Name: Burada: Silico Konakçı-Patojen Etkileşimleri Sırasında SirkRNAların Tanımlanması ve Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Keşfedin, konakçı-patojen etkileşimlerinde sirkRNA'ların in silico analizi için biyoinformatik araçlarla kapsamlı bir pipeline. Başlangıç seviyesindeki araştırmacılar için RNA dizileme verilerinden fonksiyonel zenginleştirme ve klinik aday belirleme yöntemlerini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazar, bu makaleyi eleştirel bir şekilde gözden geçirdikleri için Tan Ke En ve Dr. Cameron Bracken'e teşekkür eder. Bu çalışma, Temel Araştırma Hibe Programı (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) ve Malaya Üniversitesi Yüksek Etkili Araştırma Bursu (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

Bu protokolde, influenza A virüsü ile enfekte olmuş insan makrofaj hücrelerinden hazırlanan kimliksizleştirilmiş ribozomal RNA (rRNA)-tükenmiş RNA-seq kütüphanesi veri setleri, Gen İfade Omnibus (GEO) veritabanından indirilmiş ve kullanılmıştır. Tahminden sirkRNA'ların fonksiyonel karakterizasyonuna kadar tüm biyoinformatik boru hattı Şekil 1'de özetlenmiştir. Boru hattının her bir parçası aşağıdaki bölümlerde daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
1. Veri analizinden önce hazırlık, indirme ve kurulum
NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm yazılım paketleri ücretsiz ve açık kaynaklıdır.
<ol><li>Linux platformunda gerekli araçları indirme<ol><li>Malzeme Tablosunda listelenen gerekli yazılım ve araçları, geliştirici tarafından sağlanan talimatları kullanarak Linux yüksek performanslı bir bilgisayara indirin ve yükleyin. NOT: Araçların ve yazılımların çoğunun, araçlarını yükleme ve kullanma talimatlarını içeren kendi çevrimiçi GitHub sayfaları veya belgeleri vardır ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
		<li>SirkRNA tespiti ve analizi için istenen RNA-seq veri setlerini dizi arşivi web sitelerinden indirin (örneğin, Avrupa Nükleotidler Arşivi ve Gen İfadesi Omnibus).</li>
		<li>RNA-seq veri setinin hazırlandığı konakçıyla uyumlu referans genomları (FASTA formatı) ve ek açıklama dosyalarını (GTF/GFF3 formatı) indirin. Ana bilgisayar referans genomları ve ek açıklama dosyaları genellikle Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI), California Santa Cruz Üniversitesi (UCSC) ve Ensembl web siteleri gibi çevrimiçi genom tarayıcılarında bulunur.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA-seq kalite kontrolü<ol><li>RNA dizilerinin kalitesini belirlemek için FASTQ dosyalarını FASTQC programına girin. FASTQ dosyalarının kalitesi düşükse (örneğin, <Q20) veya adaptör dizilerinin varlığı durumunda, Trimmomatic29,30 gibi araçlar kullanılarak daha fazla kırpma gerekebilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. CIRIquant kullanarak sirkRNA'ların tahmin ve diferansiyel ekspresyon analizi
NOT: Diferansiyel ifade analizinin yüklenmesi ve gerçekleştirilmesiyle ilgili daha ayrıntılı bir kılavuz, CIRIquant kağıt31'in kod kullanılabilirliği bölümünde bulunabilir. Ek veriler, bu protokolde kullanılan bazı temel komutları da içerir.
<ol><li>CircRNA tahminleri<ol><li>BWA ve HISAT2 hizalayıcılarını kullanarak önce konağın referans genomunu indeksleyin. Daha sonra, bir Linux terminalinde, dizine eklemek için ana bilgisayarın referans genomunun dizininde bwa index 32 ve hisat2-build33 komutlarını çalıştırın.</li>
		<li>Ardından, dosyanın adını, araçların yolunu (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), indirilen referans dosyalarının yolunu (ana bilgisayarın referans genomu FASTA dosyaları, ek açıklama dosyaları) ve adım 2.1.1'den itibaren dizin dosyalarının yolunu içeren bir YML yapılandırma dosyası hazırlayın.</li>
		<li>Varsayılan veya manuel parametreleri kullanarak CIRIquant aracını terminalden yürütün. Kullanıcı, CIRIquant aracını çalıştırırken RNA-seq verilerinin kütüphane türünü (sarmallı veya zincirsiz) belirtebilir. NOT: RNA-SEQ verilerinin kütüphane tipi, kullanılan kütüphane hazırlama kitinin türü bilinerek belirlenebilir. Kütüphane hazırlama kitinin kimliği bilinmiyorsa, RNA-seq verilerinin kısıtlılığını belirlemek için RSeQC36 adı verilen bir RNA-seq kontrol biyoinformatik paketi kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferansiyel ifade analizi NOT: CIRIquant paketi prep_CIRIquant, prepDE.py ve CIRI_DE_replicate içerir; bu nedenle, bu üç araç için ek indirme gerekmez.<ol><li>Aşağıdakileri içeren bir veri listesi içeren bir metin dosyası (.lst) hazırlayın: 1. sütun: Adım 2.1.3'te kullanılan RNA-seq verilerinin kimlikleri 2. sütun: CIRIquant tarafından çıkarılan GTF dosyalarının yolu 3. sütun: RNA-seq verilerinin gruplandırılması, kontrol veya tedavi edilen bir grup olup olmadığı.</li>
		<li>Bir örnek için, aşağıdaki Tablo 1'e bakın. NOT: Sadece referans amaçlı oldukları için başlıkları koymak gerekli değildir.</li>
		<li>Linux terminalinde, adım 2.2.1'de hazırlanan metin dosyasıyla (.lst) giriş olarak prep_CIRIquant çalıştırın. Çalıştırma bir dosya listesi oluşturur: library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv ve circRNA_ratio.csv.</li>
