li>
	<li>RT'de 30 dakika boyunca% 0.5 Tiyokarbohidrazit (TCH; Malzeme Tablosuna bakınız) içinde inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.</li>
	<li>RT'de %2 sulu OsO4'te 30 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.</li>
	<li>RT'de 1 saat boyunca% 2 uranil asetat çözeltisinde (Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin. NOT: Bu adımda, sferoidler gece boyunca 4 ° C'de tutulabilir.</li>
	<li>Kurşun aspartat çözeltisinde (bakınız Malzeme Tablosu) 60 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.</li>
	<li>Derecelendirilmiş bir etanol serisinde (% 50,% 70,% 90,% 100 [x2]) ve RT'de her biri 15 dakika boyunca mutlak asetonda dehidratasyon.</li>
	<li>RT'de her biri 2 saat boyunca (1:1; 1:2) aseton/Epon reçinesi ve saf Epon reçinesi (bkz. Malzeme Tablosu) karışımı ile muamele edin.</li>
	<li>Reçineyi gece boyunca 60 °C'de polimerize edin (en az 16 saat). Polimerizasyondan sonra, Ek Şekil 4'te gösterildiği gibi reçine bloğunu MD'den çıkarın.</li>
	<li>Reçine bloğunu reçine yapıştırıcı ile daha büyük bir bloğa takın. Bloğu kesin ve organoidlerin veya sferoidlerin konumuna ulaşın.</li>
	<li>Bir ultramikrotom kullanarak yarı ince (1.000 nm) ve ultra ince kesitler (60 nm) alın (bkz.</li>
	<li>Ultra ince kesitleri 100 örgü bakır ızgaraya yerleştirin ve 30 kV'luk hızlanan voltajda bir STEM dedektörü ile taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. 44 mm çalışma mesafesi ve 2580x, 5020x ve 6060x büyütmelerde görüntüler yakalayın. NOTLAR: Her adım için 200-250 μL çözelti kullanın. MD'de 8.1-8.10 arası adımlar gerçekleştirilir.</li>
</ol>

Ranan Gülhan Aktaş, MD, S-IHC, S-IF ve FS patent başvurularının sahibidir. Olgu Enis Tok bu ürünlerin geliştirilmesinde yer aldı. Olgu Enis Tok ve Gamze Demirel, Celorama isimli şirketin Ar-Ge ekibi üyeleridir. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut ve Özgecan Kayalar'ın beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Burada açıklanan formülasyonları ve protokolleri tamamlayan MD, organoidlerin ve sferoidlerin daha kontrollü bir ortamda hızlı ve spontan 3D büyümesini kolaylaştırır ve deneyi aynı koşullarda sürdürür. Numune tüm süreç boyunca aynı ortamda kalır ve 3B büyüyen mimarilerin yaklaşık %100'ü konteynerde bozulmadan kalır. Bu, sıralı deneyler sırasında homojenliği arttırır ve uzun bir kültür periyoduna izin verir. Ek olarak, organoidler ve küresel işleme sırasındaki adımların sayısı, geleneksel iş akışlarına kıyasla önemli ölçü...

Hücre araştırması ve tedavisinin geleceği, 3D hücre kültürleri 1,2,3'te yatmaktadır. Organoid ve sferoid modeller, insan vücudu gelişimini, fizyolojisini ve hastalıklarını taklit eden daha iyi modeller oluşturarak in vitro deneyler ve hayvan modelleri arasındaki boşluğu kapatır 4,5,6,7,8,9. Bununla birlikte, bu modellerin tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği zorlu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, bu yapıların mevcut teknolojilerle taşınması, toplanması, aktarılması ve santrifüjlenmesi, organoidlerin ve sferoidlerin birçok koşulda kaybolmasına veya hasar görmesine neden olur ve sonuçları önemli ölçüde etkiler.

Histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme ve kriyoprezervasyon için birçok protokole rağmen, deneysel koşulların standartlaştırılması, bu hassas yapıların kaybedilmeden veya zarar görmeden ele alınması ve işlenmesi ile ilgili evrensel bir yaklaşım yoktur. Mevcut protokoller de inanılmaz derecede uzundur, birkaç günden birkaç haftaya kadar değişmektedir ve çeşitli reaktiflerle karmaşık prosedürler içermektedir10,11,12,13,14. Ek olarak, hücre kültürü damarları ve kriyovyaller arasında 3D büyüyen yapıların toplanması, pipetlenmesi, santrifüjlenmesi ve aktarılması, yapıların ve mekanik kuvvetlerin konumlandırılmasında değişikliklere neden olur ve sonuçta organoidlerin ve sferoidlerin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkiler. Doku topolojisinin, hücrelerin konumlandırılmasının ve mekanik kuvvetlerin hücre farklılaşmasını ve olgunlaşmasını önemli ölçüde etkilediği bildirilmiştir 6,15,16,17.

