Name: Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Öğrenin, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofaj izolasyonu ve kültürü yöntemini. Bu teknik, tek bir hayvandan yaklaşık 2 x 10^7 hücre elde ederek immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarına güvenilir bir temel sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) ve Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16) ve Brezilya Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.

Bu protokol, Hayvan Deneylerinin Kontrolü Ulusal Konseyi'ne (Concea) uygun olarak ve Hayvanların Etik ve Kullanımı Komitesi'nin (CEUA) onayı ile gerçekleştirilmiştir. C57BL/6 fareleri, Brezilya'nın Belo Horizonte kentindeki Minas Gerais Federal Üniversitesi'nin (UFMG) Biotério Central'ından satın alındı. Laboratuvar önlükleri, eldivenler ve göz koruması gibi kişisel koruyucu ekipman (KKD) bu protokolde açıklanan tüm adımlarda kullanılmalıdır.
1. M-CSF kaynağı olarak fibroblast L-929 soy süpernatantının hazırlanması
<ol><li>L-929 fibroblast soy hücrelerinin (Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu Sertifikalı Hücre Hattı-ATCC CCL1) defrostunu çözün ve canlılığı korumak için kültür işlemine hemen başlayın.</li>
	<li>Laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde, 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak, L-929 fibroblast soy hücrelerini flakondan 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 50 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) eklemek için serolojik bir pipet kullanın.</li>
	<li>300 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Pelet, serolojik bir pipet kullanarak% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mL penisilin / streptomisin (P / S) (DMEM / F12-10) ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın orta-F12'sinin 20 mL'sinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş hücreleri bir T75 hücre kültürü şişesine aktarın.</li>
	<li>37 °C,% 5 CO2 inkübatörde tam birleşene kadar inkübe edin. NOT: Şişeyi manipüle ederken, bir kontaminasyon kaynağı olabileceğinden, kapağı solüsyonla ıslatmaktan kaçınmaya dikkat edin. Uygun miktarda süpernatan elde etmek için, hücrelerin hücre kültürü şişesinin tüm yüzeyini kapladıktan sonra çoğaltılması gerekir. L-929 hücreleri temas ile inhibe edilir. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi hücre kültürü genişlemesini başlatmak için tripsin/etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi, DMEM/F12-10 ve steril PBS'yi 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>Tam birleşmeye ulaşıldığında, süpernatanı laminer akış biyogüvenlik kabininin içindeki hücre kültürü şişesinden atın.</li>
	<li>Hücre kültürü şişesini serolojik bir pipet kullanarak 20 mL steril PBS ile yıkayın ve çözeltiyi atın.</li>
	<li>Yapışan hücreleri içeren hücre kültürü şişesine 10 mL tripsin / EDTA (% 0.05 çözelti) ekleyin.</li>
	<li>Hücre kültürü şişesini laminer akıştan 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöre aktarın ve 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri kültür şişesinin yüzeyinden ayırmak için hücre kültürü şişesini sallayın ve tüm hücrelerin ayrıştığından emin olmak için bir mikroskop kullanın.</li>
	<li>Tripsin / EDTA'yı (% 0.05 çözelti) 10 mL DMEM / F12-10 ortamı ile etkisiz hale getirin.</li>
	<li>Çözeltiyi serolojik bir pipet kullanarak 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>300 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Peletleri 10 mL DMEM / F12-10 ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir T175 hücre kültürü şişesine (1:10 kültür) 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin.</li>
	<li>On adet T175 hücre kültürü şişesi elde etmek için prosedürü tekrarlayın.</li>
	<li>Her hücre kültürü şişesine 50 mL DMEM / F12-10 ekleyin.</li>
	<li>37 °C,% 5 CO2 inkübatörde tam birleşene kadar inkübe edin. NOT: Bu adımlar 500 mL L-929 hücre süpernatantını garanti eder. 5. günde, hücreler T175 hücre kültürü şişesi yüzeyini kapladıktan sonra, süpernatant M-CSF için zenginleştirilecek ve toplanmalıdır14.</li>
	<li>Temas inhibisyonundan sonraki 5. günde hücre kültürü şişesini inkübatörden çıkarın.</li>
	<li>Ortamı 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>3.200 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>M-CSF ile zenginleştirilmiş süpernatanı toplayın ve çözeltiyi 50 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarın. Dondurucuda -20 °C'de saklayın. NOT: Santrifüjleme, süpernatantlardan hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için son derece önemlidir.</li>
	<li>L-929 süpernatant, uygun ve ucuz bir makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağıdır ve tipik olarak 5 ila 10 ng / mL M-CSF8 içerir. Bu süpernatanlar ayrıca eser miktarda diğer sitokinler ve büyüme faktörleri içerir, ancak makrofaj fizyolojisi üzerinde derin bir etki yapmazlar15. Bununla birlikte, saflaştırılmış M-CSF satın alınabilir ve 1 ila 2 ng/mL8 konsantrasyonlarında L-929 süpernatantlarına alternatif olarak kullanılabilir.</li>
</ol>2. Femur ve tibianın çıkarılması
<ol><li>Ulusal Hayvan Deneyleri Konseyi'nin (Concea) 18 numaralı normatif kararına uygun olarak ve Hayvanların Etik ve Kullanımı Komitesi'nin (CEUA) onayı ile karbondioksit boğulmasından sonra servikal çıkık yoluyla 8 haftalık, C57BL-6 vahşi tip erkek fare ötenazisi ile devam edin.</li>
	<li>Fareyi% 70 etanol çözeltisi ile ıslatın ve karın boyunca 1 cm'lik bir kesi yapmak için steril makas kullanın.</li>