		<li>RNA-seq ID'lerini ve ilgili StringTie çıktılarının yolunu içeren bir veri listesi içeren ikinci bir metin dosyası hazırlayın. Dosya düzeni, gruplandırma sütunu olmadan adım 2.2.1'deki metin dosyasına benzer olmalıdır.</li>
		<li>Gen sayısı matris dosyalarını oluşturmak için adım 2.2.4'te hazırlanan metin dosyasıyla prepDE.py giriş olarak çalıştırın.</li>
		<li>Son circRNA_de.tsv dosyasının çıktısını almak için adım 2.2.3'teki library_info.csv ve circRNA_bsj.csv dosyalarıyla ve adım 2.2.5'teki gene_count_matrix.csv dosyasıyla giriş olarak CIRI_DE_replicate yürütün.</li>
	</ol></li>
	<li>DE sirkRNA'larının filtrelenmesi<ol><li>Diferansiyel olarak ifade edilen (DE) sirkRNA'ların sayısını filtrelemek ve belirlemek üzere adım 2.2.6'dan oluşturulan circRNA_de.tsv dosyasını açmak için R (bilgisayar terminalinde veya RStudio'da) veya herhangi bir elektronik tablo yazılımını (örneğin, Microsoft Excel) kullanın.</li>
		<li>DE sirkRNA'larını LogFC kriterlerine göre filtreleyin > |2| ve FDR < 0.05.</li>
		<li>DE sirkRNA'larının bilgilerini depolamak için DE_circRNAs.txt adlı bir dosya oluşturun.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Öngörülen DE sirkRNA'larının karakterizasyonu ve ek açıklaması
<ol><li>DE sirkRNA'larının ek açıklama durumu<ol><li>Adım 2.3.3'ten filtrelenen DE sirkRNA'larının listesinden oluşan RStudio'da DE_circRNAs.txt adlı dosyayı yükleyin. Genomik pozisyonlar (Chr, Start, End), iplikçik oryantasyonları (+ veya -), gen adı ve circRNA tipi gibi diğer bilgileri de dahil edin. Devam etmeden önce, sirkRNA genomik başlangıç koordinatlarını CIRIquant'tan 1 baz çiftini çıkararak 0 tabanlıya dönüştürün. NOT: Yukarıda belirtilen diğer bilgiler, CIRIquant (Ek Dosya 1) tarafından çıkarılan GTF dosyalarından elde edilebilir.</li>
		<li>Tahmin edilen DE sirkRNA'larının ek açıklama durumunu, circRNA veritabanının (örneğin, circBase) biriktirilen sirkRNA'ların genomik konumlarını içeren bir kütüphane indirerek belirleyin. NOT: Karşılaştırmayı yapmadan önce sirkRNA'ları tahmin etmek için kullanılan genom versiyonunun circRNA veritabanı kütüphanesi ile aynı olduğundan emin olun. Burada kullanılan circBase veri dosyası, Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37'de sağlanan sürücü klasöründe ücretsiz olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Adım 3.1.1 ve adım 3.1.2'deki her iki dosya da hazırlandıktan sonra, Ek Dosya 1'de verilen R betiğini çalıştırın. DE sirkRNA'larının kromozomal konumları, Açıklamalı veya Açıklamasız durumu atanmadan önce kütüphaneye sorgulanır.</li>
	</ol></li>
	<li>DE sirkRNA'larının karakterizasyonu<ol><li>SirkRNA tiplerine (yani ekzon, intron, intergenik ve antisens) göre sirkRNA'ların sayısını ve sirkRNA'ların yayıldığı gen sayısını (1 veya >1) özetlemek için R ve diğer elektronik tablo yazılımlarını kullanın (Ek Dosya 1).NOT: CIRIquant sadece dört tip sirkRNA'yı (ekzon, intron, intergenik ve antisens) tespit edebilir. ElciRNA'lar olarak da bilinen ekzon-intron sirkRNA'lar, CIRIquant tarafından tespit edilemez.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Circr kullanarak circRNA-miRNA etkileşimini tahmin etme
NOT: CircRNA-miRNA etkileşim analizi için Circr'nin nasıl kurulacağı ve kullanılacağı hakkında daha ayrıntılı bir kılavuz şu adreste bulunabilir: https://github.com/bicciatolab/Circr37.
<ol><li>Dosyaların hazırlanması<ol><li>"WinRar" veya "7-zip" gibi ilgili yazılımları kullanarak Circr GitHub sayfasından indirdikten sonra Circr.zip dosyasının içeriğini açın ve analizin yapılacağı yeni bir dizine çıkarın.</li>
		<li>CircRNA-miRNA analizini yapmadan önce önkoşul yazılım uygulamalarını (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools ve samtools) yükleyin.</li>
		<li>İlgilenilen çeşitli organizmalar için referans genomlar ve ek açıklama dosyaları, rRNA koordinatları dosyası, doğrulanmış miRNA etkileşim dosyası ve circBase circRNA dosyaları, Circr yazarı tarafından Github sayfasında (https://github.com/bicciatolab/Circr)37 sağlanmıştır. Sürücü klasöründeki destek dosyalarına tıkladıktan sonra, ilgilenilen organizmanın klasörünü, miRNA klasörünü ve circBase metin dosyasını seçin ve indirin.</li>
		<li>Adım 4.1.3'te gerekli dosyaları indirdikten sonra, adım 4.1.1'de belirtilen dizinde support_files adında yeni bir dizin oluşturun. Ardından, sıkıştırılmış içeriği açın ve support_files dizinine ayıklayın.</li>
		<li>Samtools faidx komutunu kullanarak ilgili organizmanın referans genom dosyasını indeksleyin (Ek Dosya 1).</li>
		<li>Tablo 2'de gösterildiği gibi, sekmeyle ayrılmış bir BED dosyasındaki ilgili DE sirkRNA'larının koordinatlarından oluşan bir giriş dosyası hazırlayın. NOT: CIRIquant tarafından tahmin edilen sirkRNA'lar 0 tabanlı olmadığından, bunları BED formatına dönüştürmeden önce başlangıç koordinatında (adım 3.1.1'de belirtildiği gibi) eksi 1 bp olması gerekir. Tablo 2'de gösterilen başlıklar yalnızca referans amaçlıdır ve BED dosyalarında gerekli değildir.</li>