Bu nedenle, istikrarlı kalitede organoidler ve sferoidler üretmek için mevcut geleneksel teknolojilerin geliştirilmesi arzu edilir. Santrifüjleme ve yukarıda açıklanan diğer adımları atlayacak ve çoklu proseslerin başından sonuna kadar malzemeyi tek bir güvenli ortamda sağlayacak bir yöntem/cihaz, en tutarlı ve güvenilir verilere ulaşmak için faydalı olacaktır. Ek olarak, bu zaman, işçilik ve maliyet kısıtlamalarını azaltacaktır.
Burada açıklanan çok amaçlı cihaz (MD), organoidlerin ve sferoidlerin çoklu işlemleri için tek bir güvenli ortam sağlar (Ek Şekil 1). Bu cihaz ve tamamlayıcı protokoller hasat, pipetleme, aktarma ve santrifüj adımlarını ortadan kaldırır. Organoidler ve sferoidler, sıralı süreçler sırasında in vitro ortamlarında kalırlar. Bu ortam esas olarak ticari olarak temin edilebilen hidrojeller gibi doğal veya sentetik hücre dışı matris bileşenlerini içerir. Başka bir deyişle, burada açıklanan yöntemler, bir hidrojel damlası halindeyken bütün monte edilmiş bir organoid / sferoid örneğinin işlenmesine, incelenmesine ve dondurulmasına izin verir.
Biyouyumlu cihaz, 60 °C ile -160 °C arasındaki sıcaklıklara dayanıklıdır, bu da organoidlerin / steroidlerin -160 ° C'de bir sıvı azot tankına geri yüklenmesini veya 60 ° C'de elektron mikroskobu için reçine bloklarının hazırlanmasını mümkün kılar. Cihazdaki niş, 3D büyüyen yapılar için sınırlı bir alan tanımlamak ve önceki çalışmalara dayanarak sferoidlerin veya organoidlerin oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır 18,19,20,21,22,23. Cihazın bu kısmı şeffaftır ve yüksek optik kalite sağlayan belirli bir plastik içerir (kırılma indisi: 1.43; abbe değeri: 58; kalınlık: 7.8 mil [0.0078 in veya 198 μm]). Hem niş hem de çevresindeki 'yan' kısım otofloresana neden olur. Merkezdeki şeffaf niş 80 mm 2 alana sahipken, yan kısım 600 mm2'dir. Kabın derinliği 15 mm'dir ve kalınlığı 1,5 mm'dir. Bu özellikler, cihazın büyüklüğüne ve tasarımına ek olarak, farklı tipte yüksek teknolojili mikroskoplar altında gözlemler yapmayı ve numunelerin elektron mikroskobik incelemeleri için hazırlanmasını mümkün kılmaktadır (Şekil 2). Cihazın kapatma sistemi, biri dondurucuda kapatılmış, diğeri inkübatörde gaz akışına izin veren iki konum sağlar. CCK8 proliferasyonu ve sitotoksisite testleri, geleneksel hücre kültürü yemeklerine kıyasla hücreler üzerinde benzer etkiler göstermektedir (Ek Şekil 2). Tripan mavisi dışlama testi, MD'deki hücre kültürü sırasında yüksek hücre canlılığını (% 94) göstermektedir (Şekil 3).
Tek bir cihazda bir numune için gerçekleştirilebilecek işlemler arasında (1) kültürleme, (2) histolojik boyama, (3) immünohistokimyasal ve immünofloresan etiketleme dahil immünoboyama, (4) dondurma, (5) çözülme, (6) parlak alan, karanlık alan, floresan, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskoplar gibi optik mikroskoplar altında inceleme, (7) doğrudan taramalı elektron mikroskobu altında kaplama ve inceleme veya (8) iletim elektron mikroskobu için hazırlık ( Şekil 2).
Histolojik boyama, immünohistokimyasal etiketleme veya organoidleri ve sferoidleri floresan olarak etiketlemek için farklı metodolojiler mevcuttur 10,11,12,13,14,24,25. Onları hidrojelden toplamak, mevcut teknolojinin ilk ve ana adımıdır. Bu adımdan sonra, bazı yöntemler bütüne monte immüno-etiketlemeye izin verir. Hasat edilen organoidler parafine gömülür, bölümlere ayrılır ve diğerlerinde boyama ve immün boyama için etiketlenir. Ancak, bölümler tüm örneği sunmayabilir ve yapının 3B mimarisiyle ilgili yalnızca sınırlı veriler sağlayabilir. Ayrıca, bu 3D yapılara verilen hasar ve antijenite kaybı, bu teknolojilerin iyi bilinen yan etkileridir.
Bu makaledeki mikroskobik incelemeler için tamamlayıcı yeni protokoller, hala bir hidrojel içinde bulunan bütün montajlı numunelerin analizine izin vermektedir. Burada açıklanan protokoller yeni geliştirilen iki formülasyonu içermektedir: immünohistokimya çözeltisi (S-IHC) ve immünofloresan etiketleme için çözelti (S-IF). Bu çözümlere sahip yöntemler, araştırmacıların daha doğru veriler elde etmelerini sağlar, çünkü santrifüjleme, pipetleme ve hassas yapıların aktarılması gibi geleneksel iş akışlarının zararlı etkileri yoktur. Burada açıklanan protokol ayrıca hasat, blokaj, temizleme ve antijen alma adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve tüm prosedürü 6-8 saate kısaltır. Ayrıca, metodoloji aynı S-IF'ye aynı anda bir ila üç antikor eklenmesine izin verir. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün bir başka avantajı olan çoklu etiketleme deneylerinden sonra bile sonuçları aynı gün içinde elde etmek mümkündür; Geleneksel tam montajlı immünofloresan etiketleme protokolleri tipik olarak 3 gün ile birkaç hafta arasında sürer 10,11,12,13,14.