	<li>Arka bacakların kası tamamen açığa çıkana kadar cildi çıkarın.</li>
	<li>Femur ve kaval kemiğini kırmamaya dikkat ederek arka bacakları kalça yüksekliğinde çıkarın.</li>
	<li>Arka bacakları% 70 etanol çözeltisi içeren konik bir santrifüj tüpüne koyun. NOT: Daima patojen içermeyen fareler kullanın. Daha fazla sayıda hücre elde etmek için her iki bacağınızı da topladığınızdan emin olun. Adım 2, steril olmayan bir ortamda (tezgah üstü) gerçekleştirilir. Bu nedenle, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için uyluk kemiği ve kaval kemiğinin sağlam kalması için dikkatli bir şekilde çıkarılması önemlidir. Bu prosedürün geri kalan adımları, laminer akışlı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Bacakların% 70 etanol çözeltisine maruz kalma süresi 10 dakika ile sınırlandırılmalıdır. Süre uzarsa, kemik iliği progenitörleri etkilenebilir.</li>
</ol>3. Tibia ve uyluk kemiğinin lümeninden kemik iliği progenitörleri elde edin
<ol><li>Bacakları% 70 etanol çözeltisinden çıkarın ve steril PBS'ye aktarın.</li>
	<li>Tüm kas ve fasyayı çıkarmak için forseps ve dezenfektan mendil kullanmak. Bu adımdan sonra kemiğin temiz olması gerekir.</li>
	<li>Kemik iliğini ortaya çıkarmak için her iki uçtaki kemik epifizini kesmek için steril bir cerrahi neşter bıçağı kullanın.</li>
	<li>20 mL'lik bir şırıngayı% 2 penisilin / streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş 10 mL steril PBS ile doldurun ve 26 G'lik bir iğne bağlayın.</li>
	<li>Bir elinizle anatomik diseksiyon forsepsleri kullanarak kemiği tutun ve diğer elinizle iğneyi kemik boşluğuna sokmak için kullanın. Forseps ile kemiği ezmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Kemiğin içini PBS ile yıkayın ve kemik iliğini steril bir konik santrifüj tüpünde toplayın. Bu adımdan sonra kemik boşluğu beyaz görünmelidir.</li>
	<li>Toplanan hücreleri 4 ° C'de 300 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL DMEM / F12-10 içinde yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri toplam 10 mL'ye çıkarmak için homojenize edin ve 9 mL daha DMEM / F12-10 ortamı ekleyin.</li>
</ol>4. Makrofaj kültürü
<ol><li>100 mm x 20 mm'lik yuvarlak plastik Petri kaplarının her birine (toplam 10 tabak) 1 mL hücre progenitörleri ekleyin ve homojen bir dağılım elde etmek için hücreleri bir pipetle plakalara yayın. Doku kültürü uygulanmış tabakları kullanmayın.</li>
	<li>Her yemeğe %20 L-929 hücre süpernatanı ile takviye edilmiş 9 mL DMEM / F12-10 ekleyin.</li>
	<li>37 °C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.</li>
	<li>3. günde , her yemeğe L-929 hücrelerinin süpernatanının% 20'si ile takviye edilmiş 10 mL DMEM / F12-10 ortamı ekleyin. Bu şekilde, kültür kapları artık olgunlaşmalarının sonuna kadar hücrelerin büyümesi için yeterli olan toplam 20 mL kültür ortamına sahiptir. NOTLAR: Doku kültürü ile muamele edilmiş kaplar kullanılmamalıdır, çünkü yüzeylerle güçlü etkileşimlerle işaretlenmiş doğal yapışkan hücreler olan makrofajlar daha sonra tabaktan kolayca ayrılmayacaktır. Genellikle, bir fareden (iki uyluk kemiği) alınan hücre progenitörleri 10 kültür kabına tohumlanabilir. Hücre progenitörleri, kuluçka günü 7'den 10'a kadar kullanılabilen makrofajlara dönüşecektir. Olgunlaşma onayı, makrofajların morfolojisindeki değişikliklerle tanımlanır. Olgun makrofajlar yapışıktır ve farklı yönlerde psödopodia emisyonu ile açıklanan heterojen morfoloji gösterir. Bu olgun hücrelerin örnekleri temsili sonuçlarda gösterilmiştir.</li>
</ol>5. Makrofajların toplanması
<ol><li>Süpernatanları tüm kültür kaplarından atın.</li>
	<li>Her kültür kabını 10 mL ılık (37 °C) steril Mg2+ ve Ca2+ serbest PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Çözeltiyi her tabaktan atın.</li>
	<li>Enzimatik olmayan hücre ayrışma solüsyonunu 37 °C'ye ısıtın ve her yemeğe 3 mL ekleyin. 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde 10 dakika inkübe edin. Makrofajların kültür kaplarından ayrılıp ayrılmadığını görselleştirmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. NOT: Doku kültürü ile muamele edilmemiş plastik plakaların kullanılması, hücrelerin kolayca ayrışmasına izin vermeli ve hücrelerin plakadan kazınması ihtiyacını ortadan kaldırmalıdır.</li>
	<li>Bulaşıkları serolojik bir pipet kullanarak enzimatik olmayan hücre ayrışma solüsyonu ile tekrar tekrar yıkayın ve tüm makrofajların tabaktan ayrıldığını doğrulamak için dairesel hareketler gerçekleştirin.</li>
	<li>Tüm kültür kaplarının çözeltisini konik 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.</li>
	<li>Boş kültür kaplarına 10 mL steril önceden ısıtılmış PBS ekleyin ve adım 5.4'teki gibi ilerleyin. Bu prosedür adım 5.4'ün bir tekrarıdır ve tüm makrofajların toplanmasını garanti etmeyi amaçlar.</li>
	<li>300 x g'da, 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve peleti 1 mL DMEM / F12-10 ile yeniden süspanse edin. Hücrelere zarar vermemek için pipeti kullanarak yavaş ve dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı homojenize edin.</li>
	<li>Hemositometreyi kullanarak hücreleri saymak için 10 μL Tripan Mavisi ile seyreltilmiş 10 μL makrofaj çözeltisinden oluşan bir alikot hazırlayın. NOT: 7. günde, her çanak yaklaşık 2 x 106 makrofaj üretecektir. Bu, bir farenin on plakada hasat edildiğinde yaklaşık 2 x 107 birincil makrofaj üretebileceği anlamına gelir. M-CSF sadece makrofajların olgunlaşmasını sağladığından, prosedür esasen sadece makrofajlardan oluşan ve diğer kirletici lökositlerden arınmış bir hücre popülasyonunu garanti eder16.</li>
</ol>