		<li>Bu noktada, Circr analizi için beklenen klasör ağacı yapısının Şekil 2'deki gibi olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Koşu Circr.py<ol><li>Python 3 kullanarak Circr.py yürütün ve bağımsız değişkenler olarak, circRNA giriş dosyasını, ilgili organizmanın FASTA genomunu, seçilen organizmanın genom sürümünü, iş parçacığı sayısını ve çıktı dosyasının adını komut satırında belirtin.</li>
		<li>İlgilenilen organizma adım 4.1.3'te listelenen sürücü klasöründe sağlanmamışsa veya kullanıcı analizi çalıştırmak için özel bir dosya kümesine sahip olmayı tercih ediyorsa, Circr.py yürütülürken bu dosyaların konumunu belirten ek komutların eklenmesi gerekir.</li>
		<li>Circr analizi tamamlandıktan sonra, program csv formatında bir circRNA-miRNA etkileşim dosyası çıkarır.</li>
		<li>SirkRNA-miRNA etkileşim sonuçlarını kullanıcıya özel tercihe göre filtreleyin. Bu çalışma için, tahminler aşağıdaki kriterlere göre Rstudio kullanılarak filtrelenir: -Her üç yazılım aracı tarafından da algılandı -Hem Targetscan hem de miRanda tarafından bildirilen iki veya daha fazla bağlama bölgesi -"AGO" veya "doğrulanmış" sütunlarında tanımlanır -Hiçbir tohum bölgesi etkileşimini filtreleme</li>
		<li>Adım 4.2.3'teki filtrelenmiş koşulları geçiren sirkRNA'ları circRNA_miRNA.txt adlı yeni bir metin dosyasına yazın. Bu tür filtreleme, tahmin edilen etkileşimlerin güvenilirliğini artırabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. CeRNA ağının inşası
NOT: Cytoscape'in nasıl kullanılacağına dair ayrıntılı bir kılavuz şu adreste bulunabilir: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ ve https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction
<ol><li>İndirme ve hazırlama<ol><li>Cytoscape38'in en son sürümünü şuradan indirin: https://cytoscape.org/download.html.</li>
		<li>Adım 5.1.1'de indirilen yükleyici sihirbazını çalıştırın ve Cytoscape yazılımı için dosya konumunu seçin.</li>
		<li>İlgilenilen sirkRNA'ları ve hedef miRNA'larını içeren sekmeyle ayrılmış bir dosya hazırlayın. İlk sütun circRNA adından oluşur; ikinci sütun, ilk sütundaki RNA tipini belirtir; üçüncü sütun hedef miRNA'dır; ve dördüncü sütun, üçüncü sütundaki RNA tipini belirtir. Dosyanın bir örneği Tablo 3'te gösterilmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>CeRNA ağ haritasının oluşturulması<ol><li>Adım 5.1.2'de yüklü olan Cytoscape yazılımını açın.</li>
		<li>Cytoscape'te, Dosya'ya gidin > Dosya'dan > Ağı İçe Aktar'a gidin. 5.1.3 adımında hazırlanmış olan dosyayı seçin.</li>
		<li>Yeni sekmede, birinci ve ikinci sütunu "Kaynak Düğüm" ve "Kaynak Düğüm Özniteliği" olarak seçerken, üçüncü ve dördüncü sütunu sırasıyla "Hedef Düğüm" ve "Hedef Düğüm Özniteliği" olarak seçin. Tamam'a tıklayın ve ağ Cytoscape'in sağ üst tarafında görünecektir.</li>
		<li>Ağın görsel stilini değiştirmek için, Cytoscape'in sol tarafındaki Stil düğmesine basın.</li>
		<li>Dolgu Rengi'nin sağ tarafındaki oka basın. Sütun için Tür'ü ve eşleme türü için Ayrık Eşleme'yi seçin. Ardından, RNA tiplerinin her biri için istenen rengi seçin.</li>
		<li>Rengi değiştirdikten sonra, Şekil'e gidip adım 5.2.5'i izleyerek düğümlerin şeklini değiştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Fonksiyonel zenginleştirme analizi
<ol><li>SirkRNA'ların ebeveyn geni için Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) analizi<ol><li>clusterProfiler 39,40 ve org'dan emin olun. Hs.eg.db Rstudio'ya 41 paket yüklendi. Kuruluş. Hs.eg.db41 paketi, yalnızca insanlar için genom çapında bir ek açıklama paketidir. İlgilenilen organizma başka bir türse, aşağıdakilere bakın: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb</li>
		<li>Adım 2.3.1'deki DE_circRNA bilgilerini Rstudio çalışma alanına aktarın.</li>
		<li>Sonraki adımlarda zenginleştirme analizi için bu dosyada sağlanan sirkRNA'ların ebeveyn genini kullanın. Bununla birlikte, kullanıcı gen sembolünü Entrez ID gibi diğer biçimlere dönüştürmek isterse, "bitr" gibi bir işlev kullanın.</li>
		<li>Gen kimliğini girdi olarak kullanarak, varsayılan parametreleri kullanarak clusterProfiler 39,40 paketindeki enrichGO işlevini kullanarak GO zenginleştirme analizini çalıştırın.</li>
		<li>Gen kimliğini girdi olarak kullanarak, varsayılan parametreleri kullanarak clusterProfiler39,40 paketindeki enrichKEGG işlevini kullanarak KEGG zenginleştirme analizini çalıştırın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu protokolün faydasını göstermek için, influenza A virüsü ile enfekte olmuş insan makrofaj hücrelerinden RNA-seq örnek olarak kullanılmıştır. Konakçı-patojen etkileşimlerinde potansiyel miRNA süngerleri olarak işlev gören sirkRNA'lar ve bir konakçı içinde GO ve KEGG fonksiyonel zenginleştirmeleri araştırıldı. Çevrimiçi olarak çeşitli sirkRNA araçları olmasına rağmen, her biri birbiriyle etkileşime girmeyen bağımsız bir pakettir. Burada, sirkRNA tahmini ve nicelleştirmesi, sirkRNA fonksiyonel zenginleştirme, sirkRNA-miRN...

