Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi

Çok kırılgan olan organoidler ve sferoidler, kullanım sırasında ciddi şekilde hasar görürler. Protokolümüz, bu 3B büyüyen yapıların çeşitli süreçler sırasında bozulmadan kalmasını sağlar, böylece doğruluğu, tekrarlanabilirliği, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği artırır. Araştırmacı, tek bir çok amaçlı cihaz içinde bir hidrojelde bozulmadan kalırken, tüm organoidleri ve sferoidleri çeşitli mikroskoplar altında kültürleyebilir, dondurabilir, çözebilir, işleyebilir, boyayabilir ve inceleyebilir.

Bir hastalık modelinin oluşturulmasını ve sıralı adımların çok amaçlı tek bir cihazda izlenmesini sağlar. Teknoloji, hastalıkların teşhisi ve prognozu için biyobelirteçleri incelerken daha fazla doğruluk sağlar. Bu yöntem, organoidler, sferoidler, bireysel hücreler veya canlı organizmalar dahil olmak üzere herhangi bir 3D yetiştirme sistemine uygulanabilir.

Organoid veya küresel kültüre başlamak için, düzgün çözülmüş hidrojeli 15 dakika boyunca laminer bir akış başlığı içindeki buz üzerine yerleştirin. Ayrıca, hepatosellüler karsinomun veya HEPG2 hücrelerinin bir peletini içeren tüpü buz üzerinde tutun. Daha sonra, bir jel damlası oluşturmak için önceden ısıtılmış çok amaçlı cihazın nişi içinde 30 ila 35 mikrolitre% 100 hidrojel plakası, hidrojel damlasının tepesinin ortasına 10.000 HEPG2 hücresi yerleştirin ve kurulumu 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, hidrojel damlasını% 10 fetal sığır serumu veya FBS içeren 200 mikrolitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM ile örtün. Kapağı, inkübatöre yerleştirmeden önce gaz akışına izin vererek cihaza düzgün bir şekilde yerleştirin. Her gün, hücreleri% 10 FBS içeren 200 mikrolitre DMEM ile besleyin.

Sferoidlerin büyümesini ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin. Organoidlerin immünofloresan etiketlemesine başlamadan önce, gerekli ortamı ve çözeltileri 37 santigrat dereceye ısıtın. 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit eklemeden önce hidrojel damlasını çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin ve 15 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirerek sabitleyin.

Daha sonra, fiksatifi aspire edin ve immünofloresan etiketleme veya SIF, her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış çözeltiyi yıkayın. Sonraki adımlara geçmeden önce nem sağlamak için nişi çevreleyen alana damıtılmış su ekleyin. Hidrojel damlasını çevreleyen SIF'yi aspire edin ve 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce SIF'deki önceden ısıtılmış birincil antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini hidrojele ekleyin.

Daha sonra, birincil antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat dereceye ısıtılmış SIF ile yıkayın. Yıkamayı takiben, kalan SIF'yi aspire edin ve SIF'deki önceden ısıtılmış sekonder antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini hidrojele ekleyin. Hidrojeli karanlıkta 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve hidrojel damlasını PBS ile karanlıkta her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat derecede yıkayın. Daha sonra, artık PBS'yi aspire edin ve hidrojeli, karanlıkta 37 santigrat derecede montaj ortamı veya gliserol içeren 100 mikrolitre nükleer DNA boyası ile inkübe edin. Hidrojeli içeren çok amaçlı cihazı sıkıca kapatmadan önce kurumasını önlemek için nişi gliserol ile doldurun.

Organoidleri konfokal mikroskopi ile incelemek için, makalede verilen talimatları izleyerek mikroskop parametrelerini ayarlayın. Organoidleri dondurmak için, hücre kültürü ortamını aspire edin, önceden ısıtılmış dondurma çözeltisinden 200 mikrolitre ekleyin ve numuneyi bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir köpük kutunun içine yerleştirmeden önce cihazın kapağını sıkıca kapatın.

Bu köpük kutusunu başka bir köpük kutuya yerleştirin ve her iki köpük kutusunu da sıkıca kapatın. Kutuyu iki saat boyunca eksi 20 santigrat derecede tutun, ardından gece boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuda bırakın. Organoidleri altı aydan daha uzun süre saklamak için, organoidleri içeren çok amaçlı cihazı kutulardan çıkarın ve sıvı azot tankına aktarın.

Organoidleri çözmek için, numuneyi içeren çok amaçlı cihazı dondurucudan veya sıvı azot tankından çıkarın ve doğrudan 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Çözüldükten sonra, taze ortam eklemeden ve tüm montajlı organoid hidrojeli görüntülemeye devam etmeden önce ortamı ve dondurucu çözelti karışımını nazikçe aspire edin. Canlı görüntülemede, hidrojel içindeki büyüyen organoidler, hücre peletinin yerleştirilmesinden üç ila beş gün sonra, özellikle hidrojel kubbesinin çevresinde, görünür hale geldi.

Ters faz kontrast mikroskobu altında sferoidler içeren bir hidrojelin farklı seviyelerindeki görüntülerin zaman serisi burada gösterilmiştir. Hücre zarını ve çekirdeği canlı boyadıktan sonra tüm montajlı canlı organoidlerin konfokal mikroskopi görüntüleri, çevre ve merkezde benzer etiketleme yoğunluğu göstermiştir. Ayrıca, tüm monte steroidlerin immünofloresan etiketlemesi, bir antikor, iki antikor ve üç antikor ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir ve ek tedavi adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır.

Temsili analiz, bir cihazdaki iki immünofloresan etiketli hava yolu organoidini göstermektedir. Çok amaçlı cihazdaki tüm sferoidlerin SEM görüntüleri ve kesitli steroidlerin 10 görüntüsü, açıklanan protokolün etkinliğini gösteren, sferoidlerin, sitoplazmik organellerin ve diğer ultra-yapısal hücresel özelliklerin iyi korunmuş 3D mimarisini göstermiştir. Hidrojel kubbenin sınırlarındaki düzensizlik, numunelerin dondurulmasından sonra belirgindi.

Bununla birlikte, sferoidlerin büyüklüğü ve yuvarlaklığı benzer kalmıştır. Dondurulmuş örnekler çözüldükten sonra kültür yüzeyinde hücre göçü gözlendi. Teknik çok basittir.

Bununla birlikte, araştırmacı, numunenin zarar görmesini önlemek için hidrojel damlasını çevreleyen sıvıları aspire ederken veya eklerken çok nazik olmalıdır. Araştırmacı, yüksek teknolojili bir mikroskop kullanarak aynı örneğe tek bir cihazda bakabilir ve bağıntılı bir çalışma yürütebilir.