Name: Memeli 3D Genom Etkileşimlerinin Micro-C-XL ile Haritalanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde Micro-C-XL tekniğiyle nükleozom çözünürlüğünde 3D genom etkileşimlerini haritalamayı. Bu yöntem, kromatin yapısı ve gen regülasyonu çalışmaları için yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Christl Gaubitz ve Kathleen Stewart-Morgan'a el yazmasını eleştirel okumaları için teşekkür ederiz. Laboratuvarımızı kurmamızdaki destekleri için Anja Groth'a ve Groth laboratuvarına teşekkür ederiz. CPR/reNEW Genomik Platformu personeline destekleri için teşekkür ederiz: H. Wollmann, M. Michaut ve A. Kalvisa. Novo Nordisk Vakfı Kök Hücre Tıbbı Merkezi (reNEW), Novo Nordisk Vakfı'nın NNF21CC0073729 numaralı hibesi tarafından desteklenmektedir. Novo Nordisk Vakfı Protein Araştırmaları Merkezi (CPR), Novo Nordisk Vakfı'nın NNF14CC0001 numaralı hibesi tarafından desteklenmektedir. Novo Nordisk Kök Hücre Tıbbı Merkezi'ndeki (reNEW Copenhag) Brickman laboratuvarına fare ES hücreleri için teşekkür ederiz.

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., Fudenberg, G., Goloborodko, A., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-C+XL%3A+Assaying+chromosome+conformation+from+the+nucleosome+to+the+entire+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-C XL: Assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome.</a> Nature Methods. 13 (12), 1009-1011 (2016).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nucleosome+resolution+chromosome+folding+in+yeast+by+Micro-C%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C.</a> Cell. 162 (1), 108-119 (2015).</li>
<li>Krietenstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+details+of+mammalian+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture.</a> Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).</li>
<li>Hsieh, T. -H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+3D+landscape+of+transcription-linked+mammalian+chromatin+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding.</a> Molecular Cell. 78 (3), 539-553 (2020).</li>
<li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+2.0%3A+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods. 123, 56-65 (2017).</li>
<li>van Holde, K. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Holde%2C+KE+%22Chromatin%22">Chromatin</a>. , Springer. New York, NY. (1989).</li>
<li>Oksuz, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+chromosome+conformation+capture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays.</a> Nature Methods. 18, 1046-1055 (2021).</li>
<li>Lafontaine, D. L., Yang, L., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C+3.0%3A+Improved+protocol+for+genome-wide+chromosome+conformation+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hi-C 3.0: Improved protocol for genome-wide chromosome conformation capture.</a> Current Protocols. 1 (7), 198(2021).</li>
<li>Goloborodko, A., Venev, S., Abdennur, N., Di Tommaso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnylab%2Fdistiller-nf%3B+v033%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Mirnylab/distiller-nf; v033.</a> Zenodo. , (2019).</li>
<li>Venev, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open2c%2Fcooltools%3A+v0.4.1%5BTitle%5D)+AND+%22Zenodo%22%5BJournal%5D)">Open2c/cooltools: v0.4.1.</a> Zenodo. , (2021).</li>
<li>Abdennur, N., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooler%3A+Scalable+storage+for+Hi-C+data+and+other+genomically+labeled+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cooler: Scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays.</a> Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Übelmesser, N., Barbieri, M., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-promoter+contact+formation+requires+RNAPII+and+antagonizes+loop+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Barshad, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II+and+PARP1+shape+enhancer-promoter+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II and PARP1 shape enhancer-promoter contacts.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
<li>Hansen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+classes+of+chromatin+loops+revealed+by+deletion+of+an+RNA-binding+region+in+CTCF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct classes of chromatin loops revealed by deletion of an RNA-binding region in CTCF.</a> Molecular Cell. 76 (3), 395-411 (2019).</li>
<li>Hua, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genome+architecture+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining genome architecture at base-pair resolution.</a> Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).</li>
<li>Downes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+targeted+3C+interrogation+of+cis-regulatory+element+organization+at+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale.</a> Nature Communications. 12, 531(2021).</li>
<li>Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region+capture+Micro-C+reveals+coalescence+of+enhancers+and+promoters+into+nested+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bir Micro-C deneyinin başarısı, protokolde dikkatli bir şekilde yürütülmesi gereken birkaç kritik adıma bağlıdır. İlk olarak, ek çapraz bağlayıcı DSG veya EGS ile çapraz bağlama, hücre tipine bağlı olarak hücrelerin toplanmasına yol açabilir. Çapraz bağlama reaksiyonuna %0.1-%0.5 BSA eklenmesi, çapraz bağlama verimliliğini etkilemeden agregasyonu önemli ölçüde azaltır. Verimsiz çapraz bağlama, rastgele ligasyonların göstergesi olan trans-kromozomal etkileşim oranlarının artmasına neden olabilir. Bu protokoldeki ikinci, ancak en önemli adım, kromatinin MNaz ile sindirilmesidir. Optimal olmayan kromatin sindirimi, verimsiz yakınlık ligasyonuna (aşırı sindirim) veya yakınlık bağlanmamış di-nükleozom oranlarının artmasına (yetersiz sindirim) yol açar. Ligasyon reaksiyonunun etkinliği, agaroz jel elektroforezi ile değerlendirilebilir (Şekil 1B) ve ayrıca en iyi düşük girdili dizileme ile tahmin edilir. Düşük girdi dizilimi, yüksek bir duplikasyon oranı (verimsiz ligasyon) veya artmış di-nükleozom oranları ortaya çıkarırsa, MNaz sindirim derecesi yeniden değerlendirilmelidir. Özellikle, protokol yürütülürken örnek kaybı, kütüphane karmaşıklığının azalmasına neden olabilir. Bir numunenin konsantrasyonu en iyi DNA saflaştırmasından sonra (adım 5.3) veya minimum PCR (adım 8) ile değerlendirilir. DNA saflaştırmasından sonra 5 x 106 memeli hücresinden elde edilen toplam DNA verimi tipik olarak >2 μg'dır. DNA konsantrasyonu, MNase sindirimi, ExoIII sindirimi ve DNA saflaştırmasından sonra kontrol edilmelidir. Bolluğu hücre tipine özgü ve türe özgü olan endojen nükleazlar, DNA bozulmasının bir kaynağı olabilir. Ek olarak, kolon bazlı DNA saflaştırması, deproteinasyon reaksiyonlarından kaynaklanan SDS ile uyumsuzluk nedeniyle numune kaybına yol açabilir. Bu adımda DNA konsantrasyonu düşükse etanol çökelmesi düşünülebilir.
Micro-C, numuneye özgü MNaz titrasyonu gerektirdiğinden, Micro-C'yi çeşitli model organizmalardan alınan küçük organlar, embriyolar ve tek hücreler, organoidler veya hasta biyopsileri gibi küçük hücre popülasyonlarına uygulamak zordur. Burada, Hi-C 3.0, diziye özgü restriksiyon endonükleazları 8,9 ile bir son nokta reaksiyonu kullanan köklü bir alternatif sunar.
Micro-C, yüksek dinamik aralığa ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip, yaygın olarak uygulanabilir yüksek çözünürlüklü bir kromozom konformasyon teknolojisidir, bu da onu özellikle kromozom döngüleri gibi kısa menzilli kromozom özelliklerini 4,5,8 araştırmak için uygun hale getirir. Micro-C'nin çözünürlüğü, Hi-C'nin tespit sınırının ötesinde olan promotör-arttırıcı döngülerin yakalanmasına izin vererek, genom organizasyonu ile düzenleme13,14,15 arasındaki ilişkinin daha ayrıntılı bir analizini verimli bir şekilde sağlar. Ayrıca, DNA yakalama stratejileri, hedeflenen genomik lokusların lokusa özgü çözünürlüğünü benzeri görülmemiş seviyelere çıkarmak için yakın zamanda Micro-C ile birleştirildi ve 3D genomun üst yapısına ilişkin yeni bilgiler ortaya çıktı16,17,18. Özetle, Micro-C ve türevlerinin, 3D genomun transkripsiyonel düzenlemedeki rolünü ve sonuç olarak hücre tipi farklılaşması ve bakımını incelemek için anahtar bir teknoloji olacağını öngörüyoruz.