<ol><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>van Furth, R., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+kinetics+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The origin and kinetics of mononuclear phagocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).</li>
<li>Shapouri-Moghaddam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization%2C+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).</li>
<li>Davies, J. Q., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).</li>
<li>Jin, X., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+macrophage+colony-stimulating+factor+differentiated+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54244(2016).</li>
<li>Gonçalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Varol, C., Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+development+and+tissue+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages: development and tissue specialization.</a> Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).</li>
<li>Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+proliferation+and+apoptosis+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).</li>
<li>Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+polarization+of+murine+bone+marrow-derived+and+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+macrophage+phagocytosis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro macrophage phagocytosis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).</li>
<li>Hosoe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumoricidal+macrophages+from+bone+marrow+cells+of+normal+mice+or+mice+bearing+a+colony-stimulating-factor-producing+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).</li>
<li>Rice, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rM-CSF+efficiently+replaces+L929+in+generating+mouse+and+rat+bone+marrow-derived+macrophages+for+in+vitro+functional+studies+of+immunity+to+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria.</a> Journal of Immunological Methods. 477, 112693(2020).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophages+%28BMM%29%3A+isolation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).</li>
<li>Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1).</a> Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).</li>
<li>Bou Ghosn, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+physically%2C+functionally%2C+and+developmentally+distinct+peritoneal+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Kemik iliğinden türetilmiş bir makrofaj popülasyonu üretmek, özellikle homojen bir birincil hücre popülasyonu elde etmenin önemli olduğu durumlarda, birçok hücre biyolojisi deneysel modelinde temel bir adımdır. Belirtildiği gibi, hücre progenitörleri sadece M-CSF varlığında makrofajlara dönüşebilir. L-929 hücre süpernatantları, M-CSF'nin ana kaynağı olarak kullanılabilir. Maliyet dışında, rekombinant M-CSF'nin kendisinin kullanılmasında herhangi bir sorun yoktur 8,17</...