Konakçı-patojen etkileşimleri, patojenler ve konakçı organizmalar arasındaki karmaşık bir etkileşimi temsil eder, bu da konakçıların doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini tetikler ve sonuçta istilacı patojenlerin uzaklaştırılmasıyla sonuçlanır 1,2. Patojenik enfeksiyonlar sırasında, konakçı immün genlerinin çoğu, patojenlerin replikasyonunu ve salınımını inhibe etmek için düzenlenir. Örneğin, patojenik enfeksiyonlar üzerinde düzenlenen yaygın interferon ile uyarılmış genler (ISG'ler) ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I ve OASL 3,4'ü içerir. Protein kodlayan genlerin yanı sıra, çalışmalar ayrıca uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), mikroRNA'lar (miRNA'lar) ve dairesel RNA'lar (sirkRNA'lar) gibi kodlamayan RNA'ların da rol oynadığını ve patojenik enfeksiyonlar sırasında eşzamanlı olarak düzenlendiğini bildirmiştir 5,6,7. Proteinleri esas olarak fonksiyonel moleküller olarak kodlayan protein kodlayan genlerin aksine, kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası seviyelerde genlerin düzenleyicileri olarak işlev gördüğü bilinmektedir. Bununla birlikte, kodlamayan RNA'ların, özellikle sirkRNA'ların, konakçıların bağışıklık genlerini düzenlemeye katılımını içeren çalışmalar, protein kodlayan genlere kıyasla iyi rapor edilmemiştir.
SirkRNA'lar, geri ekleme8 adı verilen kanonik olmayan bir ekleme işlemi ile üretilen kovalent kapalı sürekli döngü yapıları ile yaygın olarak karakterize edilir. Geri ekleme işlemi, konyak lineer RNA'ların ekleme işleminden farklı olarak, aşağı akış donör bölgesinin yukarı akış alıcı bölgesine bağlanmasını ve dairesel şekilli bir yapı oluşturmasını içerir. Şu anda, sirkRNA'ların biyogenezi için üç farklı geri ekleme mekanizması önerilmiştir. Bunlar RNA bağlayıcı protein (RBP) aracılı daireselleştirme 9,10, intron eşleştirme güdümlü daireselleştirme 11 ve lariat güdümlü daireselleştirme12,13,14'tür. SirkRNA'ların dairesel bir yapıda uçtan uca bağlandığı göz önüne alındığında, normal ekzonükleaz sindirimlerine karşı doğal olarak dirençli olma eğilimindedirler ve bu nedenle doğrusal muadillerinden daha kararlı oldukları düşünülmektedir15. SirkRNA'lar tarafından sergilenen bir diğer ortak özellik, konakçılardaki hücre veya doku tipine özgü ekspresyonu içerir16.
Benzersiz yapıları ve hücre veya dokuya özgü ekspresyonları ile ima edildiği gibi, sirkRNA'ların hücrelerde önemli biyolojik işlevler oynadığı keşfedilmiştir. Bugüne kadar, sirkRNA'ların öne çıkan işlevlerinden biri, mikroRNA (miRNA) süngerleri olarak rolleridir17,18. SirkRNA'ların bu düzenleyici rolü, sirkRNA nükleotidlerinin miRNA'ların tohum bölgesi ile tamamlayıcı bağlanmasıyla gerçekleşir. Böyle bir sirkRNA-miRNA etkileşimi, miRNA'ların hedef mRNA'lar üzerindeki normal düzenleyici fonksiyonlarını inhibe eder, böylece19,20 genlerinin ekspresyonunu düzenler. Ek olarak, sirkRNA'ların, RNA bağlayıcı proteinlerle (RBP'ler) etkileşime girerek ve RNA-protein kompleksleri21'i oluşturarak gen ekspresyonunu düzenlediği de bilinmektedir. Her ne kadar sirkRNA'lar kodlamayan RNA'lar olarak sınıflandırılsa da, sirkRNA'ların protein translasyonu için şablon görevi görebileceğine dair kanıtlar da vardır22,23,24.
Son zamanlarda, sirkRNA'ların, özellikle konakçılar ve virüsler arasında, konakçı-patojen etkileşimlerinin düzenlenmesinde önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Genel olarak, konakçı sirkRNA'ların, istilacı patojenleri ortadan kaldırmak için konağın bağışıklık tepkilerini düzenlemeye yardımcı olduğu varsayılır. Konakçı bağışıklık tepkilerini destekleyen bir sirkRNA örneği, Guo ve ark.25 tarafından bildirilen circRNA_0082633'dir. Bu sirkRNA, A549 hücreleri içindeki tip I interferon (IFN) sinyallemesini arttırır ve bu da influenza virüsü replikasyonunu baskılamaya yardımcı olur25. Dahası, Qu ve ark. ayrıca, IFN-β 26,27'nin bir sinyal dönüştürücüsü olan CREB-bağlayıcı proteinin (CREBBP) ekspresyonunu düzenleyerek bağışıklığı teşvik eden sirkRNA AIVR adı verilen bir insan intronik sirkRNA'sını da bildirmiştir. Bununla birlikte, enfeksiyon üzerine hastalığın patogenezini desteklediği bilinen sirkRNA'lar da mevcuttur. Örneğin, Yu ve ark. yakın zamanda, konakçı hücre otofajisi28'in inhibisyonu yoluyla H1N1 virüs replikasyonunu teşvik etmede 2A genini (circGATAD2A) içeren GATA çinko parmak alanından eklenmiş bir sirkRNA'nın oynadığı rolü bildirmiştir.