Micro-C-XL, nükleozom çözünürlüğü ile 3D genom konformasyonunu ölçmek için genom çapında bir tekniktir. Micro-C-XL, 3D genomların nasıl organize edildiğine dair anlayışımızı değiştiren, yaygın olarak kullanılan yakınlık ligasyonu tabanlı Hi-C teknolojisine dayanmaktadır1. Micro-C-XL ve ilk yinelemesi olan Micro-C, başlangıçta Saccharomyces cerevisiae 2,3'te geliştirildi ve daha sonra protokolün kromozom döngüleri ve yalıtım bölgeleri gibi 3D genomun kısa menzilli özelliklerini tespit etmede tam potansiyelini gösterdiği memeli hücre sistemlerine uyarlandı. Bu versiyon, son memeli Micro-C-XL yayınlarınadayanmaktadır 4,5. Micro-C-XL, Micro-C'nin yerini aldığından, Micro-C-XL bundan böyle makalede Micro-C olarak anılacaktır.
Micro-C ve Hi-C6 arasındaki başlıca farklar aşağıdaki gibidir: 1) restriksiyon enzimlerine kıyasla mikrokokal nükleaz (MNaz) ile genom fragmantasyonu ve 2) sadece formaldehite kıyasla reaktif gruplar arasında daha büyük atomik aralığa sahip ek çapraz bağlayıcılar. Her iki adım da, geleneksel Hi-C'ye kıyasla Micro-C'nin geliştirilmiş sinyal-gürültü oranına önemli ölçüde katkıda bulunur. Parçalanma boyutu, yakınlık ligasyonu protokolü sırasında 3B genom organizasyonunun çözümlenebileceği çözünürlüğü sınırlar. MNaz, tercihen erişilebilir DNA'yı sindiren ve nükleozomal korumalı DNA'yı sağlam bırakan bir nükleazdır. MNaz dizilimi kullanılarak nükleozom ayak izi, nükleozomların çoğu ökaryotik genomu tamamen kapsadığını göstermiştir7. Nükleozomlar, türlere ve hücre tipine bağlı olarak ortalama 160-220 bp aralıklarla genom boyunca dağıldığından, MNase, genom mimarisinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için ideal enzimdir.
Micro-C yönteminde formaldehit (FA) ile kombinasyon halinde ek bir çapraz bağlayıcının kullanılması ayrıca sinyal-gürültü oranını 2,8 iyileştirir. Reaktif gruplar arasında daha uzun atomik ara parçalara sahip amine özgü çapraz bağlayıcılar, protein-protein çapraz bağlarını kolaylaştırır. Bunlar tipik olarak sırasıyla 7.7 şve 16.1 şara parçalı diseksinimidil glutarat (DSG) veya etilen glikol bis-süksinimidil süksinat (EGS)'dir. EGS veya DSG yoluyla gürültünün azaltılması, özellikle Micro-C gibi yüksek parçalanma oranlarına sahip deneylerde belirgindir ve muhtemelen rastgele ligasyon olaylarınınhızındaki bir azalma nedeniyle ortaya çıkar 8.
ESG/DSG çapraz bağlama ve çoklu kısıtlama enzim kombinasyonlarını kullanan yakın zamanda geliştirilen bir Hi-C 3.0 protokolü, Hi-C deneylerinde gürültüyü azaltır ve kromozom döngülerinin ve yalıtım bölgelerinintespitini önemli ölçüde iyileştirir 8,9. Yine de, çeşitli etkileşim verileri özelliklerinin site bazında karşılaştırılması, Micro-C'nin hem Hi-C 3.0 hem de geleneksel Hi-C8'e kıyasla kromozom döngüleri ve yalıtım bölgeleri gibi kısa menzilli özelliklerin daha iyi algılandığını buldu. Bununla birlikte, Hi-C 3.0, kısa menzilli özelliklerin tespitini iyileştirir ve geleneksel Hi-C'ye kıyasla genom bölümlendirmesinin güçlü bir şekilde algılanmasını sağlar. Özetle, bir kromozom konformasyonu yakalama yönteminin seçimi, nesnel ve biyolojik soru tarafından belirlenmelidir.
Burada, 3D genom organizasyonunu çözebilecek başarılı Micro-C deneyleri için adım adım bir protokol sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>1 mM Biotin dATP</td><td>Jenna Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Bio14-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mM Biotin dCTP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-809-BioX-S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>NEB</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0443S</td><td></td></tr><tr><td>10 U/ml T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>100 U/L Eksonükleaz III</td><td>NEB</td><td>M0206L</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td><td>NEB</td><td>B7001S</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA Ligaz tamponu&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS, Mg2+ ve Ca2+</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>1x LIF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2_Mercaptoethanol 50 mM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>0.1 mM b-merkaptoetanol ve nbsp;</td></tr><tr><td>% 37 Formaldehit&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td>Dikkat. Bkz. MSDS</td></tr><tr><td>400 U/ml T4 DNA Ligaz üretmektedir&</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>5 U/ml Klenow Parçası</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>BIO-RAD</td><td>1613102</td><td>Dikkat. Bkz. MSDS</td></tr><tr><td>BSA 20mg / ml</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl üretmektedir < alt > 2< / alt></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hücre sayacı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Dikkat. MSDS</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıs</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>üretmektedir: 1.5 ml tüpler için mıknatıs</td></tr><tr><td>mıknatıs DynaMag-PCR Mıknatıs</td><td>Invitrogen</td><td>492025</td><td>şu şekilde anılır: PCR tüpleri için mıknatıs</td></tr><tr><td>mıknatıs EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0</td><td>BioWorld</td><td>40121266-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol% 96 & nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>20824365</td><td>kalite kontrol sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>Etidyum Bromür&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol bis (süksinimidil süksinat) (EGS)</td> <td>ThermoFisher</td><td>21565</td><td></td></tr><tr><td>Fetl Bovin Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>%15 FBS</td></tr><tr><td>Jel Yükleme boyası mor (6X)</td> <td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glisin&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteinaz inhibitörü (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>78430</td><td>Dikkat. Bkz. MSDS üretmektedir</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>18896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 1 M</td><td>İnvitrojen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokokal Nükleaz (MNase)</td> <td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>fare embriyonik kök hücreleri&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina için NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multipleks Oligos (Çift İndeksli primerler)</td><td>Dizileme</td> kitaplıkları için NEB <td>E7600S</td><td>amplifikasyon primerleri</td></tr><tr><td>Illumina için NEBNext Ultra II DNA kütüphanesi hazırlık kiti</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>dizileme kütüphanesi hazırlama kiti ve nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master karışımı&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0544S</td><td>Dikkat. Bkz. MSDS</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>1x NEAA</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td> <td>Gibco</td><td>üretmektedir 15140148</td><td>%1 Pen-Strep</td></tr><tr><td>Proteinaz K (40 mg/ml)</td><td>GoldBio</td><td>P-480-1</td><td>Dikkat. MSDS</td></tr><tr><td>QIAquick Jel ekstraksiyon kiti</td><td>QIAgen</td><td>28706'nın</td><td>şu şekilde anıldığına bakın: DNA jel elüsyon kiti&nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR saflaştırma kiti</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>şu şekilde anılır: ticari DNA saflaştırma kiti&nbsp;</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Test kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>yüksek hassasiyetli DNA miktar tayin cihazı&nbsp;</td></tr><tr><td>Hızlı yükleme mor 1kb artı DNA Merdiveni</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect boyut seçimi boncukları</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23319</td><td>paramanyetik boncuklar ve nbsp;</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>5382000015 şu şekilde anılır: termomikser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf %10 SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf Fenol Kloroform İzoamil Alkol (PCI)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Parça Analizörü</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