Monositler ve makrofajlar, kemik iliğindeki progenitörlerden türetilebilen mononükleer fagositlerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda makrofajların yolk kesesi kaynaklı eritromiyeloid progenitörlerden de köken aldığı bildirilmiştir1. Türevlerinden bağımsız olarak, bu lökositlerin homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör işlevleri vardır 2,3. Monositler, dokuda makrofajlara daha fazla farklılaşabilen periferik kandanalınan hücrelerdir 2,4, makrofajlar ise büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin5 lokal maruziyeti ile düzenlenen fenotipler ve işlevler sergileyen heterojen hücrelerdir. Makrofajlar bu tür fonksiyonel çeşitlilik gösterdikleri için birçok hastalık modelinde incelenmiştir. Bu nedenle, makrofajların in vitro kültürü, fizyolojilerini ve farklı hastalıklardaki rollerini anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Kemik iliği, elde edilen makrofaj sayısını katlanarak artıran, izole edilebilen ve çoğaltılabilen makrofaj progenitörleri de dahil olmak üzere önemli bir progenitör hücre kaynağıdır. Ek olarak, kemik iliği kaynaklı makrofajlar, doku mikroçevresi tarafından oluşturulan etkilerden kaçınmak için özellikle önemlidir, çünkü makrofajlar dokulardaki farklı uyaranlara yanıt olarak fenotiplerini değiştirir 6,7. Kemik iliği progenitörleri, makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) maruz kaldıklarında makrofajlara dönüşür8. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, dokudaki biyokimyasal belirteçler ile monosit kaynaklı makrofajlardan ayırt edilemez. Bu hücreler, diğer birçok açıdan peritoneal makrofajlarlakarşılaştırılabilir olan, oldukça homojen bir birincil hücre popülasyonunu temsil eder 6,9.
Heterojen hücresel fonksiyonları nedeniyle, makrofajlar uzun zamandır araştırmacılar tarafından kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu hücreler, bu süreçlerde yer aldıkları için bulaşıcı ve enflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere farklı deneysel modellerde kullanılabilir10,11. Çeşitli mikro-çevresel uyaranlara yanıt olarak makrofaj polarizasyonunu araştırmak için de yararlı olabilirler 12,13. Bu nedenle, fare kemik iliğinden yüksek sayıda primer makrofaj elde etmek amacıyla burada basit ve güvenilir bir protokol sağlanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>20 cc'lik şırınga</td><td>DESCARPACK</td><td>SI100S4G</td><td>Steril şırınga</td></tr><tr><td>26 G iğneler</td><td>BD</td><td>497AQDKT7</td><td>Steril iğneler</td></tr><tr><td>50 ml konik santrifüj tüpü</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td>Santrifüjlemeye uygun plastik konik tüpler</td></tr><tr><td>%70 etanol çözeltisi</td><td>EMFAL</td><td>490</td><td>Esterilizasyon için etanol çözeltisi</td></tr><tr><td>Anatomik diseksiyon forseps</td><td>3B SCIENTIFIC</td><td>W1670</td><td>%70 etanol çözeltisi içeren steril beherde muhafaza</td></tr><tr><td>edin C57Bl/6 vahşi tip fare</td><td>Biot&eacute'den satın alındı; Minas Gerais Federal Üniversitesi'ndeki rio Central</td><td>Uygulanamaz</td><td>Fareler, 6 ila 10 haftalık yaşları arasında, spesifik patojen içermemelidir. Farelerin taşıma stresinden kurtulmak için en az bir hafta önce yerleştirilmesi gerekir</td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi T175</td><td>GREINER</td><td>C7481-50EA</td><td>T-175 şişesi, eğimli boyun, yüzey alanı 75 cm2, filtre kapaklı, DNaz içermez, RNaz içermez</td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi T75</td><td>GREINER</td><td>C7231-120EA</td><td>T-75 şişesi, eğimli boyun, yüzey alanı 75 cm2, filtre kapaklı, DNaz içermez, RNase içermeyen</td></tr><tr><td>Dezenfeksiyon mu yoksa bebek Mendili mi?