SirkRNA'ları etkili bir şekilde incelemek için, genellikle genom çapında bir sirkRNA tahmin algoritması uygulanır, ardından herhangi bir fonksiyonel çalışma yapılmadan önce tahmin edilen sirkRNA adaylarının in silico karakterizasyonu yapılır. SirkRNA'ları tahmin etmek ve karakterize etmek için böyle bir biyoinformatik yaklaşım daha az maliyetli ve daha fazla zaman verimlidir. İşlevsel olarak incelenecek aday sayısını iyileştirmeye yardımcı olur ve potansiyel olarak yeni bulgulara yol açabilir. Burada, konakçı-patojen etkileşimleri sırasında sirkRNA'ların in silico tanımlaması, karakterizasyonu ve fonksiyonel ek açıklaması için ayrıntılı bir biyoinformatik tabanlı protokol sunuyoruz. Protokol, RNA dizileme veri kümelerinden sirkRNA'ların tanımlanması ve nicelleştirilmesini, circBase aracılığıyla ek açıklama yapılmasını ve sirkRNA adaylarının sirkRNA tipleri, örtüşen genlerin sayısı ve öngörülen sirkRNA-miRNA etkileşimleri açısından karakterizasyonunu içerir. Bu çalışma aynı zamanda Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizi yoluyla sirkRNA ebeveyn genlerinin fonksiyonel ek açıklamasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>Bedtools</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/arq5x/bedtools2/</td> <td>Bölüm 4.1.2'ye atıfta bulunarak. Circr için gerekli.</td></tr><tr><td>BWA</td><td>Burrows-Wheeler Hizalayıcı</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td> <td>Bölüm 2.1.1 ve 2.1.2'ye atıfta bulunarak. CIRIquant'ı çalıştırmak ve genomu indekslemek için</td></tr><tr><td>gereklidir Circr</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bicciatolab/Circr</td><td>Bölüm 4'e atıfta bulunarak. miRNA bağlanma bölgelerini tahmin etmek için kullanın</td></tr><tr><td>CIRIquant</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant</td><td>Bölüm 2.1.3'e atıfta bulunarak. CircRNA'ları tahmin etmek için</td></tr><tr><td>Clusterprofiler</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler</td><td>Bölüm 7'ye atıfta bulunarak. GO ve KEGG fonksiyonel zenginleştirme</td></tr><tr><td>CPU</td><td>Intel</td><td>&nbsp; Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz&nbsp; &nbsp; Çekirdekler: 6 çekirdekli CPU Bellek: 65 GB Ekran kartı: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)&nbsp;</td><td>Bu protokolün tamamını çalıştırmak için kullanılan özellikler.</td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>Cytoscape</td><td>https://cytoscape.org/download.html</td><td>Bölüm 5.2'ye atıfta bulunarak. CeRNA ağını planlamak için gerekli</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>Babraham Bioinformatics</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td> <td>Bölüm 1.2.1'e atıfta bulunarak. Fastq dosyalarında kalite kontrolü</td></tr><tr><td>HISAT2</td><td></td><td>http://daehwankimlab.github.io/hisat2/</td> <td>Bölüm 2.1.1 ve 2.1.2'ye atıfta bulunarak. CIRIquant'ı çalıştırmak ve Linux</td></tr><tr><td></td><td>Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)</td> genomunu indekslemek için gereklidir <td>https://releases.ubuntu.com/focal/</td> <td>Tüm protokolü çalıştırmak için gereklidir. Diğer Ubuntu sürümleri, protokolü yürütmek için hala geçerli olabilir.</td></tr><tr><td>miRanda</td><td></td><td>http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do</td><td>Bölüm 4.1.2'ye atıfta bulunarak. Circr</td></tr><tr><td>Pybedtools</td><td>için gereklidir pybedtools 0.8.2</td><td>https://pypi.org/project/pybedtools/</td> <td>BED dosyası genomik manipülasyonu Python</td></tr><tr><td></td><td>Python 2.7 ve 3.6 veya abover</td> için gereklidir <td>https://www.python.org/downloads/</td> <td>Gerekli kütüphane modüllerini çalıştırmak için</td></tr><tr><td>R</td><td>Kapsamlı R Arşiv Ağı</td><td>https://cran.r-project.org/</td> <td>Veri çerçevelerini</td></tr><tr><td>RNAhybrid</td> işlemek için<td>BiBiServ</td><td>https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid</td><td>Bölüm 4.1.2'ye atıfta bulunarak. Circr</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>RStudio</td><td>için gereklidir https://www.rstudio.com/ R samtools'u</td> <td>çalıştırmak için bir çalışma alanı</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>SAMtools</td><td>http://www.htslib.org/</td> <td>Bölüm 2.1.2'ye atıfta bulunarak. CIRIquant StringTie'yi çalıştırmak için gereklidir</td></tr><tr><td></td><td>Johns Hopkins Üniversitesi: Hesaplamalı Biyoloji Merkezi</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml</td><td>Bölüm 2.1.2'ye atıfta bulunarak. CIRIquant TargetScan GitHub'ı çalıştırmak için gereklidir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>https://github.com/nsoranzo/targetscan</td><td>Bölüm 4.1.2'ye atıfta bulunarak. Circr için gerekli</td></tr></tbody></table>