memeli 3d genom etkileşimlerinin micro-c-xl ile haritalanması

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

Üç boyutlu (3D) kromozom organizasyonu, genom regülasyonunda ve hücre tipi spesifikasyonunda önemli bir faktördür. Örneğin, güçlendiriciler olarak bilinen cis-düzenleyici elemanların, 3B uzayda etkileşim yoluyla distal promotörlerin aktivitesini düzenlediği düşünülmektedir. Hi-C gibi genom çapında kromozom konformasyonu yakalama (3C) teknolojileri, genomların hücrelerde nasıl organize edildiğine dair anlayışımızı değiştirdi. 3B genom organizasyonunun mevcut anlayışı, kromozomların 3B uzaydaki topolojik organizasyonunun çözülebileceği çözünürlükle sınırlıdır. Micro-C-XL, kromozom konformasyonu yakalama protokolü sırasında genomları parçalamak için mikrokokal nükleaz (MNaz) kullanarak, kromatinin temel birimi olan nükleozom seviyesinde çözünürlükle kromozom katlanmasını ölçer. Bu, ölçümlerde gelişmiş bir sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanır, böylece diğer genom çapında 3D teknolojilere kıyasla yalıtım bölgelerinin ve kromozom döngülerinin daha iyi tespit edilmesini kolaylaştırır. Bu makalede, memeli hücrelerinden yüksek kaliteli Micro-C-XL örnekleri hazırlamak için görsel olarak desteklenen, ayrıntılı, adım adım bir protokol sunulmaktadır.

