S. cerevisiae'de Mayozu İncelemek için Hızlandırılmış Mikroskopi ve Proteinlerin Aşamaya Özgü Nükleer Tükenmesinin Kullanılması

Profaz birdeki hücreleri senkronize ederek ve daha sonra hedef proteini belirli bir aşamada tüketerek, bu yöntem spesifik proteinlerin geçici olarak farklı işlevlerini tanımlayabilir. Miyozun belirli aşamalarında proteinleri şartlı olarak tüketmek, geleneksel bir miyotik mutantın daha sonraki aşamalarda sahip olabileceği artık etkileri önler. Bu yöntem, tomurcuklanan maya mitozunu ve nükleer zarf parçalanmasına maruz kalmayan diğer organizmaları incelemek için kullanılabilir.

Ek olarak, bu yöntem nükleer zarf parçalanmasından önce hücre döngüsü olaylarını incelemek için diğer organizmalarda kullanılabilir. Başlamak için, görüntüleme için tek katmanlı bir hücre oluşturmak için kullanılacak bir agar pedi yapın. Agar pedi için bir kalıp görevi görecek bir silindir oluşturmak için 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünün kapağını ve tabanını kesin ve alttan atın.

Kesilen mikrosantrifüj tüp silindirini, tüpün üst kısmı baş aşağı olacak şekilde temiz bir cam sürgü üzerine yerleştirin ve kızağın üzerine oturtun. 50 mililitrelik bir beherde altı mililitre% 5'lik bir agar çözeltisi yapın. Daha büyük bir açıklık yapmak için pipetin ucunu kesin ve mikrosantrifüj tüpüne yaklaşık 500 mikrolitre erimiş agar pipetin.

Agar katılaşana kadar oda sıcaklığında bekletin. Maya hücrelerini hazırlamak için, bir mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde iki dakika boyunca 800 G'de sporülasyon kültürünün 200 mikrolitresini döndürün. Süpernatanın 180 mikrolitresini atın.

Pelet, tüpü döndürerek ve hafifçe vurarak kalan süpernatantta yeniden askıya alın. Konsantre hücrelerin altı mikrolitresini kapağın üzerine pipet, ConA ile yerinde haznenin ortasında kayar. Silindiri agar pedi ile tutun ve dikkatlice cam slayttan kaydırın.

Agarın altta tamamen düz olduğundan ve pipet ucunun tabanını kullandığından emin olun, mikrosantrifüj kalıbına hafif miktarda basınç uygulayın, böylece agar pedi tüpün sınırının biraz üzerine itilir. Daha sonra, kalıbı, agar pedi odaya doğru bakacak şekilde ters çevirin. Agar pedini hücrelerin üzerine nazikçe yerleştirmek için forseps kullanın ve pipet ucunu kullanarak agar pedini odanın etrafında 10 ila 20 kez yavaşça kaydırarak kapak kayması üzerinde tek katmanlı bir hücre tabakası oluşturun.

Agar pedini odada 12 ila 15 dakika tutun. Daha sonra, iki mililitre sporülasyon kültürünü iki mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve iki dakika boyunca 15.700 G'de döndürün. Süpernatantı temiz mikrosantrifüj tüplerine aktardıktan sonra, aynı durumda tekrar döndürün ve mikrosantrifüj tüplerini temizlemek için süpernatantı toplayın.

Agar pedini içeren odaya iki mililitre süpernatant damla damla ekleyin. Sıvı odanın tepesine ulaştığında, agar pedi büyük olasılıkla yüzecektir. Agar pedini forseps ile nazikçe çıkarın ve atın.

Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için odanın üstüne 24 x 50 milimetrelik bir kapak kayması yerleştirin. Filmi mikroskopta ayarlamak için, kapak kaymasını slayt tutucunun içine takın. Kalıplama kilini, sürgü tutucuda güvende tutmak için kapak kaymasının yan tarafına yapıştırın.

Görüntü alma yazılımını açın. DIC veya parlak alan kullanarak hücreleri odaklamak için kaba ve ince ayar düğmeleri kullanın. Görüntü alma yazılımının ana menüsünde, Dosya'ya tıklayın, Al'ı seçin ve dört pencere açılacaktır.