Antijeniteyi azaltan bir başka zararlı adım olan parafin gömme de ihmal edilir. 3D yapı, mikroskobik incelemenin başından sonuna kadar in vitro ortamında kalır. 3D yapı büyüme koşullarında kaldığından, protein ekspresyonu ve lokalizasyon verileri in vivo koşulları daha iyi taklit eder. Metodoloji, numunenin antijen ekspresyonunu etkileyen adımları ortadan kaldırdığı için daha doğru sonuçlar beklenmektedir. Tablo 1 ve Tablo 2, bu yeni protokollerin geleneksel iş akışlarına kıyasla adımları nasıl ortadan kaldırdığını, laboratuvarda zamandan ve iş gücünden nasıl tasarruf ettiğini ve maliyetleri ve atık ürünleri nasıl azalttığını göstermektedir. 
Yukarıda açıklanan önemli adımlara ek olarak, başka bir sorun, numunenin 3D yapısını daha yüksek hücre canlılık oranları 26,27,28,29,30,31 ile korumak için bir kriyoprezervasyon ortamı ve yöntemi sağlamaktır. Kriyoprezervasyon, stabil bir model sistemi oluşturmak ve organoidlerin ve sferoidlerin biyobankacılığını sağlamak için gereklidir32,33. Biyobankacılığın tüm orijinal 3D yapısı, doğal sağlık veya hastalık durumunun daha sadık bir şekilde özetlenmesine izin verecektir. Kriyoprezervasyonun kolaylığı ve güvenilirliği ve organoidlerin/sferoidlerin çözülmesi en önemli hususlardır. Çözülme sonrası organoid iyileşmesi çoğu güncel teknolojide çok düşüktür, genellikle% 50'den azdır. Bununla birlikte, son çalışmalar26,27,28,29 sağkalım oranlarının artmasıyla umut verici sonuçlar göstermiştir. Lee ve ark., % 15 DMSO 28 içeren Wisconsin Üniversitesi solüsyonunu kullandıklarında sferoid hücrelerin%78'inin kriyoprezervasyondan sonra hayatta kaldığını göstermiştir. Arai ve ark.29'un çalışmasında hücre sağkalım oranı% 83'e yükselmiştir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon sonrası sonuçlar, 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamadığından önemli ölçüde etkilenir. Ek olarak, farmasötik ve teşhis ortamlarında iyi üretim uygulamaları için serumsuz reaktifler gereklidir. Geleneksel iş akışları, yavaş dondurma yöntemi için fetal sığır serumu (FBS) ve dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir ortam kullanır ve her ikisi de handikaplarla ilişkilidir. FBS, hayvansal kaynaklı bir üründür ve parti varyasyonlarına sahip olabilir. DMSO çok başarılı bir kriyoprotektandır, ancak özellikle çözülme sırasında uzun süreli maruz kalma sitotoksik etkilere neden olabilir30,31.
Bu makalede ayrıca, hala bir hidrojel halindeyken tüm organoidlerin veya sferoidlerin donma / çözülme metodolojisi açıklanmaktadır. Çalışmada organoidlerin ve sferoidlerin dondurulması için iki formül kullanılmıştır: (1) geleneksel dondurma çözeltisi (FS) içeren% 10 DMSO ve (2) serum ve DMSO içermeyen bir kriyoprezervasyon ortamı. Bu kriyoprezervasyon ortamı, mevcut formüllerden farklı olan hücre dışı matris bileşenleri içerir. Hücre dışı matris, hücresel bileşenler için fiziksel iskele için gerekli olan iki ana makromolekül sınıfı, proteoglikanlar ve lifli proteinlerden oluşur, ancak aynı zamanda doku morfogenezi, farklılaşma ve homeostaz için gerekli süreçleri başlatır 34,35,36,37,38,39,40 . Kollajenler gerilme mukavemeti sağlar, hücre yapışmasını düzenler, kemotaksisi ve migrasyonu destekler ve doku gelişimini yönlendirir37. Ek olarak, elastin lifleri, tekrarlanan gerilme38'e maruz kalan dokulara geri tepme sağlar. Üçüncü bir fibröz protein olan fibronektin, interstisyel hücre dışı matriksin organizasyonunu yönlendirir ve hücre bağlanmasına aracılık etmede çok önemli bir role sahiptir ve hücre dışı bir mekano-düzenleyici olarak işlev görür39. Du ve ark. tavuk kollajen hidrolizatının doğal aktomiyozin model sistemi41 üzerindeki kriyoprotektif etkisini göstermiştir. Sonuçları, kollajen hidrolizatının buz kristali büyümesini inhibe edebileceğini, ticari kriyoprotektanlara benzer şekilde protein dondurucu-denatürasyonunu ve oksidasyonunu azaltabileceğini ve donma-çözülme döngülerinden sonra daha iyi bir jel yapısı sağlayabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, kriyoprezervasyon ortamına hücre dışı matriks bileşenlerinin eklenmesi, numune için daha güvenli ve koruyucu bir ortam sağlar ve donma-çözülme sonrası canlı yapıların iyileşmesini destekler.
Ek olarak, bu çalışma, canlı organoidlerin ve sferoidlerin sitoplazmik membranlarını ve çekirdeklerini hala hidrojel içindeyken etiketlemek için basit bir protokol tanımlamaktadır.