Mikro-C kütüphanelerinin başarılı bir şekilde hazırlanması, protokolün birkaç adımında değerlendirilebilir. En önemli adım, uygun bir MNase sindirim derecesinin seçilmesidir. Bu nedenle, MNaz konsantrasyonu, her numune için di-nükleozomlar üzerinde tutarlı bir şekilde p-90 mono-nükleozom verecek şekilde titre edilmelidir. Kromatin sindiriminin eu- ve hetero-kromatin için farklı olduğuna ve MNaz'ın heterokromatini daha az verimli bir şekilde sindirdiğine dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, optimal sindirim derecesi, ilgilenilen kromatin bölgesine ve incelenen hücre tipine bağlıdır, çünkü eu- ve hetero-kromatinin nispi oranı hücre tipine özgüdür. Bu nedenle, gerekli MNaz konsantrasyonunun dikkatli bir şekilde titre edilmesi ve önce Micro-C deneyinin başarısının düşük girdi dizilimi ile değerlendirilmesi tavsiye edilir.
Azalan miktarlarda MNaz ile muamele edilen kromatinin tipik bir MNaz titrasyon modeli Şekil 1A'da gösterilmektedir. Burada, reaksiyon başına 250.000 hücreden elde edilen kromatin, MNaz'ın dört kat seyreltilmesiyle sindirilir. En yüksek konsantrasyon (10 U MNase, Lane 2), neredeyse sadece mono-nükleozomal DNA'dan (~ 150 bp) oluşan aşırı sindirilmiş kromatini gösterir. Özellikle, mono-nükleozomal bandın merkezi, nükleozomal DNA'nın aşırı sindirimini gösteren, azaltılmış MNaz konsantrasyonlarına sahip numunelerdeki karşılık gelen bantlara kıyasla agaroz jelde daha düşük çalışır. Aşırı sindirilmiş nükleozomlar, yakınlık ligasyon reaksiyonunda verimsiz bir şekilde bağlanır; bu nedenle, Şerit 2'deki örnek, Micro-C deneyleri için yetersizdir. Şerit 3 (2,5 U MNase), Micro-C deneyleri için neredeyse uygun bir sindirim derecesi gösterir. Burada, mono-nükleozomal bant baskın türdür ve aşırı sindirilmiş nükleozomların göstergesi olan subnükleozomal yayma azalır; Ancak, hala mevcuttur. Şerit 4'teki sindirim derecesi (0,635 U MNaz), bu titrasyon örneğinde bir Micro-C deneyi için ideal bir koşuldur. Sub-nükleozomal DNA'sı olmayan berrak bir mono-nükleozomal bant mevcuttur. Mono- ve di-nükleozom DNA'sı için bant yoğunluğu hemen hemen eşittir, bu da f veya daha yüksek bir mono-nükleozom verimini gösterir. Di-nükleozomal DNA'nın, mono-nükleozomal DNA'nın yaklaşık iki katı büyüklüğünde olduğunu (~320 bp'ye karşı ~150 bp), bu nedenle DNA'nın molü başına bant yoğunluğunun, mono-nükleozomal muadili ile karşılaştırıldığında iki kat daha yüksek olduğunu belirtmekte fayda var. Şerit 5'teki sindirim derecesi (0.156 U MNaz), neredeyse hiç nükleozomal DNA içermeyen yetersiz sindirilmiş kromatin gösterir ve bu nedenle bu, optimal olmayan bir numuneyi temsil eder.
Sonuç olarak, bu örnekte, 2.5 x 10 5 fare ES hücrelerinin 0.625 U MNaz ile sindirimi (200 μL'de 1 x 106 hücre için2.5 U MNaz'a karşılık gelir), Mikro-C deneylerinde hazırlayıcı sindirimler için en umut verici başlangıç noktasını sunar. Bununla birlikte, Şerit 3 ve Şerit 4'teki numuneler için kullanılan koşullar arasında bir ara MNaz konsantrasyonu (200 μL'de 1 x 106 hücre için 5 U MNaz'a karşılık gelir) de dikkate alınmalıdır. Daha da önemlisi, MNaz ile kromatin sindirimi doğrusal olarak ölçeklendirilemez ve hazırlayıcı sindirimin 4 kattan fazla yükseltilmesi önerilmez. 1 x 10 6 hücreden daha fazla Mikro-C kütüphaneleri hazırlamak için, kromatinin 1 x 106 hücreli alikotlarda sindirilmesi ve MNaz inaktivasyonundan sonra havuzlanması tavsiye edilir.
Yakınlık ligasyon protokolünün başarısını değerlendirmek için, MNaz ile sindirilmiş ve yakınlık bağlanmamış (adım 3.8) giriş kontrolü, yakınlık bağlanmış numune (adım 5.3) ile %1.5 agaroz jel elektroforezi ile karşılaştırılmalıdır (Şekil 1B). Yakınlık bağlı mono-nükleozom bandı, di-nükleozomlarınkine benzer şekilde yaklaşık 300 bp'lik bir boyuta sahiptir. Bu nedenle, mono- ila dinükleozomal bant sinyal oranı, ağırlıklı olarak mono-nükleozomlardan (Şerit 1) di-nükleozomlara (Şerit 3 ve Şerit 4) doğru kaymalıdır. Bu adımdaki agaroz jel, eksize edilen ve saflaştırılan di-nükleozomal DNA olduğundan, aşırı yüklemeyi önlemek için numunelerin birden fazla şeride bölünmesi tavsiye edilir.