burada: silico konakçı-patojen etkileşimleri sırasında sirkrna'ların tanımlanması ve karakterizasyonu

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Dairesel RNA'lar (sirkRNA'lar), geri ekleme yoluyla oluşturulan kodlamayan RNA'ların bir sınıfıdır. Bu sirkRNA'lar ağırlıklı olarak çeşitli biyolojik süreçlerin düzenleyicileri olarak rolleri için incelenmiştir. Özellikle, ortaya çıkan kanıtlar, konakçı sirkRNA'ların patojenlerle (örneğin, influenza ve koronavirüsler) enfeksiyon üzerine farklı şekilde eksprese edilebileceğini (DE) göstermektedir, bu da sirkRNA'ların konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini düzenlemede bir rol oynadığını düşündürmektedir. Bununla birlikte, patojenik enfeksiyonlar sırasında sirkRNA'ların rolü üzerine yapılan araştırmalar, RNA dizileme (RNA-seq) verilerinden DE sirkRNA'larını tanımlamak için gerekli biyoinformatik analizi yapmak için gerekli bilgi ve becerilerle sınırlıdır. Biyoinformatik tahmin ve sirkRNA'ların tanımlanması, herhangi bir doğrulamadan önce ve maliyetli ve zaman alıcı ıslak laboratuvar tekniklerini kullanan fonksiyonel çalışmalardan önce çok önemlidir. Bu sorunu çözmek için, RNA-seq verilerini kullanarak sirkRNA'ların in silico tahmini ve karakterizasyonunun adım adım bir protokolü verilmiştir. Protokol dört adıma ayrılabilir: 1) CIRIquant boru hattı aracılığıyla DE sirkRNA'larının tahmini ve nicelleştirilmesi; 2) circBase yoluyla ek açıklama ve DE sirkRNA'larının karakterizasyonu; 3) Circr boru hattı üzerinden CircRNA-miRNA etkileşim tahmini; 4) Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) kullanılarak sirkRNA ebeveyn genlerinin fonksiyonel zenginleştirme analizi. Bu boru hattı, sirkRNA'ların konakçı-patojen etkileşimlerindeki rolünü daha da çözmek için gelecekteki in vitro ve in vivo araştırmaları yönlendirmede yararlı olacaktır.

