Name: S. cerevisiaede Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Öğrenin, S. cerevisiae'de mayozu incelemek için hızlandırılmış mikroskopi ve aşamaya özgü protein nükleer tükenmesi yöntemini. Bu teknik, kromozom ayrışmasındaki protein fonksiyonlarını belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Indiana Üniversitesi Işık Mikroskobu Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (GM105755) bir hibe ile desteklenmiştir.

<ol><li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC%2FC+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li>
<li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).</li>
<li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+entry+into+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDT80%2C+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li>
<li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li>
<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anchor-away+technique%3A+rapid%2C+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li>
<li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19%28CCAN%29+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li>
<li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+kinetochore+protein%2C+Ctf19+in+meiosis+I%3A+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li>
<li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19%2C+Mcm21%2C+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li>
<li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctf19p%3A+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li>
<li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor%2C+Csm3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).</li>
<li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipl1%2FAurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li>
<li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).</li>
<li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li>
<li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li>
<li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Bu protokol, hücreleri senkronize etmek için NDT80-in sistemini, çekirdekten proteinleri tüketmek için çapa uzaklaştırma tekniğini ve mayoz sırasında tomurcuklanan maya hücrelerini görüntülemek için floresan hızlandırılmış mikroskopiyi birleştirir. NDT80-in sistemi, bir faz I tutuklaması ve 4,8'i serbest bırakan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için bir yöntemdir. Her ne kadar bireysel hücreler sonraki mayotik aşamaların her birinde harcana...