Hazırlanan dizileme kütüphanesinin nitelik ve niceliğinin minimal PCR ile değerlendirilmesi önerilir. Burada, 1 μL boncuktan (toplam numunenin 1/20'si) alınan DNA, 10 μL PCR reaksiyonunda 16 döngü için amplifiye edilir. Minimal PCR kütüphanesinin toplam konsantrasyonu, 16 PCR döngüsünden sonra tipik olarak 50-500 ng arasında değişir. Teorik olarak, bu, 16 döngü için de amplifiye edilmişse, kalan 19 μL numuneden 1-10 μg'lık bir kütüphaneye karşılık gelir. Toplam DNA'dan yaklaşık 100 ng'lik bir kütüphane oluşturmak için gereken minimum PCR döngüsü sayısının kullanılması önerilir. PCR'de logaritmik amplifikasyon varsayıldığında, 16 döngüde 19 μL girişinden elde edilen DNA'nın teorik konsantrasyonu, 100 ng'lik bir kütüphane oluşturmak için gereken PCR döngülerinin sayısını hesaplamak için art arda ikiye bölünebilir. Örneğin, 16 döngüden sonra 1 μL'den 100 ng'lik bir verim, 19 μL'den amplifiye edilmiş 1.900 ng'lik bir verime karşılık gelir. Bu senaryoda, 12 döngü ideal olarak toplam DNA'dan 118 ng'lik bir dizileme kütüphanesi oluşturmalıdır (1.900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). Minimal PCR'den kalan 9 μL numune daha sonra agaroz jel elektroforezi ile kütüphanenin kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir (Şekil 1C). Görselleştirme, 420 bp'de ayrı bir bant göstermeli ve adaptör dimerleri (120 bp) için bant göstermemelidir. Daha küçük fragmanlar da görünebilir ve bunlar kullanılmayan PCR primerlerine karşılık gelir.
Daha sonra, kaynak yoğun derin dizilemeye geçmeden önce düşük girdili dizileme ile başarılı Micro-C numune hazırlamanın analiz edilmesi ve onaylanması önerilir. Tipik olarak, kitaplıklar 5 x 106 ila 1 x 107 okuma derinliğine göre sıralanır ve aşağıdaki kriterlere göre değerlendirilir: sıralama okuma çoğaltma oranı, cis- ve trans-kromozomal etkileşim hızı ve sıralama okuma oryantasyon frekansı. Micro-C kitaplıkları, okuma dosyalarını (Fastq formatı) sıralamadan okuma çiftleri dosyalarına (Bedpe formatı) ve ölçeklenebilir etkileşim matrislerine (Cool ve Mcool formatları) kadar verileri işleyen tam hizmetli bir boru hattı olan Distiller ile işlenir ve soğutucu, pairtools ve cooltools10,11,12. İşlem hattı ayrıca Micro-C kitaplıklarının10 (https://github.com/open2c/distiller-nf) kalitesini değerlendirmek için ideal olan bir özet dosyası oluşturur. PCR çoğaltma oranı, sıralama kitaplığı karmaşıklığı hakkında bilgi sağlar ve oluşturulan *.stats dosyasından çıkarılabilir. Yüksek kaliteli Micro-C kitaplıkları, 5 milyon veya daha fazla hücreden oluşturulduğunda %5-10'dan daha az PCR çoğaltma oranlarına sahiptir. Özellikle, bazı dizileme platformları, dizileme kitaplığının karmaşıklığından bağımsız olarak küme oluşumu sırasında PCR kopyaları üretir. Şekil 2A, iki deneyin nispi çoğaltma oranlarını göstermektedir: biri iyi bir örnek ve diğeri kötü bir örnek olarak kabul ediyoruz. Bu örnekte, her iki örnek de kabul edilebilir harita hızlarını görüntüledi. Micro-C kütüphanelerinin kalitesini değerlendirmek için bir sonraki kriter, cis-trans oranı ve okuma oryantasyon frekanslarıdır. Çekirdek içinde, kromozomlar bireysel kromozom bölgelerinde yaşar ve bu nedenle nadiren diğer kromozomlarla etkileşime girer. Tespit edilen trans-kromozomal etkileşimlerin yüksek oranı, yüksek oranda rastgele ligasyonları gösterir. Bu analiz seviyesinde, kötü numunenin, iyi numuneye kıyasla yüksek oranda trans-kromozomal etkileşim gösterdiğine dikkat edilmelidir (Şekil 2B). Micro-C için,% 70 veya daha yüksek bir cis-kromozomal etkileşim oranı arzu edilir.
Bir Mikro-C kütüphanesi, yakınlık bağlı numune ile birlikte saflaştırılabilen ve deneyi kontamine edebilen di-nükleozomal DNA bandına benzer bir parça boyutuna sahiptir. Bu kirleticiler her zaman cis-kromozomal etkileşimlerdir. Bu nedenle, okuma oryantasyon oranlarını da değerlendirmek önemlidir. Di-nükleozomal kontaminasyon oranı, düşük girdi dizileme ile tahmin edilebilir. Di-nükleozomal DNA, MNaz tarafından parçalanmamış iki komşu nükleozomdan kaynaklanır. Böylece, ortaya çıkan sıralama okumaları her zaman bir ileri-geri okuma yönü (F ve R) gösterecek ve okuma çiftleri arasındaki mesafe yaklaşık 320 bp olacaktır. Yakınlık bağlanmış fragmanlar, karşılaştırıldığında, ideal olarak eşit bollukta F-R, R-R, R-F ve F-F ile okuma çiftleri verecek şekilde dört yönde bağlanabilir (Şekil 2C). Ek olarak, iki okuma çifti arasında çeşitli mesafeler gösterirler. Di-nükleozomal kirleticilerin miktarını tahmin etmek için, okuma yönelimlerinin sıklığı, damıtıcı tarafından oluşturulan *stats dosyalarından hesaplanabilir (Şekil 2D). Özellikle, bu çalışmada, F-R okumalarının oranı (kırmızı) kötü örnekte iyi örneğe kıyasla daha yüksekti ve bu, okuma yönelimleri mesafeye göre tabakalandırıldığında daha belirgin hale geldi (Şekil 2E). Okuma çiftleri &lt;562 bp veya ≥562 bp mesafeli okumalar halinde tabakalandırıldığında, FR fraksiyonuna Micro-C kütüphanelerine kıyasla di-nükleozomal fragmanlar hakimdir. Burada, &lt;562 bp mesafeli okumaların fraksiyonuna F-R okumaları hakimdir, oysa ≥562 bp mesafeli fraksiyon, dört olası yönelim arasında eşit bir dağılım gösterir, bu da F-R okumalarının küresel aşırı temsilinin di-nükleozomal kirleticilerden kaynaklandığını gösterir. Alt kümeleme eşiği olarak 562 bp seçimi, oluşturulan *stats dosyasındaki gruplama tarafından tanımlanır. Bu kalite kontrol için gerekli olmasa da, damıtıcı tarafından da oluşturulan *pairs dosyasından mesafeler çıkarılarak daha tanımlanmış alt kümeleme elde edilebilir. Di-nükleozomal okumaların, veri işleme sırasında tanımlanabilecekleri ve göz ardı edilebilecekleri için Micro-C numunesinin kalitesini düşürmediğine dikkat etmek önemlidir. Ancak, 3D etkileşimler hakkında değerli bilgiler içermezler ve bilgilendirici okumaları sulandırırlar.