Önceki bölümde listelenen protokol, Linux OS sistemine uyacak şekilde değiştirilmiş ve yapılandırılmıştır. Bunun temel nedeni, sirkRNA'ların analizinde yer alan çoğu modül kütüphanesinin ve paketinin yalnızca Linux platformunda çalışabilmesidir. Bu analizde, Influenza A virüsü ile enfekte olmuş insan makrofaj hücrelerinden hazırlanan tanımlanmamış ribozomal RNA (rRNA) tükenmiş RNA-seq kütüphanesi veri setleri, GEOveritabanı 42'den indirildi ve temsili sonuçları üretmek için kullanıldı.
<p clas...

Burada sunulan protokol, konakçı-patojen etkileşimlerini inceleyen RNA dizileme transkriptom verilerinden sirkRNA'ları tahmin etmek ve işlevsel olarak karakterize etmek için gereken in silico boru hattının tamamını açıklamaktadır.

Burada: Silico Konakçı-Patojen Etkileşimleri Sırasında SirkRNA'ların Tanımlanması ve Karakterizasyonu

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...

Dairesel RNA'lar farklı biyolojik süreçlerde önemli düzenleyici roller oynar. Bu protokol, konakçı ve patojen etkileşimleri alanında dairesel RNA analizi yapmak için yeni başlayanlar için uygundur. Burada, güvenli RNA tahmini ve nicelleştirmesi, güvenli RNA fonksiyonel zenginleştirme, güvenli RNA, mikro-RNA etkileşim tahmini ve CCE RNA ağ yapıları için gerekli olan aerodinamik bir protokol oluşturan araçlardan birkaçını bir araya getirdik.Bu kolaylaştırıcı protokol, konakçı ve patojen etkileşim ortamında belirli adayları, tanısal ve prognostik değerleri tanımlamak için klinik örneklere uygulanabilir. Önceden programlama bilgisi olmayanların bu tekniğin ilk aşamasını yapmakta zorlanmalarını bekliyorum. Bu nedenle, bu teknikte kullanılan programlama dillerinin temellerini öğrenmenizi tavsiye ederim.Genellikle programlama dilinin nasıl uygulandığına bakmanın, tek başına okumaya kıyasla daha bilgilendirici ve anlaşılması daha kolay olduğuna inanıyorum. Başlamak için bir Linux terminali açın ve ana bilgisayarın referans genomunun dizininde, genomu indekslemek için bwa index ve hisat2-build komutlarını çalıştırın. Dosyanın adını, araçların yolunu, indirilen başvuru dosyalarının yolunu ve dizin dosyalarının yolunu içeren bir yml yapılandırma dosyası hazırlayın.RNA dizisi verilerinin kütüphane türünü belirtin ve varsayılan veya manuel parametreleri kullanarak Ciriquant aracını çalıştırın. RNA dizisi verilerinin kimliklerini, Ciriquant tarafından çıkarılan GTF dosyalarının yolunu ve RNA dizisi verilerinin bir kontrol veya tedavi edilen bir grup olup olmadığını gruplandırmasını içeren bir veri listesi içeren bir metin dosyası hazırlayın. Linux terminalinde, prep_Ciriquant giriş olarak hazırlanmış bir metin dosyasıyla çalıştırın.Bu çalıştırma bir dosya listesi oluşturur. RNA dizi kimliklerini ve bunların ilgili dize bağı çıktısının yolunu içeren bir veri listesi içeren ikinci bir metin dosyası hazırlayın. Dosya düzeni, gruplandırma sütunu çalıştırılmadan önceden hazırlanmış metin dosyasına benzer olmalıdır.prepde'yi çalıştırın. py gen sayısı matris dosyalarını oluşturmak için bir girdi olarak bu metin dosyası ile. library_info ile Ciri_DE_Replicate yürütün.csv, circRNA_BSJ. csv ve gene_count_matrix. CSV dosyalarını son circRNA_DE çıktısı almak için giriş olarak.tsv dosyası. Diferansiyel olarak eksprese edilen veya DE, sirkRNA'ların sayısını filtrelemek ve belirlemek için circRNA_DE açın. R veya başka bir elektronik tablo yazılımı içeren tsv dosyası.WinRar veya 7-Zip gibi ilgili yazılımı kullanarak CircR GitHub sayfasından indirdikten sonra CircR dosyasının içeriğini açın ve ayıklayın. Analizin yapılacağı yeni bir dizine. Ardından, circRNA miRNA analizini yapmadan önce SAMTools, miRanda, RNAhybrid ve Pybedtools gibi önkoşul yazılım uygulamalarını yükleyin.SAMtools FAIDX komutunu kullanarak ilgili organizmanın referans genom dosyasını indeksleyin ve sekmeyle ayrılmış bir yatak dosyasında ilgilenilen DE sirkRNA'larının koordinatlarından oluşan bir giriş dosyası hazırlayın. Ardından, Circr'yi çalıştırın. Python3 kullanarak py.Ve argümanlar sirkRNA giriş dosyasını, ilgilenilen organizmanın daha hızlı genomunu, seçilen organizmanın genom versiyonunu, iş parçacığı sayısını ve komut satırındaki çıktı dosyasının adını belirttiğinden. Circr analizi tamamlandıktan sonra, program CSV formatında bir circRNA-miRNA etkileşim dosyası çıkarır. İlgilenilen sirkRNA'ları ve hedef miRNA'larını içeren sekmeyle ayrılmış bir dosya hazırlayın.İlk sütun circRNA adından oluşur. İkinci sütun, ilk sütundaki RNA tipini belirtir. Üçüncü sütun hedef miRNA'dır.Ve dördüncü sütun, üçüncü sütundaki RNA tipini belirtir. CeRNA ağ haritasını oluşturmak için Cytoscape yazılımını açın, dosyaya gidin, dosyadan içe aktarın, ağ oluşturun, hazırlanan dosyayı seçin ve yükleyin. Ağın görsel stilini değiştirmek için stil düğmesine basın.Ardından dolgu renginin sağ tarafındaki oka basın, sütun için türü, eşleme türü için ayrık eşlemeyi seçin ve her RNA türü için istenen rengi seçin. Bundan sonra, düğümlerin şeklini değiştirmek için şekle gidin ve daha önce gösterilen adımları izleyin. Gen ontolojisi ve sirkRNA'ların ebeveyn geninin KEGG analizi için, küme profilleyicisini ve orgunu sağlayın. Hs.eg.DB paketleri stüdyomuza kuruldu. DE circRNA bilgilerini R studio çalışma alanına aktarın. Kullanıcı ebeveyn gen adlarını entrezid gibi diğer biçimlere dönüştürmek isterse, teklif veren gibi bir işlev kullanın.Gen kimliğini girdi olarak kullanın ve varsayılan parametreleri kullanarak küme profili veya paketi içindeki enrichGO işlevini kullanarak gen ontolojisini ve zenginleştirme analizini çalıştırın. Son olarak, girdi olarak gen kimliğini ve küme profil oluşturucu paketi içindeki enrichKEGG işlevini kullanarak KEGG zenginleştirme analizini çalıştırın. DE sirkRNA ebeveyn genlerinin gen ontolojisi zenginleştirme analizinin kabarcık grafiği bu şekilde gösterilmiştir.X eksenindeki gen oranı, belirli bir gen ontolojisi terimiyle ilişkili giriş listesindeki genlerin sayısının, o terimdeki toplam gen sayısına bölünmesiyle elde edilir. Grafikteki nokta boyutu, belirli bir gen ontolojisi terimiyle ilişkili giriş listesindeki genlerin sayısı olan sayı değeri ile temsil edilir. Noktaların boyutu ne kadar büyük olursa, terimle ilişkili giriş genlerinin sayısı da o kadar büyük olur.Grafikteki noktalar, bir ek açıklama teriminin gözlemlenen sıklığı ile tesadüfen beklenen frekans karşılaştırılarak hesaplanan pvalue'ya göre renk kodludur. Zenginleştirme istatistiksel olarak anlamlıdır ve kabarcık grafiğinde yalnızca pvalue 0,01'den küçükse çizilir. Burada, biyolojik süreçler için ilk üç zenginleştirme, ribonükleoprotein kompleksi biyogenezi, virüse verilen cevabı ve biyotik bir uyarana verilen cevabın düzenlenmesini içerir.Moleküler fonksiyonlar için, sadece RNA ve tek sarmallı RNA bağlanması üzerinde etkili olan katalitik aktivite istatistiksel olarak zenginleştirilir. Hücresel bileşenler için, sadece retromer kompleksi istatistiksel olarak zenginleştirilir. Bu temsili görüntü, bir kabarcık grafiğinde DE circRNA ebeveyn genlerinin KEGG zenginleştirme analizini göstermektedir.Bu durumda sadece iki KEGG terimi zenginleştirilmiştir, influenza A ve viral yaşam döngüsü yolları. Bu prosedürü denerken en önemli şeylerden biri, yaralanma sırasında kullandığınız RNA sirk veri kümesinin doğru özellik tipini sağlamaktır. Burada sağlanan biyo-formatik boru hattı, potansiyel seküler RNA'ların ve fonksiyonel ek açıklamaların tahmin edilmesine yardımcı olur.Bununla birlikte, sağlam kanıtlar sağlamak için iyi yönlendirilmiş doğrulamaya hala ihtiyaç duyulacaktır. Bu protokol, araştırmacıların güvenli RNA'yı ve daha fazla çalışabilecekleri farklı kodlar ve patojen etkileşimlerindeki potansiyel fonksiyonel rollerini keşfetmelerini sağlayacaktır.