<table><tbody><tr><td>Mutlak Etanol (EtOH)</td><td>Merck</td><td>8187602500</td> %<td>30, %50, %70, %80, %90 ve %96 çözelti yapmak için dH2O'da seyreltin ve RT</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Merck</td><td>8222512500'da</td> saklayın RT <td></td></tr><tr><td>Alexa flor buğday tohumu aglütininin ve Hoechst&nbsp'de saklayın; Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS) &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>I34406</td><td>Image-IT LIVE Plazma Membranı ve Nükleer Etiketleme Kiti, -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Alfa-1-Fetoprotein (AFP) Konsantre ve Önceden Seyreltilmiş Poliklonal Antikor</td><td>Biocare Medical</td><td>CP 028 +</td><td>4 &°C'de A Mağazası; C</td></tr><tr><td>Anti-albümin antikoru</td><td>Abcam</td><td>EPR20195</td><td>+4 &°C'de saklayın; C, Seyreltme: 1:50</td></tr><tr><td>Anti-beta galaktosidaz antikoru, Tavuk poliklonal</td><td>Abcam</td><td>134435</td><td>+4 & derece'de saklayın; C, Seyreltme: 1:25</td></tr><tr><td>Anti-sitokeratin 5</td><td>Abcam</td><td>53121</td><td>+4 &°C'de saklayın; C, Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>Arginaz-1 Konsantre ve Önceden Seyreltilmiş Tavşan Monoklonal Antikoru</td><td>Biocare Medical</td><td>ACI 3058 A, B</td><td>+4 &°C'de saklayın; C, Seyreltme: 1:50</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl2)</td> <td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>2 mM CaCl yapmak için Karnovsky'nin fiksatifinde çözün < alt > 2 ; RT'de saklayın</td></tr><tr><td>Hücre Sayma Kiti 8 (WST-8 / CCK8)</td> <td>Abcam</td><td>ab228554</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri, 15 mL ve nbsp;</td><td>Nest</td><td>601051</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri, 50 mL&nbsp;</td><td>Nest</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II Mikrobiyolojik Güvenlik Kabini Bio II Advance Plus</td><td>Telstar</td><td>EN12469</td><td></td></tr><tr><td>CO2 İnkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>KM-CC17RU2</td><td></td></tr><tr><td>Bakır Izgaralar Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>G100-Cu</td><td>Izgaralara yerleştirilen ultra ince kesitler; 100 satır / inç kare örgü</td></tr><tr><td>Kritik Nokta Kurutucu</td><td>Leica</td><td>EM CPD300</td> Mutlak aseton DAB/AEC kromojen çözeltisi <td>karışımında SEM uygulamaları için biyolojik numunelerin kurutulması</td></tr><tr><td>için &nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AEC101</td><td>+4 &° C'de Mağaza; C</td></tr><tr><td>Elmas bıçak</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45&�, 40-US</td> Moleküler biyoloji için <td>TEM Dimetil sülfoksit için ultra ince kesitler için kullanın</td></tr><tr><td></td><td>Biofroxx</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Plastik Pasteur Pippettes</td><td>Nest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>+4 &° 'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Eosin Y Çözeltisi Alkollü</td><td>Parlak Slayt</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>Epon reçinesi ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>45359-1EA-F</td><td>Epoksi Gömme Ortamı kiti, +4 &� C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Katkı Maddeli Fetal Sığır Serumu</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3304</td><td>+4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Dondurma Çözeltisi (FS)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-F</td><td>+4 &�C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Cam bıçak üreticisi</td><td>Leica</td><td>EM KMR3</td><td>8 mm kalınlığında cam bıçaklar yapmak için</td></tr><tr><td>Cam bıçak şeritleri (Boyut 8 mm x 25,4 mm x 400 mm)</td><td>Leica</td><td>7890-08</td> TEM Glutaraldehit Sulu Çözeltisi <td>için ultra veya yarı ince kesitler için kullanın</td></tr><tr><td>, EM sınıfı, %25&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>16210</td>% <td>2.5 çözelti yapmak için dH2O'da seyreltin ve +4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Gliserol çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56-81-5</td><td>-20 ° C'de saklayın, Seyreltme: 1:100</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavuk IgY (H + L) İkincil Antikor, Alexa, 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32933</td><td>RT'de saklayın</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35502</td><td>+4 & derecede saklayın; C,&nbsp; Seyreltme: 1:50</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84540</td><td>+4 & derecede saklayın; C,&nbsp; Seyreltme: 1:50</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35552</td><td>+4 &°C'de saklayın; C,&nbsp; Seyreltme: 1:50</td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84541</td><td>+4 & °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Hematoksilen Harris&nbsp;</td><td>Parlak Slayt</td><td>2.BS01-104-1000</td><td></td></tr><tr><td>HepG2 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Azot tankında saklayın</td></tr><tr><td>İnsan/Sıçan OV-6 Antikor Monoklonal Fare IgG1 Klonu # OV-6 R</td><td>& D Systems</td><td>MAB2020</td><td>-20 °C mağaza; C</td></tr><tr><td>Hidrojel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td>Matrigel, Temel Membran Matrisi Yüksek Konsantrasyon (HC), LDEV içermez, 10 mL, -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Hidrojel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matrigel, Temel Membran