Resolve 3D adlı pencerede, Erlenmeyer şişesi simgesine tıklayın. Bu, hızlandırılmış bir film ayarlamak için deneme oluşturmaya yönelik denetimleri içeren Tasarım Çalıştırma Denemesi başlıklı bir pencere açar. Tasarım sekmesinin altında, Bölümleme etiketli sekmeye gidin.

Z kesitinin yanındaki kutuyu seçin ve optik bölüm aralığını bir mikrometreye, optik bölüm sayısını ise beş olarak ayarlayın. Ardından, Kanallar sekmesinin altında, artı simgesine tıklayın ve uygun kanalı seçin. Ardından, Referans Görüntü'nün yanındaki kutuyu seçin ve açılır menüden Z konumunu numunenin ortasına ayarlayın.

Açılır menüden bir geçirgenlik ve pozlama süresi değeri seçin. Hızlandırılmış çekim sekmesinin altında, Zaman atlaması'nın yanındaki kutuyu seçin ve görüntü alma zaman aralığını tanımlamak için dakika ve saat değerlerini girin. Film sırasında sahne alanının kaymasını önlemek için Odağı Ultimate Focus ile Koru'nun yanındaki kutuyu seçin.

Ve Noktalar sekmesinin altında, Ziyaret Noktası Listesi'nin yanındaki kutuyu seçin. Ana menüde, Görünüm'e tıklayın ve Nokta Listesi'ni seçin. Sahne alanını, odanın tek katmanlı bir hücre gösteren bir alanına taşıyın.

Nokta Listesi penceresinde Noktayı İşaretle'ye tıklayın. Hücreleri aşırı pozlamayı önlemek ve her zaman kursu sırasında her alanı görüntülemek için herhangi bir çakışma olmadan 25 ila 30 nokta seçmek için sahne alanını hareket ettirin. Nokta Listesi penceresinde, her nokta için nihai odağı ayarlamak üzere Tümünü Kalibre Et'i seçin.

Çalıştır sekmesi altında, dosyayı bilgisayardaki uygun hedefe kaydedin. Denemeyi Çalıştır penceresinde, filmi başlatmak için Oynat düğmesini seçin. Fiji yazılımını açın.

DIC ve mCherry kanallarını açın. Görüntü'ye, ardından Yığınlar ve Z Projesi'ne tıklayarak mCherry kanalının tek bir maksimum yoğunluk projeksiyonunu elde edin ve açılır menüden Maksimum Yoğunluk'u seçin. DIC ve mCherry kanallarını tek bir görüntüde birleştirmek için Resim, Renk'e tıklayın ve Kanalları Birleştir'i seçin.

Mayoz yoluyla tek bir hücreyi takip edin. Mayoz II tamamlandıktan sonra, DNA kütlelerinin sayısını kaydedin. Çapa uzakta arka plana sahip vahşi tip hücrelerde, mayozun dört ürününü temsil eden mayoz II'nin sonunda tipik olarak dört DNA kütlesi vardır.

Hücrelerin küçük bir kısmında, mayoz II'den sonra sadece üç kütle görülebilir.Ctf19-FRB, faz I'in serbest bırakılması sırasında demirlendiğinde, hücrelerin yaklaşık% 47'si mayozun tamamlanmasından sonra dörtten fazla DNA kütlesi gösterir, bu da kinetochores ve mikrotübüllerin bağlanmasında bir kusur olduğunu düşündürür. Ctf19-FRB'nin demirlenmesiyle, kinetochore montajından sonra, ancak mayoz I'den önce veya mayoz II'den sonra, hücrelerin yaklaşık% 16'sı ek DNA kütleleri gösterir. Bu protokolün en önemli parçalarından biri, tek katmanınızı bozmamak için süpernatantı odanıza damla damla eklemektir.

Ek olarak, analizinizde dikkate almak için görüntülemeye hazırlanmak için gereken süreyi not edin. Floresan olarak paketlenmiş proteinleri değiştirerek, bu prosedür hücre döngüsü süresi, kromozom ayrışması, protein bolluğu ve protein lokalizasyonu ile ilgili soruları cevaplamak için kullanılabilir.