Hızlandırılmış floresan mikroskobu, tomurcuklanan maya 1,2'deki mayotik kromozom ayrışmasının dinamiklerini incelemek için değerli bir araçtır. Tomurcuklanan maya hücreleri, temel besin maddelerinin açlığı yoluyla mayoza uğramaya teşvik edilebilir3. Mayoz sırasında, hücreler bir tur kromozom ayrışmasına ve ardından sporlara paketlenmiş dört mayotik ürün oluşturmak için iki bölüme ayrılır (Şekil 1). Bireysel hücreler, mayozun her aşamasında görselleştirilebilir, bu da sabit hücreli görüntüleme ile kolayca kaçırılabilecek uzamsal ve zamansal veriler üretir. Bu protokol, hızlandırılmış floresan mikroskopisinin daha önce kurulmuş iki yöntemle, indüklenebilir NDT80 sistemi (NDT80-in) ve çapa uzaklaştırma tekniği ile birleştirilmesinin farklı mayotik aşamalardaki spesifik proteinlerin işlevini incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
NDT80-in sistemi, orta mayoz transkripsiyon faktörü NDT80 4,5'in indüklenebilir ekspresyonuna dayanan mayotik hücre döngüsü senkronizasyonu için güçlü bir araçtır. NDT80 ifadesi faz I çıkış 6,7 için gereklidir. NDT80-in sistemi ile NDT80, bir östrojen reseptörüne (Gal4-ER) kaynaşmış Gal4 transkripsiyon faktörünü eksprese eden hücrelerde GAL1-10 promotörünün kontrolü altındadır4,5. Gal4-ER çekirdeğe sadece β-östradiol'e bağlandığında girdiğinden, NDT80-in hücreleri β-östradiol yokluğunda faz I'de durur ve bu da faz I'deki hücrelerin senkronizasyonuna izin verir (Şekil 1). β-östradiol ilavesi, Gal4-ER transkripsiyon faktörünün çekirdeğe translokasyonunu teşvik eder, burada NDT80'in ekspresyonunu sürmek için GAL1-10'u bağlar ve mayotik bölünmelere senkron girişe yol açar. Hızlandırılmış mikroskopi senkronizasyon olmadan yapılabilmesine rağmen, senkronizasyon kullanmanın avantajı, hücreler mayozun belirli bir aşamasındayken bir inhibitör veya ilaç ekleme yeteneğidir.
Çapa atma tekniği, rapamisin8 ilavesiyle bir proteinin çekirdekten tükenebileceği indüklenebilir bir sistemdir. Bu teknik, tomurcuklanan mayadaki hücre bölünmesi sırasında nükleer proteinleri incelemek için idealdir, çünkü maya hücreleri, nükleer zarfın parçalanmadığı kapalı mitoz ve mayoza uğrar. Ayrıca, bu teknik mayozda birden fazla işlevi olan proteinler için çok yararlıdır. Delesyonlardan, mutant alellerden veya mayotik null alellerin aksine, bir hedef proteinin belirli bir aşamada çekirdekten uzaklaştırılması, daha erken aşamalarda hedef protein aktivitesinden ödün vermez ve sonuçların daha doğru bir şekilde yorumlanmasına izin verir. Ankraj uzaklaştırma sistemi, ribozomal olgunlaşma üzerine ortaya çıkan çekirdek ve sitoplazma arasındaki ribozomal alt birimlerin titremesini kullanır8. Hedef proteini çekirdekten tüketmek için, hedef protein, ribozomal alt birim Rpl13A'nın FKBP12 ile etiketlendiği bir suşta FKBP12-rapamisin bağlayıcı etki alanı (FRB) ile etiketlenir. Rapamisin olmadan, FRB ve FKBP12 etkileşime girmez ve FRB etiketli protein çekirdekte kalır. Rapamisin ilavesi üzerine, rapamisin FKBP12 ve FRB ile kararlı bir kompleks oluşturur ve kompleks Rpl13A ile etkileşim nedeniyle çekirdekten dışarı atılır (Şekil 1). Rapatisin ilavesi üzerine hücre ölümünü önlemek için, hücreler TOR1 geninin tor1-1 mutasyonunu barındırır. Ek olarak, bu hücreler, endojen Fpr1'in FRB ve rapamisin bağlanması için Rpl13A-FKBP12'nin rekabet etmesini önleyen S. cerevisiae FKBP12 proteininin boş bir aleli olan fpr1Δ'yu içerir. Arka plan mutasyonlarını (tor1-1 ve fpr1Δ) uzaklaştırmak, mayotik zamanlamaları veya kromozom ayrışması2'yi etkilemez.
Bu tekniğin yararlılığını göstermek için, kinetochore proteini Ctf19, mayozda farklı zaman noktalarında tükenmiştir. Ctf19, mitozda dağıtılabilen ancak mayoz9,10,11,12,13'te uygun kromozom ayrışması için gerekli olan kinetochore'un bir bileşenidir. Mayozda, kinetochore faz I'de dökülür ve Ctf19, kinetochore yeniden montajı 9,14 için önemlidir. Bu protokol için, NDT80-in sistemine sahip hücreler senkronize edildi ve çapa uzaklaştırma tekniği, faz I'den salınmadan önce ve sonra ve mayoz I kromozom ayrışmasından sonra çekirdekten hedef protein Ctf19'u tüketmek için kullanıldı (Şekil 1). Bu protokol, mayoz ve mitozun herhangi bir aşamasında ilgilenilen diğer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8875</td><td>%95 EtOH</td></tr><tr><td>0.22 uM Dişli Şişe Üstü Filtre</td><td>Milipore Sigma</td><td>S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>%100 EtOH'de</td> 1mM stoklar yapın <td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td> ConA 24 mm x 50 mm lamel No. 1.5 VWR <td>için çözücü olarak kullanmak üzere 1:10 seyreltin</td></tr><tr><td></td><td> Kuzey Amerika</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>25 mm x 75 mm mikroskop slaytları</td><td>VWR Kuzey Amerika</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>Adenin hemisülfat tuzu</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9126</td><td>SC, SCA ve% 1 Kac</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Concanavialin A</td><td>Mllipore Sigma</td><td>C2010</td> 1X PBS CoolSNAP HQ2 CCD <td>kamerada 1 mg / mL olarak yapın</td></tr><tr><td></td><td>Bölüm 4.3'te Kullanılan Fotometri</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>D-glikoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Difco Maya Azot Bazı, Amino Asitler olmadan</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2 ters objektif mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>, Bölüm 4.4'te Kullanılmıştır</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>GE Kişisel DeltaVision Mikroskobundan</td> İndirin <td>Bölüm 4.3'te Kullanılan</td><td>Uygulamalı Hassasiyet</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptofan&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0254</td><td>SC, SCA ve %1 Kac</td></tr><tr><td>Modelleme Kili</td><td>Crayola'yı</td> desteklemek için<td>&nbsp; 2302880000</td><td>Lamel sürgü tutucuya sabitlemek için</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.30.04 Bölüm</td><td>4.4'te Kullanılan</td><td>Görüntüleme</td><td></td> Yazılımı</tr><tr><td>ORCA-Fustion BT Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td>Bölüm 4.4'te Kullanılan</td></tr><tr><td>Plastik pipet ucu tutucu</td><td>Dot Scientific</td><td>LTS1000-HR</td><td>Bu ürünün raf kısmının 4 kare x 4 kare kesitini kesin.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pottassium Asetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>Rapamisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP29631</td> DMSO Silikon Mastik Aqueon <td>100165001'da 1mg / mL stokları yapın</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Akvaryum tutkalı olarak da bilinir.</td></tr><tr><td>SoftWorx7.0.0&nbsp; Bölüm</td><td>4.3'te Kullanılan</td><td>Görüntüleme Yazılımı Uygulanan Hassasiyet</td><td></td></tr><tr><td>Sentetik Komple Karışım (Kaiser)&nbsp;</td><td>Orta</td><td>DSCK2500</td><td></td></tr><tr><td>Tip N daldırma yağı için&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