Matrisi, LDEV içermez, 10 mL, -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Hidrojel</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A1413201</td><td>Geltrex, LDEV İçermeyen Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi Hidrojel</td></tr><tr><td>Biyoteknoloji</td><td>, Ar-Ge D Systems</td><td>BME001-01</td><td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, -20 &°C'de Saklayın; C</td></tr><tr><td>Karnovsky'nin fiksatifi</td><td></td><td></td><td>%2 PFA, 0.15 M Kakodilat Tamponunda %2.5 Glutaraldehit, 2 mM CaCl2; taze hazırlayın; TEM & SEM örnekleri</td></tr><tr><td>L-Aspartik asit</td><td>Sigma</td><td>11189-100G</td> RT <td></td></tr><tr><td>Kurşun aspartat çözeltisinde</td><td></td><td></td> saklayın <td>40 mg aspartik asidi 10 mL ddH2O'da çözün ve 66 mg kurşun nitrat ekleyin. Çözelti 60 ° C'de stabilize edilir; C ve pH'ı 5'e ayarlayın; taze</td></tr><tr><td>Kurşun nitrat Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>17900</td><td>RT'de saklayın</td></tr><tr><td>Leica Konfokal Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>Biotek Synergy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çok Amaçlı Cihaz (MD)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-M</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer DNA lekesi</td><td>Invitrogen</td><td>H3569</td><td>Hoechst 33258, Pentahidrat (bis-Benzimid) - Suda 10 mg / mL Çözelti, +4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Nükleer-DNA lekesi</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62248</td><td>DAPI çözeltisi, +4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Osmiyum Tetroksit (OsO<alt>4</alt>),%4</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19190</td><td>%2 çözelti yapmak için dH2O içinde seyreltin; +4 &°C'de saklayın; C ve hava geçirmez bir kapta; hafif</td></tr><tr><td>Ov6 antikorunu</td> koruyun <td>R& D sistemleri</td><td>MAB2020</td><td>+4 >'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA) çözeltisi, %4 & nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1.04005.1000</td><td>%4 PFA'yı dH2O'da çözün ve kaynatın, soğutun ve çıkarın; -20 °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehit çözeltisi PBS'de %4, 1 L</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-281692</td><td>+4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS), tabletler</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>Post-fiksatif çözelti</td><td></td><td></td><td>%2 OsO4, %2.5 Potasyum Ferrosiyanür dH2O; taze</td></tr><tr><td>Potasyum Ferrosiyanür sulu çözeltisi hazırlayın,% 5&nbsp;</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>26603-01</td><td>RT Primovert'te Saklayın</td></tr><tr><td>- Ters Parlak Alan Mikroskobu - ZEISS</td><td>Zeiss</td><td>Ürün no.: 491206-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Yuvarlak tabanlı mikrosantrifüj tüpleri, 2 mL</td><td>Nest</td><td>620611</td><td></td></tr><tr><td>STEM bağlantılı Taramalı Elektron Mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>GeminiSEM 500</td><td>Elektron mikrograflarını taramak için 2-3 kV'da Inlens İkincil Elektron (SE) dedektörü ve transmisyon elektron mikrografları için 30 kV'da aSTEM dedektörü kullanıyoruz.</td></tr><tr><td>SensiTek HRP Anti-Polivalent Laboratuvar Paketi</td><td>ScyTek Laboratories</td><td>SHP125</td><td>+4 &°C'de Saklayın; C</td></tr><tr><td>Sodyum Kakodilat Tamponu, 0.4 M, pH 7.2</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>11655</td><td>0.2 M yapmak için dH2O'da seyreltin ve +4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Sodyum / Potasyum ATPaz alfa 1 antikoru [M7-PB-E9]</td> <td>GeneTex</td><td>GTX22871</td><td>-20 ° C'de saklayın; </td></tr><tr><td>İmmünofloresan Etiketleme için C Çözeltisi (S-IF)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-IF</td><td>+4 &°C'de saklayın; </td></tr><tr><td>İmmünohistokimya için C Çözeltisi (S-IHC)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-P</td><td>+4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Numune düzeltme cihazı</td><td>Leica</td><td>EM TRIM2</td><td>Ultramikrotoma epon numune bloğu hazırlamak için</td></tr><tr><td>Püskürtme kaplayıcı</td><td>Leica</td><td>EM ACE200</td><td>SEM numunelerini 90 s için 6 nm altın/paladyum ile kaplayın</td></tr><tr><td>Tiyokarbohidrazid (TCH)</td><td>Sigma</td><td>223220-5G</td><td>% 0.5 çözelti yapmak için dH 2 O ile seyreltin ve 0.22 & mikro ile filtreleyin; M membran filtre; RT'de mağaza; taze</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi hazırlayın, %0,4</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra jel süper yapıştırıcı</td><td>Pattex</td><td>PSG2C</td><td>Numuneden tutucuya epon bloğu ile polimerize epon bloğu</td></tr> tutkalı için <tr><td>Ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) için yüksek kaliteli ultra veya yarı ince kesitler hazırlamak için)</td></tr> <tr><td>Üniversal Pipet Uçları, 10 &; L</td><td>Nest</td><td>171215-1101</td><td></td></tr><tr><td>Üniversal Pipet Uçları, 1000 & L</td><td>Isolab</td><td>L-002</td><td></td></tr><tr><td>Üniversal Pipet Uçları, 200 & L&nbsp;</td><td>Nest</td><td>110919HA01</td><td></td></tr><tr><td>Uranil Asetat Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>22400</td><td>% 2 çözelti yapmak ve 0.22 < mikro ile filtrelemek için dH > alt 2 O içinde seyreltin; M membran filtre; RT'de sıkıca kapalı konteyner deposunu tutun</td></tr></tbody></table>