Bu nedenle, dikkatli MNase titrasyonu ve düşük girdili dizileme ile kapsamlı kalite kontrolü, Micro-C deneylerinin kalitesini optimize etmek için en iyi araçlardır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig01.jpg"> Şekil 1: Micro-C protokolünün ara aşamaları . (A) Değişen MNaz konsantrasyonları ile sindirilen 2.5 x 105 fare ES hücrelerinden kromatinin agaroz jel elektroforezi. Mono-, di- ve tri-nükleozomal bantlar oklarla gösterilir. M: DNA merdiveni (Şerit 1/6); 250.000 hücre başına 10 U MNaz (Şerit 2); 250.000 hücre başına 2.5 U MNaz (Şerit 3); 250.000 hücre başına 0.625 U MNaz (Şerit 4); 250.000 hücre başına 0.156 U MNaz (Şerit 2). (B) Micro-C ile hazırlanan numunelerin (Şerit 3 ve Şerit 4) %1.0 agaroz jel elektroforezi ve MNase sindirilmiş giriş kontrolü (Şerit 1). Şerit 1 ve Şerit 2 (M: DNA merdiveni), mono- ila di-nükleozomal fragman yoğunluğundaki nispi değişimi vurgulamak için geliştirilmiştir. Mono- ve di-nükleozomal bantlar oklarla gösterilir. Yakınlık bağlanmış numunedeki di-nükleozomal bant, di-nükleozomal ve Micro-C kütüphane DNA'sını birleştirir. (C) Kaliteyi değerlendirmek için 1 μL numuneden amplifiye edilen Micro-C dizileme kitaplıklarının% 1.0 agaroz jel elektroforezi. Şerit 1 (M): DNA merdiveni; Şerit 2 (S): Mirco-C kütüphanesi. (D) Son Micro-C kütüphanesinin Fragment Analyzer izi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig02.jpg"> Şekil 2: İyi bir numunenin ve kötü bir numunenin düşük girdili sıralaması için numune istatistikleri. (A) Eşlenen (yeşil) ve eşlenmemiş (kırmızı) okuma yüzdesinin çubuk grafiği. (B) Cis ve kromozomal ötesi etkileşimleri haritalayan okumaların normalleştirilmiş fraksiyonu. Veri kümeleri cis-mapping okumasına normalleştirildi. Cis-eşleme okumaları, eşleştirilmiş uçlu dizilenmiş örneklerin birinci ve ikinci okumaları arasındaki mesafeye göre katmanlandırıldı: ≤1 kbp (sarı), &gt;1 kbp ve ≤10 kbp (turuncu) ve &gt;10 kbp (kırmızı). (C) Di-nükleozomal boyutlara sahip potansiyel moleküler türlerin şeması. (D) İyi numunenin ve kötü numunenin tüm okumalarının okuma çifti yönelimlerinin yüzdeleri. (E) Panel (D) ile aynıdır, ancak mesafelere göre katmanlandırılmıştır (sol, &lt;562 bp ve sağ, ≥562 bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bileşen</td>
			<td>1 adet</td>
			<td>4,4 kat</td>
		</tr><tr><td>10 adet NEBuffer 2.1,</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>2 μL 100 mM ATP</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>8,8 μL</td>
		</tr><tr><td>100 mM DTT</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>68 μL</td>
			<td>299,2 μL</td>
		</tr><tr><td>10 U/μL T4 PNK</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>Toplam</td>
			<td>90 μL</td>
			<td>396 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Micro-C ana karışımı 1. Son çiğneme reaksiyonu için ana karışımın bileşimi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bileşen</td>
			<td>1 adet</td>
			<td>4,4 kat</td>
		</tr><tr><td>1 mM Biotin-dATP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>1 mM Biotin-dCTP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>10 mM dTTP ve dGTP karışımı</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>4,4 μL</td>
		</tr><tr><td>10x T4 DNA Ligaz Tamponu</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>200 adet BSA</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>1,1 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>23,75 μL</td>
			<td>104,5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Micro-C ana karışımı 2. Son etiketleme reaksiyonu için ana karışımın bileşimi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bileşen</td>
			<td>1 adet</td>
			<td>4,4 kat</td>
		</tr><tr><td>10x NEB T4 Ligaz reaksiyon tamponu</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>220 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>422,5 μL</td>
			<td>1859 μL</td>
		</tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>110μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Micro-C ana karışımı 3. Yakınlık ligasyon reaksiyonu için ana karışımın bileşimi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bileşen</td>
			<td>1 adet</td>
			<td>4,4 kat</td>
		</tr><tr><td>10 adet NEBuffer 1.1</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>88 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>792 μL</td>
		</tr><tr><td>ExoIII nükleaz</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 4: Micro-C ana karışımı 4. Biyotin giderme reaksiyonu için ana karışımın bileşimi.