s. cerevisiae'de mayozu İncelemek için hızlandırılmış mikroskopi ve proteinlerin aşamaya Özgü nükleer tükenmesinin kullanılması

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Hızlandırılmış floresan mikroskopi, genellikle sabit hücreleri görüntüleyerek görülmeyen zamansal ve mekansal veriler sağlayarak mayotik hücre döngüsü olaylarının anlaşılmasında devrim yaratmıştır. Tomurcuklanan maya, mayotik kromozom ayrışmasını incelemek için önemli bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır, çünkü birçok mayotik gen oldukça korunmuştur. Tomurcuklanan mayadaki mayozun hızlandırılmış mikroskopisi, mutasyonun mayotik süreçleri nasıl bozduğunu göstermek için farklı mayotik mutantların izlenmesine izin verir. Bununla birlikte, birçok protein mayozda birden fazla noktada işlev görür. Bu nedenle, fonksiyon kaybı veya mayotik null mutantların kullanımı, erken bir süreci bozabilir, daha sonraki süreci bloke edebilir veya rahatsız edebilir ve her bir bireysel rolle ilişkili fenotipleri belirlemeyi zorlaştırabilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, bu protokol, proteinlerin mayozun belirli aşamalarında çekirdekten şartlı olarak nasıl tükenebileceğini açıklarken, hızlandırılmış mikroskopi kullanarak mayotik olayları izler. Spesifik olarak, bu protokol, hücrelerin faz I'de nasıl senkronize edildiğini, çapa atma tekniğinin belirli mayotik aşamalarda çekirdekten proteinleri tüketmek için nasıl kullanıldığını ve mayotik kromozom ayrışmasını izlemek için hızlandırılmış görüntülemenin nasıl kullanıldığını açıklar. Tekniğin yararlılığına bir örnek olarak, kinetochore proteini Ctf19, mayozis sırasında farklı zaman noktalarında çekirdekten tükenmiş ve mayoz II'nin sonunda kromatin kütlelerinin sayısı analiz edilmiştir. Genel olarak, bu protokol mayotik bölünmeleri izlerken çekirdekten farklı nükleer proteinleri tüketmek için uyarlanabilir.

Kromatin ayrışmasını izlemek için, histon proteini Htb2 mCherry ile etiketlendi. Faz I'de, kromatin tek bir Htb2 kütlesi olarak görünür. Homolog kromozomlar ilk mayotik bölünmede ayrıldıktan sonra, kromatin iki ayrı kütle olarak ortaya çıkar (Şekil 3A). Kardeş kromatitler ayrıldıktan sonra, kromatin dört kütle olarak görünür. Bazı kromozomlar iğ mikrotübüllerine tutunamazsa, mayoz I veya mayoz II'den sonra ek kitleler görülebilir.
Yukarıda açıklanan yöntem, tomurc...