tüm organoidlerin ve sferoidlerin hala bir hidrojel İçinde kültürlenmesi, dondurulması, İşlenmesi ve görüntülenmesi

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Hücre kültürü laboratuvarlarında üç boyutlu büyüyen yapılar olan organoidler ve sferoidler, insan vücudunu daha iyi taklit ettikleri ve hayvan çalışmalarına göre avantajlara sahip oldukları için iki boyutlu kültür modellerine kıyasla daha üstün modeller olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar genellikle tekrarlanabilirlik ve tutarlılık ile ilgili sorunlarla karşı karşıyadır. Uzun deneysel süreçler sırasında - organoidlerin ve sferoidlerin farklı hücre kültürü damarları arasında transferi, pipetleme ve santrifüjleme ile - bu hassas ve kırılgan 3D büyüyen yapılar genellikle hasar görür veya kaybolur. Sonuçta, sonuçlar önemli ölçüde etkilenir, çünkü 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamaz. Burada açıklanan yöntemler, bu stresli adımları en aza indirir ve çok amaçlı bir cihazda hala bir hidrojel içindeyken, işleme dizisi boyunca organoidler ve sferoidler için güvenli ve tutarlı bir ortam sağlar. Araştırmacılar, tek bir çok amaçlı cihaz kullanarak organoidlerin veya sferoidlerin yapısını konfokalden elektron mikroskoplarına kadar çeşitli yüksek teknoloji ürünü aletler altında büyütebilir, dondurabilir, çözebilir, işleyebilir, lekeleyebilir, etiketleyebilir ve daha sonra inceleyebilirler. Bu teknoloji, çalışmaların tekrarlanabilirliğini, güvenilirliğini ve geçerliliğini geliştirirken, işleme sırasında 3D büyüyen yapılar için istikrarlı ve koruyucu bir ortam sağlar. Ek olarak, stresli adımları ortadan kaldırmak taşıma hatalarını en aza indirir, alınan süreyi azaltır ve kontaminasyon riskini azaltır.