</td><td>CLOROX</td><td>Uygulanamaz</td><td>Kemiğin temizlenmesine yardımcı olur</td></tr><tr><td>Damıtılmış Su</td><td>GIBCO</td><td>15230</td><td>Steril damıtılmış su</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10</td><td>Uygulanamaz Uygulanamaz</td><td></td><td>DMEM/F12'ye (q.s.p. 100 mL)DMEM/F12-10 + L-929 hücrelerinin süpernatanına 10 mL Fetal Sığır Serumu (FBS) ve 1 mL Penisilin/Streptomisin (P/S) ekleyin</td></tr> <tr><td></td><td>Uygulanamaz</td><td></td><td>DMEM / F-12-10 Dulbecco &prime üzerine L929 hücre kültürünün süpernatanının% 20'sini ekleyin</td></tr><tr><td>; s Modifiye Eagle & Prime; s Orta - F12 (DMEM / F12)</td> <td>GIBCO</td><td>12500096</td><td>DMEM: F-12 Medium, 2.5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodyum piruvat ve 1200 mg / L sodyum bikarbonat içerir. Tozu 1 litre damıtılmış suya yeniden süspanse edin ve 3,7 g sodyum bikarbonat ekleyin. PH'ı 7,2'ye ayarlayın ve 0,22 > M ile filtreleyin. 2 - 8 ° C'de saklayın; C dondurucu</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ısı inaktive edilmiş, Amerika Birleşik Devletleri (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10082147</td><td>DMEM-F12 Hemositometre için Zenginleştirme</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z359629</td> Mikroskopi L-929 <td>hücrelerinde makrofajları saymak için kullanılır</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>ATCC # CCL-1</td><td>L-929, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF)</td></tr> <tr><td>kaynağı olarak kullanılan bir fare fibroblast hücreleri soyudurNikon TI tutulması&nbsp;</td><td>NIKON&nbsp;</td><td>Uygulanamaz</td><td>Nikon TI Eclipse bir floresan ve faz kontrast mikroskobudur</td></tr><tr><td>Enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi</td><td>CELLSTRIPER (CORNING)</td><td>25-056-CI</td><td>Enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi, makrofajları plakadan zarar vermeden çıkarın</td></tr><tr><td>İşlem görmemiş yuvarlak kültür kapları 100 & kez; 20 &ndash; mm</td><td>CORNING</td><td>CLS430591</td><td>Doku kültürü ile tedavi edilmiş petri kapları veya herhangi bir doku kültürü uygulanmış plaka kullanmayın</td></tr><tr><td>P3199 Penisilin G Potasyum Tuzu</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>113-98-4</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin (P/S) solüsyonu</td><td></td><td></td><td>0,26 gram penisilin ve 0,40 gram streptomisin kullanın. 40 mL steril PBS ile karıştırın. Yatay bir laminer akış kabini içinde 0,22 & mikro; M: 1.0 mL'lik alikotları filtreleyin ve dondurucuda 1.5 ml mikrofüj tüplerinde saklayın (-20&deg; C)</td></tr> <tr><td>Kalsiyum ve Magnezyum içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>MEDIATECH</td><td>21-040-CM</td><td>Steril</td></tr><tr><td>S7975 Streptomisin Sülfat, 650-850U/mg</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>3810-74-0</td><td>Antibiyotikler</td></tr><tr><td>10 mL veya 25 mL'lik serolojik pipetler</td><td>SARSTEDT</td><td>861254001</td><td>Serolojik pipetler 1 mL'den daha yüksek hacimlerde kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>144-55-8</td><td>DMEM-F12 Yazılımı için pH düzeltmesi</td></tr><tr><td>Nis Elements Viewer</td><td>NIKON</td><td>Uygulanamaz</td><td>NIS-Elements Viewer, görüntü dosyalarını ve veri kümelerini görüntülemek için ücretsiz bir bağımsız programdır</td></tr><tr><td>Steril PBS ve %2 P/S çözeltisi</td><td>LABORCRIN</td><td>590338</td><td>40 mL steril PBS'ye 1 mL P/S ekleyin</td></tr><tr><td>Düz iris makası</td><td>KATENA</td><td>Uygulanamaz</td><td>%70 etanol çözeltisi içeren steril beherde muhafaza edin</td></tr><tr><td>L-929 hücrelerinin süpernatantı</td><td>Uygulanamaz</td><td>Uygulanamaz</td><td>L-929, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak kullanılan fare fibroblast hücrelerinin bir soyudur. L-929 süpernatanı protokolden elde edildi</td></tr><tr><td>Cerrahi Neşter Bıçağı No.24 Paslanmaz Çelik</td><td>SWANN-MORTON</td><td>311</td><td>Kemiklerden epifizi açığa çıkarmak için kullanılır Tripan</td></tr><tr><td>Mavisi Çözeltisi, %0.4</td> <td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>Tripan Mavisi Çözeltisi, %0.4, boya dışlama testi kullanılarak hücre canlılığını değerlendirmek için rutin olarak bir hücre boyası olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA çözeltisi %0,05GIBCO</td><td></td> <td>25300-062</td><td>Hücreleri kültür şişesinden ayırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Hücre Kültürü için Enjeksiyon Suyu (WFI)</td><td>GIBCO</td><td>A12873</td><td>Steril ve endotoksin içermeyen su</td></tr></tbody></table>

farelerden kemik İliği kaynaklı makrofajların İzolasyonu ve kültürü

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Makrofajlar homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör fonksiyonlara sahiptir. Bu hücreler vücuttaki her dokuda bulunur ve mikro çevrede bulunan uyaranlara göre profillerini değiştirme konusunda önemli bir yeteneğe sahiptir. Sitokinler, makrofaj fizyolojisini, özellikle IFN-γ ve interlökin 4'ü derinden etkileyerek sırasıyla M1 ve M2 tiplerini oluşturabilir. Bu hücrelerin çok yönlülüğü nedeniyle, kemik iliği türevli makrofaj popülasyonunun üretimi, hücre biyolojisinin birçok deneysel modelinde temel bir adım olabilir. Bu protokolün amacı, kemik iliği progenitörlerinden türetilen makrofajların izolasyonu ve kültüründe araştırmacılara yardımcı olmaktır. Patojen içermeyen C57BL / 6 farelerinden elde edilen kemik iliği progenitörleri, bu protokolde murin fibroblast soyunun L-929'un süpernatantından elde edilen makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) maruz kaldıklarında makrofajlara dönüştürülür. İnkübasyondan sonra, olgun makrofajlar 7. günden 10. güne kadar kullanılabilir. Tek bir hayvan yaklaşık 2 x 107 makrofajın kaynağı olabilir. Bu nedenle, temel hücre kültürü yöntemlerini kullanarak büyük miktarlarda primer makrofaj elde etmek için ideal bir protokoldür.

Makrofajlar, özel fizyolojik özelliklere sahip büyük ve yapışık hücrelerdir. Cam ve plastiğe yapışma kabiliyeti nedeniyle kültürde çeşitli morfolojik sunumlar gösterirler ve tipik yayılma morfolojileri sitoplazmik uzantıların emisyonu ile ilgilidir (Şekil 1). Kemik iliği progenitörleri, L-929 hücre süpernatantından M-CSF'ye maruz kaldıklarında ve olgun makrofajlara dönüşümü başlattıklarında, Petri plakasına yapışırlar.
Şekil 2 , kemik...

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Bu protokol, kemik iliğinden türetilmiş ve doku faktörlerine veya sitokinlere hiç maruz kalmamış yüksek miktarda uyarılmamış makrofajlar elde etmeyi amaçlar. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir hayvandan elde edilen hücre sayısıdır. Doğru işlem ile yaklaşık 2 çarpı 10 üzeri 7 makrofaj gücü elde edilebilir.Bu yöntem, hücre biyolojisi, patoloji, immünoloji ve parazitoloji gibi makrofajları inceleyen farklı alanlardan araştırmacılara yardımcı olabilir, Hücreler her zaman kontaminasyona karşı hassas olduğundan, hücre canlılığını korumak için tüm steril adımlara dikkat etmek ve laminer akışlı bir biyogüvenlik kabini kullanmak gereklidir. Prosedürü gösteren Izabela Aparecida de Souza olacaktır. Laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi.Uygun şekilde ötenazi yapılmış sekiz haftalık C57BL / 6 vahşi tip erkek fare üzerinde işleme başlamak için, fareyi% 70 etanol çözeltisi ile ıslatın. Steril makas kullanarak, karın boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın ve arka bacakların kası tamamen açığa çıkana kadar cildi çıkarın. Ardından, uyluk kemiği ve kaval kemiğini kırmadan arka bacakları kalça yüksekliğinde dikkatlice çıkarın.Sağlam arka ayakları% 70 etanol çözeltisi içeren konik bir santr

isolation-and-culture-of-bone-marrow-derived-macrophages-from-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Makrofajlar homeostasis merkezi bir rol oynar ve birçok dokularda patoloji. Burada sunulan protokol makrofajlar tüketen için kullanılan yöntemleri...

Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Bu videoda, farelerin uzun kemiklerinden kemik iliği stromal hücrelerinin izolasyonunu ve kültürünü gösteriyoruz. İzole edilmiş yapışkan BMSC'ler daha fazla analiz için kullanılabilir.

Bir Fare Tibiasından Kemik İliği Stromal Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Bu videoda, bakteriyel lipopolisakkarit ve intravenöz immünoglobuline yanıt olarak kemik iliği kaynaklı makrofajların aktivasyonunu gösteriyoruz.

Antikorlara Yanıt Olarak Fare Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Aktivasyonu

Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir...

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

Makrofajlar uzun doğal ve adaptif immün yanıtları kritik bir bileşeni olarak kabul edilmiştir. Makrofajlar ve mikrop arasındaki etkileşimin, evrimsel genetik ve biyokimyasal yönleri ile ilgili bilginin son patlama makrofajlara bilimsel ilgi yenilenmiştir. Bu makalede, fare kemik iliği makrofajları ayırt etmek için bir yöntem tarif edilir.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Bu protokol, NO-redoks biyolojisini incelemek için tetrahidrobiyopterin (BH4) ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) eksikliği olan primer murin makrofajlarını kültürlemek için kurulmuştur. Çalışma, BH4'ün ve geleneksel izolasyon ve kültür yöntemlerinde bulunan ve deneysel sonuçları ve sonuçların yorumlanmasını karıştırabilecek diğer eserlerin potansiyel kontaminasyonunu azaltmaya odaklanmaktadır.

NO-Redoks Biyolojisi Çalışması için Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve In vitro Kültürü

Proteom ölçeğinde protein keşfi ve nicelleştirmesi ile uyumlu yüksek kaliteli mitokondri izolasyonu için iki aşamalı bir protokol sunuyoruz. Protokolümüz genetik mühendisliği gerektirmez ve bu nedenle herhangi bir birincil hücre ve dokudan mitokondri incelemek için uygundur.

Gelişmiş protein keşfi ve nicelleştirme için mitokondrinin iki aşamalı etiketsiz izolasyonu

Bu protokol, 7-9 günlük yenidoğan fare kemik iliği hücrelerini izole etmek ve granülosit koloni uyarıcı faktör (M-CSF) kaynağı olarak L929 hücrelerinin bir süpernatantını kullanarak farklılaşmış makrofajlar oluşturmak için enzimatik olmayan ve basit bir yöntemi tanımlar. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, yüzey antijenleri F4/80, CD206, CD11b ve fonksiyonel yeterlilik açısından daha fazla analiz edildi.

Yenidoğan Fare Kemik İliği İzolasyonu ve Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların Hazırlanması

Öğrenin, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofaj izolasyonu ve kültürü yöntemini. Bu teknik, tek bir hayvandan yaklaşık 2 x 10^7 hücre elde ederek immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarına güvenilir bir temel sağlar.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Daha fazla video keşfet