Hızlandırılmış mikroskopi, tomurcuklanan mayadaki mayozu incelemek için değerli bir araçtır. Bu protokol, mayotik kromozom ayrışması sırasında belirli bir proteinin işlevinin nasıl çalışılacağını göstermek için hücre döngüsü senkronizasyonunu, hızlandırılmış mikroskopiyi ve bir hedef proteinin koşullu tükenmesini birleştiren bir yöntemi açıklar.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Profaz birdeki hücreleri senkronize ederek ve daha sonra hedef proteini belirli bir aşamada tüketerek, bu yöntem spesifik proteinlerin geçici olarak farklı işlevlerini tanımlayabilir. Miyozun belirli aşamalarında proteinleri şartlı olarak tüketmek, geleneksel bir miyotik mutantın daha sonraki aşamalarda sahip olabileceği artık etkileri önler. Bu yöntem, tomurcuklanan maya mitozunu ve nükleer zarf parçalanmasına maruz kalmayan diğer organizmaları incelemek için kullanılabilir.Ek olarak, bu yöntem nükleer zarf parçalanmasından önce hücre döngüsü olaylarını incelemek için diğer organizmalarda kullanılabilir. Başlamak için, görüntüleme için tek katmanlı bir hücre oluşturmak için kullanılacak bir agar pedi yapın. Agar pedi için bir kalıp görevi görecek bir silindir oluşturmak için 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün kapağını ve tabanını kesin ve alttan atın.Kesilen mikrosantrifüj tüp silindirini, tüpün üst kısmı baş aşağı olacak şekilde temiz bir cam sürgü üzerine yerleştirin ve kızağın üzerine oturtun. 50 mililitrelik bir beherde altı mililitre% 5'lik bir agar çözeltisi yapın. Daha büyük bir açıklık yapmak için pipetin ucunu kesin ve mikrosantrifüj tüpüne yaklaşık 500 mikrolitre erimiş agar pipetin.Agar katılaşana kadar oda sıcaklığında bekletin. Maya hücrelerini hazırlamak için, bir mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde iki dakika boyunca 800 G'de sporülasyon kültürünün 200 mikrolitresini döndürün. Süpernatanın 180 mikrolitresini atın.Pelet, tüpü döndürerek ve hafifçe vurarak kalan süpernatantta yeniden askıya alın. Konsantre hücrelerin altı mikrolitresini kapağın üzerine pipet, ConA ile yerinde haznenin ortasında kayar. Silindiri agar pedi ile tutun ve dikkatlice cam slayttan kaydırın.Agarın altta tamamen düz olduğundan ve pipet ucunun tabanını kullandığından emin olun, mikrosantrifüj kalıbına hafif miktarda basınç uygulayın, böylece agar pedi tüpün sınırının biraz üzerine itilir. Daha sonra, kalıbı, agar pedi odaya doğru bakacak şekilde ters çevirin. Agar pedini hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirmek için forseps kullanın ve pipet ucunu kullanarak agar pedini odanın etrafında 10 ila 20 kez yavaşça kaydırarak kapak kayması üzerinde tek katmanlı bir hücre tabakası oluşturun.Agar pedini odada 12 ila 15 dakika tutun. Daha sonra, iki mililitre sporülasyon kültürünü iki mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve iki dakika boyunca 15.700 G'de döndürün. Süpernatantı temiz mikrosantrifüj tüplerine aktardıktan sonra, aynı durumda tekrar döndürün ve mikrosantrifüj tüplerini temizlemek için süpernatantı toplayın.Agar pedini içeren odaya iki mililitre süpernatant damla damla ekleyin. Sıvı odanın tepesine ulaştığında, agar pedi büyük olasılıkla yüzecektir. Agar pedini forseps ile nazikçe çıkarın ve atın.Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için odanın üstüne 24 x 50 milimetrelik bir kapak kayması yerleştirin. Filmi mikroskopta ayarlamak için, kapak kaymasını slayt tutucunun içine takın. Kalıplama kilini, sürgü tutucuda güvende tutmak için kapak kaymasının yan tarafına yapıştırın.Görüntü alma yazılımını açın. DIC veya parlak alan kullanarak hücreleri odaklamak için kaba ve ince ayar düğmeleri kullanın. Görüntü alma yazılımının ana menüsünde, Dosya'ya tıklayın, Al'ı seçin ve dört pencere açılacaktır.Resolve 3D adlı pencerede, Erlenmeyer şişesi simgesine tıklayın. Bu, hızlandırılmış bir film ayarlamak için deneme oluşturmaya yönelik denetimleri içeren Tasarım Çalıştırma Denemesi başlıklı bir pencere açar. Tasarım sekmesinin altında, Bölümleme etiketli sekmeye gidin.Z kesitinin yanındaki kutuyu seçin ve optik bölüm aralığını bir mikrometreye, optik bölüm sayısını ise beş olarak ayarlayın. Ardından, Kanallar sekmesinin altında, artı simgesine tıklayın ve uygun kanalı seçin. Ardından, Referans Görüntü'nün yanındaki kutuyu seçin ve açılır menüden Z konumunu numunenin ortasına ayarlayın.Açılır menüden bir geçirgenlik ve pozlama süresi değeri seçin. Hızlandırılmış çekim sekmesinin altında, Zaman atlaması'nın yanındaki kutuyu seçin ve görüntü alma zaman aralığını tanımlamak için dakika ve saat değerlerini girin. Film sırasında sahne alanının kaymasını önlemek için Odağı Ultimate Focus ile Koru'nun yanındaki kutuyu seçin.Ve Noktalar sekmesinin altında, Ziyaret Noktası Listesi'nin yanındaki kutuyu seçin. Ana menüde, Görünüm'e tıklayın ve Nokta Listesi'ni seçin. Sahne alanını, odanın tek katmanlı bir hücre gösteren bir alanına taşıyın.Nokta Listesi penceresinde Noktayı İşaretle'ye tıklayın. Hücreleri aşırı pozlamayı önlemek ve her zaman kursu sırasında her alanı görüntülemek için herhangi bir çakışma olmadan 25 ila 30 nokta seçmek için sahne alanını hareket ettirin. Nokta Listesi penceresinde, her nokta için nihai odağı ayarlamak üzere Tümünü Kalibre Et'i seçin.Çalıştır sekmesi altında, dosyayı bilgisayardaki uygun hedefe kaydedin. Denemeyi Çalıştır penceresinde, filmi başlatmak için Oynat düğmesini seçin. Fiji yazılımını açın.DIC ve mCherry kanallarını açın. Görüntü'ye, ardından Yığınlar ve Z Projesi'ne tıklayarak mCherry kanalının tek bir maksimum yoğunluk projeksiyonunu elde edin ve açılır menüden Maksimum Yoğunluk'u seçin. DIC ve mCherry kanallarını tek bir görüntüde birleştirmek için Resim, Renk'e tıklayın ve Kanalları Birleştir'i seçin.Mayoz yoluyla tek bir hücreyi takip edin. Mayoz II tamamlandıktan sonra, DNA kütlelerinin sayısını kaydedin. Çapa uzakta arka plana sahip vahşi tip hücrelerde, mayozun dört ürününü temsil eden mayoz II'nin sonunda tipik olarak dört DNA kütlesi vardır.Hücrelerin küçük bir kısmında, mayoz II'den sonra sadece üç kütle görülebilir.Ctf19-FRB, faz I'in serbest bırakılması sırasında demirlendiğinde, hücrelerin yaklaşık% 47'si mayozun tamamlanmasından sonra dörtten fazla DNA kütlesi gösterir, bu da kinetochores ve mikrotübüllerin bağlanmasında bir kusur olduğunu düşündürür. Ctf19-FRB'nin demirlenmesiyle, kinetochore montajından sonra, ancak mayoz I'den önce veya mayoz II'den sonra, hücrelerin yaklaşık% 16'sı ek DNA kütleleri gösterir. Bu protokolün en önemli parçalarından biri, tek katmanınızı bozmamak için süpernatantı odanıza damla damla eklemektir.Ek olarak, analizinizde dikkate almak için görüntülemeye hazırlanmak için gereken süreyi not edin. Floresan olarak paketlenmiş proteinleri değiştirerek, bu prosedür hücre döngüsü süresi, kromozom ayrışması, protein bolluğu ve protein lokalizasyonu ile ilgili soruları cevaplamak için kullanılabilir.