Bu makale, çok amaçlı bir cihazı (MD) ve kültürleme, dondurma, çözme, histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme, kaplama ve tüm organoidlerin veya sferoidlerin işlenmesi için metodolojileri tamamlayan metodolojileri benzersiz bir şekilde tasarlanmış tek bir ortamda bir hidrojel içinde temsil etmektedir. Mevcut çalışma, 35 MD'de 35 hidrojel damlasında HepG2 karaciğer kanseri sferoidlerini hazırlamak için tasarlanmıştır. Ek olarak, MD'lerdeki akciğer organoidleri, organoid çalışmalar için mev...

Bu çalışma, çok amaçlı bir cihaz içindeki bir hidrojelde bozulmadan kalırken, tüm sferoidlerin ve organoidlerin çeşitli mikroskoplar altında kültürlenmesi, dondurulması, çözülmesi, işlenmesi, boyanması, etiketlenmesi ve incelenmesi için metodolojileri açıklamaktadır.

Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Çok kırılgan olan organoidler ve sferoidler, kullanım sırasında ciddi şekilde hasar görürler. Protokolümüz, bu 3B büyüyen yapıların çeşitli süreçler sırasında bozulmadan kalmasını sağlar, böylece doğruluğu, tekrarlanabilirliği, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği artırır. Araştırmacı, tek bir çok amaçlı cihaz içinde bir hidrojelde bozulmadan kalırken, tüm organoidleri ve sferoidleri çeşitli mikroskoplar altında kültürleyebilir, dondurabilir, çözebilir, işleyebilir, boyayabilir ve inceleyebilir.Bir hastalık modelinin oluşturulmasını ve sıralı adımların çok amaçlı tek bir cihazda izlenmesini sağlar. Teknoloji, hastalıkların teşhisi ve prognozu için biyobelirteçleri incelerken daha fazla doğruluk sağlar. Bu yöntem, organoidler, sferoidler, bireysel hücreler veya canlı organizmalar dahil olmak üzere herhangi bir 3D yetiştirme sistemine uygulanabilir.Organoid veya küresel kültüre başlamak için, düzgün çözülmüş hidrojeli 15 dakika boyunca laminer bir akış başlığı içindeki buz üzerine yerleştirin. Ayrıca, hepatosellüler karsinomun veya HEPG2 hücrelerinin bir peletini içeren tüpü buz üzerinde tutun. Daha sonra, bir jel damlası oluşturmak için önceden ısıtılmış çok amaçlı cihazın nişi içinde 30 ila 35 mikrolitre% 100 hidrojel plakası, hidrojel damlasının tepesinin ortasına 10.000 HEPG2 hücresi yerleştirin ve kurulumu 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, hidrojel damlasını% 10 fetal sığır serumu veya FBS içeren 200 mikrolitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM ile örtün. Kapağı, inkübatöre yerleştirmeden önce gaz akışına izin vererek cihaza düzgün bir şekilde yerleştirin. Her gün, hücreleri% 10 FBS içeren 200 mikrolitre DMEM ile besleyin.Sferoidlerin büyümesini ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin. Organoidlerin immünofloresan etiketlemesine başlamadan önce, gerekli ortamı ve çözeltileri 37 santigrat dereceye ısıtın. 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit eklemeden önce hidrojel damlasını çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin ve 15 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirerek sabitleyin.Daha sonra, fiksatifi aspire edin ve immünofloresan etiketleme veya SIF, her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış çözeltiyi yıkayın. Sonraki adımlara geçmeden önce nem sağlamak için nişi çevreleyen alana damıtılmış su ekleyin. Hidrojel damlasını çevreleyen SIF'yi aspire edin ve 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce SIF'deki önceden ısıtılmış birincil antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini hidrojele ekleyin.Daha sonra, birincil antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat dereceye ısıtılmış SIF ile yıkayın. Yıkamayı takiben, kalan SIF'yi aspire edin ve SIF'deki önceden ısıtılmış sekonder antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini hidrojele ekleyin. Hidrojeli karanlıkta 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve hidrojel damlasını PBS ile karanlıkta her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat derecede yıkayın. Daha sonra, artık PBS'yi aspire edin ve hidrojeli, karanlıkta 37 santigrat derecede montaj ortamı veya gliserol içeren 100 mikrolitre nükleer DNA boyası ile inkübe edin. Hidrojeli içeren çok amaçlı cihazı sıkıca kapatmadan önce kurumasını önlemek için nişi gliserol ile doldurun.Organoidleri konfokal mikroskopi ile incelemek için, makalede verilen talimatları izleyerek mikroskop parametrelerini ayarlayın. Organoidleri dondurmak için, hücre kültürü ortamını aspire edin, önceden ısıtılmış dondurma çözeltisinden 200 mikrolitre ekleyin ve numuneyi bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir köpük kutunun içine yerleştirmeden önce cihazın kapağını sıkıca kapatın.Bu köpük kutusunu başka bir köpük kutuya yerleştirin ve her iki köpük kutusunu da sıkıca kapatın. Kutuyu iki saat boyunca eksi 20 santigrat derecede tutun, ardından gece boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuda bırakın. Organoidleri altı aydan daha uzun süre saklamak için, organoidleri içeren çok amaçlı cihazı kutulardan çıkarın ve sıvı azot tankına aktarın.Organoidleri çözmek için, numuneyi içeren çok amaçlı cihazı dondurucudan veya sıvı azot tankından çıkarın ve doğrudan 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Çözüldükten sonra, taze ortam eklemeden ve tüm montajlı organoid hidrojeli görüntülemeye devam etmeden önce ortamı ve dondurucu çözelti karışımını nazikçe aspire edin. Canlı görüntülemede, hidrojel içindeki büyüyen organoidler, hücre peletinin yerleştirilmesinden üç ila beş gün sonra, özellikle hidrojel kubbesinin çevresinde, görünür hale geldi.Ters faz kontrast mikroskobu altında sferoidler içeren bir hidrojelin farklı seviyelerindeki görüntülerin zaman serisi burada gösterilmiştir. Hücre zarını ve çekirdeği canlı boyadıktan sonra tüm montajlı canlı organoidlerin konfokal mikroskopi görüntüleri, çevre ve merkezde benzer etiketleme yoğunluğu göstermiştir. Ayrıca, tüm monte steroidlerin immünofloresan etiketlemesi, bir antikor, iki antikor ve üç antikor ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir ve ek tedavi adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır.Temsili analiz, bir cihazdaki iki immünofloresan etiketli hava yolu organoidini göstermektedir. Çok amaçlı cihazdaki tüm sferoidlerin SEM görüntüleri ve kesitli steroidlerin 10 görüntüsü, açıklanan protokolün etkinliğini gösteren, sferoidlerin, sitoplazmik organellerin ve diğer ultra-yapısal hücresel özelliklerin iyi korunmuş 3D mimarisini göstermiştir. Hidrojel kubbenin sınırlarındaki düzensizlik, numunelerin dondurulmasından sonra belirgindi.Bununla birlikte, sferoidlerin büyüklüğü ve yuvarlaklığı benzer kalmıştır. Dondurulmuş örnekler çözüldükten sonra kültür yüzeyinde hücre göçü gözlendi. Teknik çok basittir.Bununla birlikte, araştırmacı, numunenin zarar görmesini önlemek için hidrojel damlasını çevreleyen sıvıları aspire ederken veya eklerken çok nazik olmalıdır. Araştırmacı, yüksek teknolojili bir mikroskop kullanarak aynı örneğe tek bir cihazda bakabilir ve bağıntılı bir çalışma yürütebilir.