Genom çapında kromozom konformasyon yakalama yöntemi Micro-C-XL kullanılarak üç boyutlu genom organizasyonunu nükleozom çözünürlüğü ile haritalamak için bir protokol burada sunulmaktadır.

Memeli 3D Genom Etkileşimlerinin Micro-C-XL ile Haritalanması

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

Bu protokol, yüksek çözünürlüklü kromozom döngüleri ve diğer kısa menzilli etkileşim özelliklerini gösterdiği için önemlidir. Bu tekniğin ana avantajı, 3D genom organizasyonunun yüksek sinyal-gürültü oranına sahip nükleozom çözünürlüğü ile haritalanmasıdır. MNase titrasyonunu gerçekleştirmek için, bir kez 10'luk bir peleti 10 dakika boyunca buz üzerinde altıncı hücreye çözün ve hücreleri 500 mikrolitre DPBS'de yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.Hücreleri, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı çıkarın. Peletlenmiş hücreleri 500 mikrolitre MB Number one tamponunda yeniden süspanse edin. Mikrolitre MNaz başına 20 birimlik bir şişeyi çözdürün ve metinde tarif edildiği gibi sindirim koşulları için 10 milimolar Tris ile seyreltin.10 ila 20 saniyelik uygun zaman aralıklarıyla, dört numunenin tüplerinden birine ilk MNase sindirim çözeltisinden bir mikrolitre ekleyin, girdap yapın ve bir ThermoMixer'da 37 santigrat derecede 800 RPM'de 10 dakika inkübe edin. Kalan MNaz dilüsyonlarından bir mikrolitreyi diğer hücre alikotlarına eklemeye devam edin. Her tüpe 200 mikrolitre taze hazırlanmış durdurma tamponu ekleyerek MNase sindirimini aynı sırayla ve MNase'ın eklendiği aynı zaman aralığında durdurun.65 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Her örneğe 500 mikrolitre PCI ekleyin ve vorteksleme yaparak iyice karıştırın. Fazları ayırmak için oda sıcaklığında beş dakika boyunca 19.800 G'de santrifüjleyin.Ve sulu fazı yeni tüplere aktarın. Üreticinin talimatlarına göre ticari bir DNA saflaştırma kiti kullanarak DNA'yı saflaştırın ve numuneleri 12 mikrolitre elüsyon tamponunda elüte edin. Saflaştırılmış DNA örneğine iki ila beş mikrolitre yükleme boyası ekleyin.Numuneleri %1.5'lik bir agaroz jel üzerinde çalıştırın ve deney için en iyi sindirim derecesini seçin. Optimal bir sindirim derecesi, çok az veya hiç subnükleozomal fragman göstermez veya hiç göstermez ve% 70 ila 90 mono / dinükleozom oranı. Bu temsili örnekte, takip deneyleri için üçüncü ve dördüncü şeritler arasında bir ara sindirim derecesi seçildi.MNase titrasyonuna dayanarak, her numune alikotuna uygun miktarda MNaz ekleyerek kromatini sindirin. İyice karıştırın ve ThermoMixer'da 37 santigrat derece, 800 RPM'de 10 dakika inkübe edin. Her bir alikot için 1,6 mikrolitre 0,5 molar EGTA ekleyerek MNase sindirimini durdurun ve bir ThermoMixer'da 65 santigrat derecede 10 dakika boyunca 800 RPM çalkalayarak inkübe edin.Numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyerek toplayın ve süpernatanı atın. Hücre peletini 500 mikrolitre 1X NEB tamponu 2.1 içinde yeniden süspanse edin. Daha sonraki işlemler için beş kez 10 ila altıncı hücreye veya daha azına eşdeğer bir girdiye eşdeğer havuz örnekleri.Yakınlık ligasyonuna geçmeden önce, MNase sindirim seviyesini izlemek için numunenin %10'unu giriş kontrolü olarak aktarın. Sindirim kontrolüne 150 mikrolitre 10 milimolar Tris, 25 mikrolitre% 10 SDS ve mililitre proteinaz K başına 25 mikrolitre 20 miligram ekleyin ve gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Kalan numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.Peletleri 90 mikrolitre taze hazırlanmış Micro-C ana karışımında tekrar süspanse edin ve bir ThermoMixer'da 37 santigrat derece, 800 RPM'de 15 dakika inkübe edin. Mikrolitre Klenow parçası başına 10 mikrolitre beş birim ekleyin ve bir ThermoMixer'da inkübe edin. Daha sonra 100 mikrolitre taze hazırlanmış Micro-C master mix iki ekleyin.25 santigrat derece, 800 RPM'de 45 dakika inkübe edin ve metinde açıklandığı gibi EDTA ile enzimatik reaksiyonu söndürün. Bir Termo Mikserde 65 santigrat derece, 800 RPM'de 20 dakika inkübe edin. Numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.Numuneyi 500 mikrolitre taze hazırlanmış Micro-C ana karışım üç içinde tekrar süspanse edin ve oda sıcaklığında 15 ila 20 RPM'de 2,5 saat inkübe edin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra numuneyi 200 mikrolitre taze hazırlanmış Micro-C ana karışım dörtlüsünde yeniden süspanse edin ve 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ThermoMixer'da 800 RPM'de 15 dakika inkübe edin.Ters çapraz bağlama ve deproteinasyon için, numuneye mikrolitre proteinaz K başına 25 mikrolitre 20 miligram ve 25 mikrolitre% 10 SDS ekleyin ve aralıklı karıştırma ile gece boyunca 65 santigrat derecede inkübe edin. Örneklere ve giriş kontrolüne 500 mikrolitre PCI ekleyin, ardından vorteksleme ile karıştırın. Fazları beş dakika boyunca 19.800 G'de santrifüjleyerek ayırın ve üst sulu fazı taze bir tüpe aktarın.DNA'yı konsantre edin ve örnekleri 30 mikrolitrede elüte edin ve giriş kontrolleri 15 mikrolitrede kontrol eder. Mononükleozomları ve dinükleozomları ayırmak için% 1.5 agaroz jeli çalıştırın. Dinükleozomal boyuta sahip DNA parçalarını kesin ve metinde açıklandığı gibi DNA'yı çıkarın.Numunenin 150 mikrolitresine 150 mikrolitre önceden hazırlanmış boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında inkübe edin. Tüpleri uygun bir mıknatısa yerleştirin ve çözelti temizlenene kadar bekleyin. Süpernatanı çıkarın ve boncukları 300 mikrolitre 1X TBW'de yeniden süspanse edin ve bu adımı tekrarlayın.Manyetik ayırmayı tekrarlayın ve çözelti temizlendikten sonra, süpernatanı çıkarın ve boncukları 100 mikrolitre 0.1X TE içinde yeniden süspanse edin. 50 mikrolitre 0.1X TE içinde tekrarlayın ve tekrar süspanse edin. Çözeltiyi PCR tüplerine aktarın ve metinde açıklandığı gibi DNA manipülasyonunu gerçekleştirin. Adaptör ligasyonu tamamlandıktan sonra, numuneyi 1X TBW'de yıkayın, süpernatanı atın ve boncukları 20 mikrolitre 0.1X TE'de yeniden süspanse edin. PCR döngülerinin sayısını optimize edin ve metinde açıklandığı gibi dizi kitaplıklarını yükseltin. Reaksiyon başına 250.000 hücreden elde edilen kromatin, MNaz'ın dört kat seyreltilmesiyle sindirildi.En yüksek konsantrasyon olan 10 birim, neredeyse tamamen mononükleozomal DNA'dan oluşan aşırı sindirilmiş kromatin gösterdi. 250.000 fare ES hücresinin 0.625 birim MNaz ile sindirimi, Micro-C deneylerinde hazırlayıcı sindirimler için en umut verici başlangıç noktasını sundu. Bununla birlikte, 1 milyon hücre başına beş birime karşılık gelen üçüncü ve dördüncü şeritlerde gösterilen koşullar arasında bir ara MNaz konsantrasyonu dikkate alınmalıdır.Yakınlık bağlı mononükleozom bandı, dinükleozomlarınkine benzer şekilde yaklaşık 300 baz çifti boyutuna sahipti. Bu nedenle, mono ila dinükleozomal bant sinyal oranı, ağırlıklı olarak mononükleozomlardan dinükleozomlara doğru kaymıştır. Hazırlanan dizileme kütüphanesinin kalitesi ve miktarı minimal PCR ile değerlendirildi.Görselleştirme, 420 baz çiftinde ayrı bir bant gösterdi ve adaptör dimerleri için bant yoktu. Bu çalışmadaki her iki örnek de yüksek harita oranları sergilerken, iyi örneklem daha yüksek bir cis okuma oranına sahipti. Transkromozomal etkileşimlerin yüksek bir oranı, rastgele ligasyon olaylarını gösterir, ancak bazı transkromozomal etkileşimler önemli olabilir.Ek olarak, iyi örnek, 500 baz çiftinden daha az mesafelere sahip, orta düzeyde bir ileri-geri eşleme okuma çifti oranına sahipti. Bu, iki yakınlık bağlı nükleozoma benzer bir boyuta sahip olan MNaz tarafından parçalanmayan düşük bir dinükleozom oranını gösterdi. Bu deney için uygun bir MNaz sindirim derecesi çok önemlidir.Aşırı sindirilmiş nükleozomlar verimsiz bir şekilde bağlanır ve az sindirilmiş kromatin, dizileme kitaplığını kirletebilecek büyük bir sindirilmemiş dinükleozom fraksiyonuna sahiptir. Micro-C, lokusa özgü genom organizasyonunu son derece yüksek çözünürlükle haritalamak için bir yakalama yaklaşımıyla birleştirilebilir.