use-time-lapse-microscopy-stage-specific-nuclear-depletion-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir...

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Bu makale, nematod embriyogenezisin erken olayların görselleştirme için kullanılan bir...

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize&#39;a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyolar

Fisyon mayası cinsel yaşam döngüsünün uzun süreli mikroskobu için tekrarlanabilir bir temel yöntem sunuyoruz. Açıklanan küçük ayarlamalarla, sunulan protokol, araştırmanın üreme sürecinin farklı adımlarına odaklanmasına izin verir.

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar.

Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Mayoz fazı sırasında kromozom hareketi, spor oluşumu için temel olan, yeterince anlaşılmamış bir olgudur. Bu protokol, Arabidopsis thaliana erkek mayositlerinde mayotik faz sırasında sentromer hareketlerini elde etmek, analiz etmek ve ölçmek için bir yöntemi açıklar.

Arabidopsis thaliana'da Erkek Mayoz Fazı Sırasında Sentromer Hareketlerinin Canlı Görüntüleme Karakterizasyonu

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin, S. cerevisiae'de mayozu incelemek için hızlandırılmış mikroskopi ve aşamaya özgü protein nükleer tükenmesi yöntemini. Bu teknik, kromozom ayrışmasındaki protein fonksiyonlarını belirlemeye yardımcı olur.

S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Daha fazla video keşfet