in-silico-identification-characterization-circrnas-during-host

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

Bu makalede, ev sahibi ve iki dik yöntemleri bir arada kullanarak patojen proteinler arasında yüksek güvenen etkileşim veri setlerinin belirlenmesi üzerinde duruluyor: maya iki hibrit HT-GPCA adı verilen memeli hücrelerinde yüksek verimli bir etkileşim yöntemi ile izledi.

Ana-Patojen protein-protein etkileşimleri ve Peyzaj karakterize etmek Karşılaştırmalı Bir Yaklaşım

Bir enfeksiyon sırasında patojen gen ekspresyon profili oluşturmak için hızlı, hassas ve tekrarlanabilir bir protokol geliştirdik.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Biz faktörler ana bilgisayar kodlama faaliyetlerini analiz için kullanılan her iki tüp bebek ve içinde vivo enfeksiyonu deneyleri tarif.

Bakteriyel Pathogen sonda için hücresel ve Organismic düzeyi ana bilgisayar yanıt için kullanma

Dairesel RNA'lar (circRNA'lar), transkripsiyonel düzenlemede ve proteinler arasındaki iletişimlerde rol alabilecek kodlamayan RNA'lardır. CircRNA sıralama kütüphanelerinin inşası için farklı parametrelerin değerlendirilmesinin ardından, RNase R ön arıtma ile mahsur kalan toplam RNA kitaplığı hazırlığı kullanılarak bir protokol derlenmiş ve burada sunulmuştur.

RNA Sıralaması Kullanılarak Dairesel RNA'ların Tanımlanması

Burada, kitle spektrometresi bazlı proteomik enfeksiyon sırasında konak ve patojen arasındaki etkileşimin profilini çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, tek bir deneyde hem konakçının (örneğin, makrofajlar) hem de patojenin (örneğin Cryptococcus neoformans)protein bolluğundaki değişiklikleri ölçmek için etiketsiz niceleme kullanır.

Keşif Odaklı Konak-Patojen Etkileşimleri için Etiketsiz Nicel Proteomik İş Akışı

Burada sunulan protokol, RNA dizilimi transkriptom verilerini ham okumalardan fonksiyonel analize analiz etmek için kalite kontrolü ve gelişmiş istatistiksel analitik yaklaşımlara yönelik ön işleme adımları da dahil olmak üzere eksiksiz bir işlem hattını açıklar.

Konak-Patojen Etkileşimlerini Araştırmak için Yüksek Verimli Transkriptom Analizi

Otomatik istatistiksel analiz yöntemleri ile birlikte yüksek verimli floresan etiketleme görüntüleme kullanılarak fenotipik yapışma esas alınarak konak-bakteriyel patojen etkileşimlerinin tespiti, konak hücrelerle potansiyel bakteriyel etkileşimlerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Konak Hücrelere Bakteriyel Yapışmanın Otomatik, Yüksek Verimli Tespiti

Hücre dışı bakteriler ve Orsay virüsü ve mikrosporidia (mantarlar) gibi hücre içi patojenler de dahil olmak üzere bağırsak mikropları genellikle vahşi Caenorhabditis nematodları ile ilişkilidir. Bu makalede, C. elegans nematodlarını kolonize eden ve/veya enfekte eden mikropların tespiti ve nicelleştirilmesi ve laboratuvarda kontrollü enfeksiyonlardan sonra patojen yükünün ölçülmesi için bir protokol sunulmaktadır.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarında Mikrobiyal Kolonizasyon ve Enfeksiyonu Görselleştirmek için RNA Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Enteroidler, doku fizyolojisi ve patofizyolojisi, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp çalışmaları için yeni bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, ilgili doku hücresi tipleriyle ko-kültüre izin veren bir sığır birincil hücre 2D enteroid türevi kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu model, gastrointestinal araştırma modellemesi için translasyonel bir avantaj sunar.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Keşfedin, konakçı-patojen etkileşimlerinde sirkRNA'ların in silico analizi için biyoinformatik araçlarla kapsamlı bir pipeline. Başlangıç seviyesindeki araştırmacılar için RNA dizileme verilerinden fonksiyonel zenginleştirme ve klinik aday belirleme yöntemlerini öğrenin.

Burada: Silico Konakçı-Patojen Etkileşimleri Sırasında SirkRNA'ların Tanımlanması ve Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet