Name: Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Öğrenin, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden flotasyon bazlı T hücresi izolasyonu, aktivasyonu ve mikrokabarcıklarla genişleme yöntemini. Bu teknik, T hücre yorgunluğunu sınırlayarak hücre terapisi uygulamalarında kalıcılığı artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Pozitif seleksiyon kullanılarak T hücrelerinin mikrokabarcıklarla izolasyonu
NOT: Bu protokol, SAMB'leri kullanan küçük ölçekli CD3+ pozitif seçim yaklaşımını ayrıntılarıyla açıklar.
<ol><li>Ticari olarak elde edilen 3 x 108 PBMC'leri, 1 milyon hücre (25 ng / M) başına 25 ng antikor konsantrasyonunda biyotinile anti-CD3 (OKT3) antikoru ile 2.5 mL ayırma tamponunda inkübe edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Streptavidin mikrokabarcıklarını (SAMB'lar) üreticinin rapor ettiği SAMB konsantrasyonuna göre 0.5 (SAMB miktarı):1 (hücre miktarı) oranında ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 20 rpm'de ticari bir uçtan uca (EOE) rotatör kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında 400 x g'da 5 dakika santrifüj.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, pozitif olarak seçilen hücreler SAMB'lerle süspansiyonun en üstünde olacaktır. Kalan seçilmemiş hücreler, tüpün altındaki hücre peletinde olacaktır. 9 inç cam pipet kullanarak, ucu kabarcık hücresi tabakasının altına tüpün altına yerleştirin, hücre peletini ve subnatantını elektronik bir pipetle aspire edin ve yeni bir tüpe aktarın.</li>
</ol>2. Pozitif seçilmiş T hücrelerinin birlikte uyarılması (aktivasyonu)
<ol><li>Orijinal tüpte kalan kabarcık hücresi katmanını 1 mL'lik tam T hücre ortamında (veya istenen başka bir ortamda) yeniden askıya alın.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacı kullanarak brightfield mikroskobu ile subnatanttaki hücreleri sayın ve kabarcık hücresi katmanında yakalanan hücre sayısını belirlemek için bu değeri başlangıç hücre numarasından çıkarın.</li>
	<li>Bu adımdan önce, konjuge anti-CD28 SAMB'leri oluşturmak için biyotinile anti-CD28 antikoru ticari SAMB'lerle en az 2 saat karıştırın. Konjugasyon için gereken anti-CD28 antikoru miktarını belirlemek için SAMBs üreticisine başvurun. Anti-CD28 konjuge SAMB'leri, 1.5 (anti-CD28 SAMB'ler):1 (hücreler) oranını kullanarak adım 2.1'den kaynaklanan kabarcık hücresi süspansiyonuna ekleyin.</li>
	<li>EOE rotasyonunu kullanarak 15 dakika boyunca karıştırın ve ardından toplam hacmi, adım 2.2'de elde edilen hücre sayısına göre tam T hücre ortamı veya istenen başka bir ortam ile mL başına 2 milyon hücreye ayarlayın.</li>
</ol>3. Hücre kültürü ortamında birlikte uyarılan hücrelerin genişlemesi
<ol><li>Adım 2.4'ten 1 mL aktive edilmiş hücreyi, 24 delikli bir plakada kuyucuk başına 2 M / mL konsantrasyonda dağıtın. 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe inkübe edin.</li>
	<li>24 saat sonra, 0. günde kaplanan ilk hücre sayısı kullanılarak hesaplandığı gibi, genişlemeyi daha da teşvik etmek için 50 U / mL IL-2 ve 25 ng / M çözünür anti-CD3 (OKT3) ekleyin. Hücre plakasını nemlendirilmiş CO2 inkübatörüne geri yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe etmesine izin verin.</li>
</ol>4. İsteğe bağlı: Aktive olmuş T hücrelerinin lentivirüs ile transdüksiyonu
NOT: Burada kullanılan yaklaşım Prommersberger ve ark.'dan uyarlanmıştır. 10.
<ol><li>Lentivirüsü oda sıcaklığında çözün ve pipetleyerek, kısaca karıştırın.</li>
	<li>Orta natant, 600 μL'yi, şu anda kuyunun dibinde bulunan yavru hücrelere veya çözeltinin yüzeyinde kalan kabarcık tabakasına dokunmadan her bir kuyucuktan yavaşça çıkarın.</li>
	<li>Viral transdüksiyonu arttırmak için kuyu başına 5 μg / mL hekzadimetrin bromür ekleyin. Lentiviral parçacıkları 3'lük bir enfeksiyon çokluğuna (MOI) ekleyin (hücre başına lentiviral parçacıklar).</li>
	<li>Yavaş hızlanma ve yavaşlama için ara vermeden plakayı 800 x g ve 32 °C'de 45 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>4 saat sonra, her bir kuyucuğa 600 μL ticari olarak temin edilebilen, taze tam T hücresi ortamı ve 50 U / mL IL-2 ekleyin ve hücre plakasını T hücresi genişlemesi için 37 ° C'de nemlendirilmiş CO2 inkübatörüne geri yerleştirin.</li>
</ol>5. T hücrelerinin genişlemesi (önceden transdüksiyon olsun veya olmasın)
<ol><li>Her 2 günde bir, ortamın yarısını orta natanttan çıkarın, taze, tam T hücresi ortamı ile değiştirin ve 50 U / mL'lik bir konsantrasyonda IL-2 ekleyin.</li>
	<li>Hücre yoğunluğunu değerlendirmek için T hücrelerini haftada iki kez sayın. Hücre yoğunluğu 2 x 10 6-2.5 x 106 hücre / mL'yi aştığında, hücreleri daha büyük bir kaba aktarın ve 5 x 105 hücre / mL'ye seyreltin.</li>
</ol>6. T hücrelerinin toplanması ve akış sitometrisi
<ol><li>Her bir kuyucuğun içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Mikro kabarcıklar da dahil olmak üzere kuyunun tüm içeriğini çıkarın ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Her bir oluğu 400 μL kalsiyum içermeyen ve magnezyum içermeyen DPBS (-/-) ile yıkayın ve çözeltiyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 50 μL ayırma tamponunda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Aktivasyon ve tükenme antikoru / boyama kokteyli ile lekeleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Boyama kokteyllerini aşağıdaki gibi hazırlayın - aktivasyon kokteyli: AF700-CD3, PE / Göz Kamaştırma-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; Tükenme kokteyli: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.</li>
	<li>1 mL ayırma tamponu ekleyin ve yavaşça karıştırın. Fazla antikorları yıkamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen aspire edin.</li>
	<li>Hücre peletini 1 mL ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometri analizi için uygun bir kaba (örneğin, bir FACS tüpü, 96 delikli bir plaka, vb.) aktarın. Önerilen akış sitometri analizi geçit şeması Şekil 1'de detaylandırılmıştır.</li>
</ol>

<ol><li>Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+perspective+of+CAR-T+and+CAR-NK+cell+therapy+trials+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany.</a> Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).</li>
<li>Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+CAR-T+cell+manufacturing+processes+during+pivotal+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).</li>
<li>Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+manufacturing+protocols+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+improved+anticancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).</li>
<li>Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapies%3A+The+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapies: The current landscape.</a> Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Poltorak, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expamers%3A+A+new+technology+to+control+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Expamers: A new technology to control T cell activation.</a> Scientific Reports. 10, 17832(2020).</li>
<li>Kagoya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+stimulation+expands+superior+antitumor+T+cells+for+adoptive+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy.</a> JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).</li>
<li>Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).</li>
<li>McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).</li>
<li>Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+CAR+T+cells+produced+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction.</a> Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).</li>
<li>Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+costimulation+leads+to+dysfunction+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).</li>
<li>Li, Y., Kurlander, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+anti-CD3+and+anti-CD28-coated+beads+with+soluble+anti-CD3+for+expanding+human+T+cells%3A+Differing+impact+on+CD8+T+cell+phenotype+and+responsiveness+to+restimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).</li>
</ol>

Tüm yazarlar, gönderim sırasında, mikrokabarcık ayırma ürünleri üreten ve satan Akadeum Life Sciences'ın çalışanlarıdır.

Tanımlanan protokol, PBMC örneklerinden T hücrelerinin izolasyonuna ve mikrokabarcıklarla kültür ortamındaki askıya alınmış T hücrelerinin aktivasyonuna izin verir. Bu yöntem, doğal kaldırma kuvveti hücrelere eş-uyarıcı sinyaller vermek ve bir kültür ortamında askıya alınırken bunları aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunan işlevselleştirilmiş mikro kabarcıklara dayanır, böylece genişleyen hücrelerin uzun süreli stimülasyona maruz kalmasını azaltır; Bu tür aşırı uyarım, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunun a...

Şu anda dünya çapında 500'den fazla kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi klinik çalışması yürütülmektedir ve piyasada dört CAR-T hücre tedavisi ürünü bulunmaktadır1. Bununla birlikte, bu potansiyel olarak iyileştirici tedavilerin etkinliğini, ölçeklenebilirliğini ve uzun vadeli başarısını artırmak için ele alınması gereken çok sayıda CAR-T hücre araştırması ve üretim ihtiyacı hala mevcuttur 2,3,4,5. Evlat edinilmiş CAR-T hücresi klinik araştırması ve üretimi, periferik bir kan örneğinden T hücresi izolasyonu ve ardından izole hücrelerin uyarılması, transdüksiyonu ve genişlemesi ile başlar. T hücresi geri kazanımı, saflık ve aktivasyon / tükenme sinyalleri gibi parametreler, CAR-T hücre araştırması ve üretimi için hücre izolasyonu ve stimülasyon tekniklerini seçerken dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır 3,4,6. Önemli olarak, terapötik etkinliği arttırmak için T hücresi tükenmesi gibi mevcut üretim süreçlerinden kaynaklanan biyolojik engelleri en aza indirgeyerek CAR-T hücre tedavilerinin terapötik kalıcılığında iyileşme gereklidir 6,7.
Floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik aktive hücre sıralama (MACS) gibi geleneksel hücre izolasyon yöntemlerine alternatif olarak, burada, T hücresi izolasyonu için mikro kabarcıklarla yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) gösterilmektedir. Mikrokabarcık ayırma, hedefleri bağlamak ve bunları sıvı numunelerinin yüzeyine yüzdürmek için yüzdürücü, içi boş mikrosferler (mikro kabarcıklar) kullanır 8,9. Mikrokabarcıkları antikorlarla (yani anti-CD3) işlevselleştirerek, istenen T hücresi popülasyonları periferik kan örneklerinden pozitif olarak seçilebilir. Daha sonra, süspansiyonda pozitif seçilmiş T hücrelerini birlikte uyarmak ve aktive etmek için farklı bir antikor işlevselleştirilmiş mikrokabarcık popülasyonunun (yani, anti-CD28) kullanımı bu çalışmada gösterilmiştir. Mikrokabarcıklar, askıya alınmış hücre kültürü ve genetik modifikasyon ve genişleme gibi aşağı akış uygulamaları için hazır T hücreleri üreten basit ve oldukça ayarlanabilir bir izolasyon ve aktivasyon iş akışı sunar. Kritik olarak, mikro kabarcıklarla yüzdürücü hücre aktivasyonu, aşırı T hücresi tükenmesini önlemek için kısıtlanmış hücre stimülasyonunu teşvik eder7.
Bu çalışma için, akış sitometrisi, işlevselleştirilmiş mikrokabarcıkların izolasyon, aktivasyon ve transdüksiyon başarısını analiz etmek ve transdüksiyon sonrası büyüme ve genişleme aşamalarında mevcut olan spesifik alt popülasyonlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak için kullanılan birincil araçtır. Akım sitometrisine ek olarak, hücre sağlığını, morfolojisini ve transdüksiyon başarısını doğrulamak için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanıldı. Bu sonuçlara dayanarak, mikrokabarcık teknolojisi ve protokolü, günümüzde kullanılmakta olan geleneksel izolasyon ve aktivasyon yöntemlerine daha ayarlanabilir ve daha yumuşak bir alternatif sunmaktadır; Özellikle, mikrokabarcıkla aktive olmuş hücreler, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunu, endüstri standardı aletler ve kitlerle tipik olarak gözlemlenenden önemli ölçüde daha düşük gösterir.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>CAS: 60-24-2</td></tr><tr><td>Biologix Çok Kuyulu Kültür Plakaları 24 kuyulu plakalar</td><td>VWR&nbsp;</td><td>76081-560</td><td></td></tr><tr><td>Biotin anti-insan CD28 (28.2) Antikor</td><td>Biolegend</td><td>302904</td><td></td></tr><tr><td>Biotin anti-insan CD3 (OKT3) Antikor</td><td>Biolegend</td><td>317320</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Thermofisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Rekombinant IL2&nbsp;</td><td>BioVision (vwr)</td><td>10006-122</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral Parçacık rLV.EF1.zsGreen1-9</td><td>Takara Bio</td><td>0038VCT</td><td></td></tr><tr><td>Lökopak</td><td>BioIVT</td><td>HUMANLMX100-0001129</td><td></td></tr><tr><td>Normal İnsan PBMC'leri</td><td>BioIVT</td><td>HUMANHLPB-0002562</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü için Penisilin / Streptomisin 100X</td><td>VWR</td><td>97063-708</td><td>CAS: 8025-06-7</td></tr><tr><td>Polibren Enfeksiyon / Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>CAS: 28728-55-4</td></tr><tr><td>Havuzlanmış İnsan AB Serumu Plazmadan Türetilmiş Isı İnaktive</td><td>Edilmiş Yenilikçi Araştırma</td><td>ISERABHI100mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi, HEPES</td><td>Gibco</td><td>72400047</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Mikrokabarcık Kiti (Akadeum'un ayırma tamponunu içerir)Akadeum</td><td></td> <td>11110-000</td><td></td></tr></tbody></table>

flotasyon bazlı t hücresi İzolasyonu, aktivasyonu ve mikrokabarcıklar kullanılarak İnsan periferik kan mononükleer hücre Örneklerinden genişleme

Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles

T hücrelerini ex vivo kültürler oluşturmak için periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole etme süreci, araştırma, klinik testler ve hücre bazlı tedaviler için çok önemlidir. Bu çalışmada, PBMC'lerden T hücrelerini ex vivo olarak izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için basit, yeni bir protokol sunulmuştur. Bu çalışma, T hücrelerini izole etmek ve aktive etmek için işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) teknolojisini kullanmaktadır. Kısaca, protokol, lökopak türevi PBMC'lerden CD3 + hücrelerinin pozitif seçimini içerir, ardından 24 delikli plakalarda transdüksiyondan önce önceden konjuge anti-CD28'e bağlı streptavidin mikrokabarcıkları (SAMB'ler) ile 48 saatlik bir birlikte stimülasyon yapılır. İşlevselleştirilmiş mikro kabarcıklar, hücreleri yüzdürücü bir şekilde aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunarak, minimum tükenme ile genişlemeye izin veren proliferatif fenotiplere yol açar. Bu teknik, yardımcı uyarıcı mikro kabarcıklar yüzer kalır ve kültür ortamının tepesine geri döner, böylece genişleyen hücrelerin birlikte uyarıcı faktörlerle temas halinde olduğu süreyi azaltır. Sonuçlar, izole edilmiş ve kültürlenmiş T hücrelerinin aktive etmek ve çoğalmak için yeterli stimülasyon aldığını, ancak aşırı PD-1'in varlığının gösterdiği gibi aşırı aktivasyona yol açacak ölçüde değil, daha sonra tükenmeye yol açtığını göstermektedir.

T hücreleri satın alınan PBMC'lerden izole edildi ve protokolde açıklandığı gibi aktivasyon için kaplandı. Negatif kontrol örnekleri (satın alınan PBMC'ler) etkinleştirilmedi. Bu kontrol örnekleri, mikrokabarcık aktivasyon sürecinin, el değmemiş ve uyarılmamış T hücresi kontrollerine kıyasla deneysel numuneler üzerindeki etkisini göstermek için dahil edildi ve gözlemlenen aktivasyon belirteçlerinin eklenen aktivasyon faktörlerinin sonucu olmasını ve T hücrelerinin kendilerine özgü olmamasını sağladı. Şekil 2'deki deneyse...

Bu çalışmanın amacı, primer insan T hücrelerini izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için yüzdürme bazlı ayırmanın fizibilitesini göstermektir.

Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

The process of isolating T cells from peripheral blood mononuclear&#160;cells (PBMCs) to establish ex vivo cultures is crucial for research, clinical ...

Mikrokabarcık aktivasyonu ve genişleme protokolü önemlidir, çünkü hücre tedavisi araştırma ve üretiminde karşılanmamış büyük bir ihtiyacı ele alır ve T hücresi tedavilerinin kalıcılığını ve etkinliğini arttırır. Akadeum'un yüzdürme tabanlı pozitif seleksiyon, aktivasyon ve genişleme tekniği, aktivasyon ve genişleme iş akışları sırasında aşırı uyarılmayı ve ardından T hücresi tükenmesini sınırlar. Başlamak için, biyotinile anti-CD3 antikoru ile 2.5 mililitre ayırma tamponunda ticari olarak elde edilen PBMC'leri 3 kez 10 ila 8.Bileşenleri pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre, soyulmuş avidin mikro kabarcıklarını hücrelere 0,5 ila 1 oranında ekleyin. Ve 20 RPM'de ticari bir uçtan uca rotatör kullanarak oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca karıştırın.Oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 g'da santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, pozitif olarak seçilen hücreler, soyulmuş avidin mikrokabarcıkları ile süspansiyonun üstünde olacak ve kalan seçilmemiş hücreler, tüpün altındaki hücre peletinde olacaktır. Dokuz inçlik bir cam pipet kullanarak, ucu kabarcık hücresi katmanının altına tüpün altına yerleştirin.Hücre peletini ve subnatantını elektronik bir pipetle aspire edin ve bunları yeni bir tüpe aktarın. Orijinal tüpte kalan kabarcık hücresi katmanını bir mililitre tam T hücresi ortamında yeniden askıya alın. Subnatantı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400 g'da santrifüj yapın ve dolaylı saflık ve geri kazanım ölçümü için kullanın.Subnatant ve seçilmemiş hücrelerin santrifüjlenmesinden sonra, süpernatanı aspire edin ve saymadan önce peleti bir mililitre ortamda yeniden askıya alın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, parlak alan mikroskobu ile subnatanttaki hücreleri sayın ve metin makalesinde açıklandığı gibi kabarcık hücre katmanında yakalanan hücrelerin sayısını belirleyin. Konjuge anti-CD28 soyulmuş avidin ve mikrokabarcıkları oluşturmak için, biyotinile anti-CD28 antikorunu ticari mikro kabarcıklara ekleyin ve en az iki saat boyunca uçtan uca rotasyon kullanarak karıştırın.Anti-CD28 konjuge strep avidin mikro kabarcıklarını hazırlanan kabarcık hücresi süspansiyonuna 1,5 ila 1 oranında ekleyin. Bileşenleri uçtan uca döndürmeyi kullanarak 15 dakika boyunca karıştırın. Ardından, toplam hacmi, tam T hücresi ortamı veya elde edilen hücre sayısına göre istenen başka bir ortam ile mililitre başına 2 milyon hücreye ayarlayın.Bir mililitre aktif hücreyi 24 kuyucuklu bir plakaya dağıtın ve nemlendirilmiş% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, sıfır gününde kaplanan ilk hücre sayısı kullanılarak hesaplandığı gibi, daha fazla genişlemeyi teşvik etmek için IL-2 ve çözünür anti-CD3 ekleyin. Hücre plakasını nemlendirilmiş karbondioksit inkübatörüne geri yerleştirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Ortamın yarısını her iki günde bir midnatanttan çıkarın. Taze, eksiksiz T hücresi ortamı ile değiştirin ve mililitre başına 50 birim konsantrasyonda IL-2 ekleyin. Hücre yoğunluğunu değerlendirmek için T hücrelerini haftada iki kez sayın.Hücre yoğunluğu mililitre başına 2 kat 10 ila 6. hücreye veya 2.5 kez 10. hücreye ulaştığında, bunları mililitre başına 5. hücrelere 5 kat 10'a seyrelterek daha büyük bir kaba aktarın. Her bir kuyucuğun içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Mikro kabarcıklar da dahil olmak üzere kuyunun tüm içeriğini çıkarın ve bunları 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Her bir oluğu 400 mikrolitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile yıkayın ve çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400g'da santrifüj edin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 50 mikrolitre ayırma tamponunda yeniden askıya alın.Daha sonra, aktivasyon ve tükenme için 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu her biri 25 mikrolitreye bölün. Hücreleri bir aktivasyon ve tükenme antikoru boyama kokteyli ile lekeleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir mililitre ayırma tamponu ekleyin, nazikçe karıştırın ve fazla antikorları yıkamak için santrifüj yapın.Süpernatantı tamamen aspire edin. Hücre peletini bir mililitre ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi analizi için uygun bir kaba aktarın. Kontrol örneği ile mikrokabarcık ko-stimülasyonu alan hücreler arasında canlı T hücresi sayılarında ve transgen pozitif T hücrelerinde artışlar gözlendi.Mikro kabarcık örneklerinde artmış efektör hücre popülasyonları da gözlenmiştir. Canlı aktive olmuş T hücreleri, artmış erken aktivasyon belirteci CD69 ve orta ila geç aktivasyon belirteci CD25'i eksprese eder. PD1 pozitif hücrelerin tükenme belirteçlerinin toplam sayısı ve yüzdesi, mikrokabarcık ko-stimülasyonu alan hücre örneklerinde de anlamlı derecede yüksekti.Mikro kabarcıkların uygun şekilde karıştırılması ve dağıtılması, doğru dozajlamayı sağlamak için esastır, çünkü mikro kabarcıklar ajitasyon olmadan yüzeye hızla yüzer. Bunu, diğer yöntemlerde sıklıkla görülen daha yorgun T hücrelerinden daha yüksek aktiviteye sahip büyük bir T hücresi popülasyonunun hızlı büyümesini sağlayarak yapmasını bekliyoruz.

flotation-based-t-cell-isolation-activation-expansion-from-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Bu videoda, B olmayan hücrelere özgü biyotinile antikorlar ve streptavidin konjuge manyetik mikro boncuklar kullanarak B hücrelerinin insan periferik kanından izolasyonunu gösteriyoruz.

İnsan Periferik Kanından B Hücrelerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Bu video, işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilen hücre sıralama (BACS) teknolojisi kullanılarak periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) T hücresi izolasyonunu göstermektedir. İzolasyon tekniği, hücrelerin biyotinile anti-CD3 antikorları ile işaretlenmesi ve antikora bağlı hücrelerin streptavidin'e bağlı mikro kabarcıklar kullanılarak ayrılması yoluyla CD3+ T hücrelerinin pozitif seçimini içerir.

Yüzdürme ile aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak yüzdürme tabanlı T hücresi izolasyonu

Bu makale, tanımlanmış bir alloantijene spesifik olarak yanıt veren insan T hücresi klonlarının üretilmesi ve yayılması için bir yöntemi açıklar. Bu protokol, çeşitli peptit-MHC ligandlarına özgü insan T hücrelerinin klonlanması için uyarlanabilir.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

Burada, yakın zamanda gösterdiğimiz gibi, ekstratimik bir αβ T hücresi progenitörü olan periferik Vδ1+CD4+ T hücrelerinin kıt T hücresi varlığının izolasyonu ve klonlanması için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, bu hücrelerin ex vivo kültürde kantitatif olarak izole edilmesine, klonlanmasına ve verimli bir şekilde genişletilmesine izin verir.

İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

İnsan periferik kanı, humoral immün yanıtın değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılır. Burada, insan B hücrelerini periferik kandan izole etme, insan B hücrelerini kültürde antikor (Ab) salgılayan B hücrelerine (ASC'ler) ayırma ve bir ELISpot testi ile toplam IgM ve IgG-ASC'leri numaralandırma yöntemleri açıklanmaktadır.

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi&#39;nin olarak

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Periferik kan mononükleer hücrelerinin Sézary Sendromu tanısı alan hastalardan elde edilen tam kandan izole edilmesi, ardından CD4 + T hücrelerinin seçimi, forbol12-miristat13-asetat ve A23187 iyonofor ile uyarılmaları ve transkriptomik profilleme için RNA'nın hazırlanması için basit bir protokol sunuyoruz.

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Bu protokol, biyobankacılık ve diğer amaçlar için insan periferik kan mononükleer hücrelerini izole etmek için yüksek verimli otomasyonla uyumlu bir yöntemi detaylandırır.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin Buffy Coats'tan Yüksek Verimli İmmünomanyetik Boncuk Ayırma ile İzole Edilmesi

Öğrenin, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden flotasyon bazlı T hücresi izolasyonu, aktivasyonu ve mikrokabarcıklarla genişleme yöntemini. Bu teknik, T hücre yorgunluğunu sınırlayarak hücre terapisi uygulamalarında kalıcılığı artırır.

Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme (Video) | JoVE Journal

Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

Daha fazla video keşfet