mapping-mammalian-3d-genome-interactions-with-micro-c-xl

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hi-C yöntemi kromatin etkileşimler (1) tarafsız, genom kimlik sağlar. Hi-C çiftler yakınlık ligasyonu ve güçlü paralel sıralama. Ortaya çıkan veriler farklı ölçeklerde genomik mimarlık eğitimi için kullanılabilir: ilk sonuçlar, kromozom toprakları, segregasyon, açık ve kapalı kromatin ve megabase ölçekte kromatin yapısı gibi özellikleri tespit.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Ilişkili kromozom tuzak (ACT) tayini uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için bir romanı tarafsız bir yöntemdir. Uzun menzilli DNA etkileşimleri karakterizasyonu gen ekspresyonu normal fizyoloji hem de hastalıklı devletlerin nükleer mimari ilişkiyi belirlemek için izin verecektir.

Uzun menzilli DNA Etkileşimleri belirlenmesi için İlişkili Kromozom Tuzak

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Genom hedefleme moleküllerinin doğrudan hedefleri belirlenmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. DNA bağlama molekülleri genomu meşgul anlamak için, kromatin izole etmek için küçük moleküllerin çapraz bağlama dayanan bir yöntem (COSMIC) geliştirdi.

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

Bu eser bir protokolünü açıklar yüksek çözünürlüklü in situ Hi-C kitaplıklardan nesil sıkıca öncesi gastrulasyon Drosophila melanogaster sahnelenen için embriyo.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

3D çok renkli DNA FISH, 3B korunmuş çekirdekler içinde birden fazla genomik loci görselleştirmek için bir araç temsil eder, kesin olarak tek bir hücre düzeyinde nükleer alan içinde karşılıklı etkileşimleri ve lokalizasyon tanımlayan. Burada, adım protokol bir adım insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede için açıklanmıştır.

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

Genom genelinde protein bağlayıcı yerlerin kesin olarak belirlenmesi gen düzenlemesini anlamak için önemlidir. Burada kromatin-immünprecipitated DNA'yı exonuclease sindirimi (ChIP-exo) ve ardından yüksek verimli dizilim ile tedavi eden bir genomik haritalama yöntemini açıklıyoruz. Bu yöntem, memeli nöronlarında yakın baz çifti haritalama çözünürlüğü ve yüksek sinyal-gürültü oranı ile protein-DNA etkileşimlerini tespit eder.

Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo) Kullanılarak Fare Kök Hücre Türevi Nöronlarda Protein-DNA Etkileşimlerinin Yüksek Çözünürlüklü Haritalanması

Hi-C 3.0, sinyal-gürültü oranını ve kromatin etkileşimi algılamasının çözünürlüğünü artırmak için formaldehit ve dissüksinimidil glutarat çapraz bağlayıcılarını DpnII ve DdeI kısıtlama enzimlerinin bir kokteyli ile birleştiren geliştirilmiş bir Hi-C protokolüdür.

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Burada, kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin lisans katılımı ve öğrenimine vurgu yaparak ayrıntılı olarak bir adaptasyonunu sunuyoruz.

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Öğrenin, memeli hücrelerinde Micro-C-XL tekniğiyle nükleozom çözünürlüğünde 3D genom etkileşimlerini haritalamayı. Bu yöntem, kromatin yapısı ve gen regülasyonu çalışmaları için yüksek sinyal-gürültü oranı sağlar.

Memeli 3D Genom Etkileşimlerinin Micro-C-XL ile Haritalanması

Daha fazla video keşfet