culturing-freezing-processing-imaging-entire-organoids-spheroids

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada, 100 μm'den birkaç milimetreye kadar değişen sabit üç boyutlu hücre kültürü modellerinin boyama ve hücre altı çözünürlükte görüntülenmesini gerçekleştirmek için ayrıntılı, sağlam ve tamamlayıcı protokoller sunuyoruz, böylece morfolojilerinin, hücre tipi bileşimlerinin ve etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlıyoruz.

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Burada, insan pluripotent kök hücre kaynaklı ince bağırsak ve kolonik organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tekrarlanabilirliği artırmak, ölçeklenebilirliği genişletmek ve organoidlerin kaplanması ve geçirilmesi için gereken çalışma süresini azaltmak için tasarlanmıştır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Burada insan burun epitel hücrelerinden in vitro organoid modeli tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Protokol, standart laboratuvar ekipmanı gerektiren ölçümler için seçeneklere ve özel ekipman ve yazılımlar için ek olanaklara sahiptir.

İnsan Nazal Epitel Organoidlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi

Burada, birincil hasta örneklerinden veya hasta kaynaklı hücre kültürlerinden glioblastoma (GBM) organoidleri üretme ve olgunluğa kadar sürdürme yöntemini açıklıyoruz. Bu GBM organoidleri fenotipik olarak çeşitli hücre popülasyonları içerir ve tümör mikroortamlarını ex vivo olarak yeniden yaratır.

Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Bu yazıda, organoidlerin yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak kültürlenebildiği ve gözlemlenebildiğimm2 başına yüzlerce mikro konteynere sahip yeni bir kültür substratı türü için bir üretim protokolü sunulmaktadır. Hücre tohumlama ve immün boyama protokolleri de detaylandırılmıştır.

Organoidlerin kültürü ve 3D görüntülenmesi için yüksek verimli bir platform

Burada, tümör sferoidlerinin hızlı, sağlam ve ucuz bir şekilde üretilmesini ve ardından hidrojel kapsüllenmesini sağlayan bir protokol sunuyoruz. Özel ekipman gerektirmediği için yaygın olarak uygulanabilir. Sferoid-matriks etkileşimlerini araştırmak ve in vitro doku fizyolojisi veya patoloji modelleri oluşturmak için özellikle yararlı olacaktır.

Sferoid-Matriks Etkileşimlerini İncelemek için Polietilen Glikol Hidrojellerde Tümör Sferoid Üretimi ve Kapsüllenmesi

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Düşük tutarlı holotomografi kullanarak organoidlerin yüksek çözünürlüklü, etiketsiz ve üç boyutlu görüntülenmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, canlı organoidlerde yapısal dinamiklerin ve ilaç yanıtlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan organoid kültür hazırlama, görüntüleme elde etme ve hesaplamalı görüntü analizini detaylandırır.

Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

Keşfedin: Organoid ve sferoidleri hidrojel içinde kültüre etme, dondurma, çözme, işleme ve görüntüleme protokolü. HEPG2 hücreleri kullanılarak yapılan bu yöntem, 3D yapıların bütünlüğünü koruyarak hastalık modellemesi ve biyobelirteç analizi için güvenilir sonuçlar sağlar.

Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet