Name: Yaşlanma Araştırmaları için iPSC Kaynaklı Beyin Organoidlerinin Uzun Süreli Kültürü için Sağlam Doku Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Keşfedin iPSC kaynaklı beyin organoidlerinin uzun süreli kültür protokolünü. Bu yöntem, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkları in vitro ortamda modellemek için kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Hollanda hükümetinin Eğitim, Kültür ve Bilim Bakanlığı tarafından finanse edilen bir NWO Yerçekimi projesi (024.003.001) olan Hollanda Çip Üzerinde Organ Girişimi tarafından desteklenmiştir. DCB, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología'nın (CONACyT) doktora bursu şeklindeki finansal desteğini şükranla kabul eder.

Hasta çalışmaları Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Tüm katılımcılar, verilerinin ve biyoörneklerinin yeniden kullanılmasına izin vermek için yazılı bilgilendirilmiş onam ve depo onayı imzaladılar. iPSC hatları IRB ve kurumsal yönergelere uygun olarak oluşturulmuştur. Şekil 1 , bu protokolün iş akışına şematik bir genel bakış göstermektedir.
1. iPSC yeniden programlama ve bakım
<ol><li>Deneğin kanının 8 mL'sini (yaşlı veya hastalık hastası; 65 yaş ve üstü) sodyum sitrat içeren hücre hazırlama tüplerine (CPT) veya EDTA veya heparinize tüplere toplayın.</li>
	<li>Sadece periferik kan içerenve serum içermeyen pelet toplamak için oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 1.800 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>iPSC'lerielde etmek için üreticinin protokolüne göre özel yeniden programlama vektörleri kullanın (bkz.</li>
	<li>Besleyici içermeyen, laktoz dehidrogenaz yükseltici virüs (LDEV) içermeyen azaltılmış büyüme faktörü bazal membran matrisindeki kültür iPSC'leri, %5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de Essential 8 (E8) ortamında (bakınız Malzeme Tablosu) 6 kuyucuklu kültür plakaları kaplıdır.</li>
	<li>Aşırı kalabalık veya kendiliğinden farklılaşmayı önlemek için iPSC'leri E8 ortamında 3-4 gün boyunca saklayın.</li>
	<li>İmmünofloresan belirteçleri kullanarak iPSC hatlarının pluripotensini doğrulayın (adım 2) ve mikoplazmayı test edin (adım 3).</li>
</ol>2. Pluripotens boyama
<ol><li>Çözeltileri ve antikorları korumak için, hücreleri analizden 3-4 gün önce kaplanmış (adım 1.4) 24 kuyucuklu kültür plakalarına tohumlayın. Ortamı bir pipetle aspire edin ve hücreleri RT'de 15-20 dakika boyunca fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde% 4 formaldehit ile sabitleyin.</li>
	<li>Hücreleri 1x PBS ile 3x yıkayın ve PBS'de% 1 sığır serum albümininde (BSA) % 0.1 Triton-X 100 ile en az 15 dakika, ancak RT'de 1 saatten fazla olmamak üzere geçirgenleştirin.</li>
	<li>RT'de 30 dakika boyunca 1x PBS ile 3x yıkayın ve PBS'de% 5 BSA ile bloke edin.</li>
	<li>1x PBS ile tekrar 3x yıkayın ve Sox2 ve Oct3/4 antikorlarını (1:100 seyreltme; bakınız Malzeme Tablosu) ve nükleik boya DAPI'yi gece boyunca 4 °C'de %1 BSA'da (1:4.000 seyreltme) ekleyin. Işıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.</li>
	<li>1x PBS ile 3x yıkayın ve hücreleri PBS'de bırakın. 10-20x büyütmede floresan mikroskobu ile görüntü. Pluripotens belirteçleri Sox2 ve Oct3/4'ün17,18 hücrelerinin çekirdeğinde lokalize olduğundan emin olun.</li>
</ol>3. Mikoplazma testi
NOT: Ayrıntılı tahlil yürütme ve analiz adımları için tespit kitinin protokolüne bakın (bkz. Tespit kiti, mikoplazma testi için reaktif, substrat ve tahlil tamponu sağlar.
<ol><li>Hücreleri veya tazeleyici ortamı geçmeden önce, bir santrifüj tüpünde 2-3 mL hücre kültürü ortamı toplayın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de herhangi bir hücreyi veya döküntüyü pelet edin. süpernatantı ≤5 gün boyunca 4 ° C'de saklayın. Algılanabilir bir sinyal sağlamak için hücreleri en az 24 saat boyunca ortamla inkübe edin.</li>
	<li>Taze bir tüpe veya beyaz duvarlı 96 delikli bir plakanın kuyucuğuna 100 μL hücre süpernatantı ekleyin (opak taban önerilir , bkz. Reaktifi ve substratı tahlil tamponunda yeniden oluşturun ve RT'de 15 dakika boyunca dengeleyin.</li>
	<li>Numuneye 100 μL reaktif ekleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin. lüminesansı bir luminometre ile ölçün (ölçüm #1).</li>
	<li>Numuneye 100 μL substrat ekleyin ve RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin. lüminesansı ölçün (ölçüm #2).</li>
	<li>Mikoplazma kontaminasyonunu ölçüm #2 ila #1 oranına göre belirleyin. Sonuçların yorumlanması için kitin kılavuzuna bakın.</li>
</ol>4. Mikrofilament preparatı
<ol><li>Poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA, bakınız Malzeme Tablosu) mikrofilamentlerinin hazırlanmasına, dikiş ipliğini bir neşterin kör ucuyla yıpratarak başlayın. Yıpranmış elyafı% 70 etanol ile hafifçe kısırlaştırın.</li>
	<li>Mikroskop altında ve bir cetvel kullanarak, PLGA lifini 500 μm ila 1 mm uzunluğunda iplikçiklerden oluşan parçalar halinde kesmeye başlayın. Toplamda elyafın yaklaşık 25 mm'sini kesin. Filamentleri 1 mL antibiyotik-antimikotik çözelti ile 15 mL'lik bir tüpte tutun.<ol><li>Davlumbazda, fiber çözeltisini 10 mL DMEM / F-12 ile seyreltin (Tablo 1). Çözeltiyi karıştırmak için vorteks kuyusu. NOT: Steril bir ortamda hücre kültürü akış davlumbazında çalışın.</li>
	</ol></li>
	<li>Lif çözeltisinin 20 μL'sini, 96 delikli bir plakanın kuyucuklarını oluşturan üç embriyoid cisimcise (EB) ekleyin. Parlak alan mikroskobu altında, kuyu başına lifleri sayın ve ortalamasını alın. Kuyu başına ortalama 5-10 PLGA mikrofilamente seyreltin veya konsantre edin. Her kuyuyu bu şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Kuyular artık hücrelerle tohumlanmaya hazır. Plakayı ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında veya ertesi gün için 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>5. Embriyoid Cisim (EB) oluşumu
NOT: Tüm medya ve çözümler RT'ye ısıtılmalıdır.
<ol><li>iPSC'ler %70-%80 akıcılığa ulaştığında (Şekil 2A), EB oluşumu için geçişe ve kullanılmaya hazırdırlar. Hücreleri mikroskopla 10x-20x büyütmede kontrol edin. Kolonilerin minimal (%<10) spontan farklılaşma alanları gösterdiğinden emin olun.</li>
	<li>Ortamı bir pipetle aspire edin ve hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın. 500 μL hücre ayrılma çözeltisi (bakınız Malzeme Tablosu) veya 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyerek kolonileri ayırın ve 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin. NOT: Steril bir ortamda hücre kültürü akış davlumbazında çalışın.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa 1 mL taze E8 ortamı ekleyerek serbest bırakılan hücreleri toplayın ve tüm hücreler ayrılana kadar yavaşça pipet yapın.</li>
	<li>1,5 mL'lik hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve toplam 2,5 mL'lik hacme ulaşmak için 1 mL'lik yeni bir E8 ortamı daha ekleyin.</li>
	<li>RT'de 3 dakika boyunca 290 x g'de santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı bir pipetle aspire edin, hücre peletini 50 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 1 mL Essential 6 (E6, Malzeme Tablosuna bakınız) ortamında yeniden askıya alın ve bir hemositometre19 kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>İstenilen tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak, 50 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş E6 ortamında 60.000-90.000 hücre/mL'lik bir hücre süspansiyonu hazırlayın (bkz.</li>
	<li>96 delikli bir ULA plakasının (veya hazırlanmış bir içbükey plaka 20'nin) her bir kuyucuğuna150 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Kuyu başına 9.000-11.000 hücre tohumlayın.</li>
	<li>RT'de 1 dakika boyunca hücreleri 290 x g'de zorla toplamak için plakayı santrifüjleyin. plakayı% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin.</li>
</ol>6. Nöroepitelyal indüksiyon
<ol><li>24 saat sonra, ortamın 120 μL'sini bir pipetle dikkatlice aspire edin. Pipet ucunu kuyunun çok uzağına indirerek EB'yi aspire etmediğinizden emin olun.</li>
	<li>2 μM XAV939 ve SMAD inhibitörleri ile desteklenmiş 150 μL E6 ortamı (RT'de) ekleyin: kuyu başına 10 μM SB431542 ve 500 nM LDN 193189 (bkz.</li>
	<li>2 μM XAV939, 10 μM SB431542 ve 500 nM LDN 193189 ile desteklenmiş taze hazırlanmış E6 ortamı ile ortamı günlük olarak değiştirin. NOT: 6. günde (DIV6), EB'lerin çapı 550-600 μm olmalı ve daha fazla farklılaşmaya hazır olmalıdır.</li>
</ol>7. Organoid farklılaşma ve olgunlaşma
NOT: Tüm medyanın RT'ye ısıtılması gerekir.
<ol><li>Yaklaşık DIV7'de, tüm EB'lerin 550-600 μm çapa ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin ve pürüzsüz ve net bir kenar görüntüleyin (Şekil 2B); Bu aşamada, hücre dışı bir matrise (ECM) gömülmeye hazırdırlar. NOT: Steril bir ortamda çalışın.</li>
	<li>Boş bir P200 kutusuna bir film tabakası (yaklaşık 4 inç uzunluğunda) yerleştirerek termoplastik sızdırmazlık filminden çukurlu gömme tabakaları hazırlayın (bkz. 15 mL'lik bir konik tüp veya 500 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanarak, 12 çukur oluşturmak için film tabakasını yavaşça deliklere bastırın. Film tabakasına %70 etanol püskürtün ve UV ışığı açıkken akış davlumbazının içinde en az 30 dakika kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Yeterli miktarda bazal membran matrisini (Matrigel, bakınız Malzeme Tablosu) buz üzerinde çözün ve akış başlığının içine yerleştirin. NOT: EB başına yaklaşık 30 μL seyreltilmemiş membran matrisine ihtiyaç vardır. Jelleşmesini önlemek için membran matrisini daima 4 °C'nin altında tutun. Önceden soğutulmuş pipet uçları, pipetleme sırasında matrisin uçtaki polimerleşmesini yavaşlattığı ve böylece malzeme kaybını azalttığı için de önerilir.</li>
	<li>Geniş delikli bir P200 ucu kullanarak her bir çukura bir EB aktarın ve normal bir pipet ucuyla mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın. EB'lerin kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Normal bir P200 ucu kullanarak, her organoide ~ 30 μL seyreltilmemiş membran matrisi ekleyin ve EB'nin damlacığın merkezinde olmasını sağlayın.</li>
	<li>Tüm EB'ler matrise gömüldükten sonra, EB'leri içeren film tabakasını steril bir Petri kabına yerleştirin. NOT: İsteğe bağlı olarak, buharlaşmayı önlemek için steril suyla doldurulmuş küçük bir Petri kabı, film tabakasının yanındaki daha büyük Petri kabına yerleştirilebilir.<ol><li>Çanağı bir inkübatöre aktarın ve membran matrisinin katılaşmasını sağlamak için yaklaşık 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Her 12 gömülü organoid seti için, ULA 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda A vitamini içermeyen B27 ile 5 mL farklılaşma ortamı hazırlayın (Tablo 1). Plakayı bir inkübatörde önceden 37 ° C'ye ısıtın.</li>
	<li>Kuluçka süresi bittiğinde, film tabakasını alarak ve çukurları tabakanın arkasından iterek gömülü EB'leri ULA 6 delikli plakaya aktarın. Gerekirse, kuyudan 1 mL alın ve damlacıkların filmden ayrılmasına yardımcı olmak için tabakaya pipetleyin. NOT: Önemli morfolojik değişiklikler gömmeden 1 gün sonra görülebilir; EB'ler pürüzsüz kenarlara sahip olmaktan, tomurcukları oluşturan şişkin çıkıntılara dönüşür (Şekil 2C).</li>
	<li>2 gün sonra (DIV9), yarı ortam değişikliği gerçekleştirin. İşlemde membran matrisi damlacıklarını aspire etmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin.</li>
	<li>2 gün sonra (DIV11), medyayı 3 μM CHIR99021 ile tamamlayarak tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin (bkz.</li>
	<li>DIV14'te, organoid boyutunda kademeli bir artış için medyayı A vitamini ile B27 ile farklılaşma ortamına değiştirin (Tablo 1).</li>
	<li>DIV16'da, kuyu plakasını bir inkübatörün içinde 90 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin. Medyayı her 2 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Her 40 DIV'de, ortamdaki ek besinler için her 50 mL ortam için membran matrisinin 500 μL'sini seyreltin.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+Atlas%3A+a+multi-omics+database+for+aging+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Aging Atlas: a multi-omics database for aging biology.</a> Nucleic Acids Research. 49, 825-830 (2021).</li>
<li>Ferrucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+biological+aging+in+humans%3A+A+quest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Measuring biological aging in humans: A quest.</a> Cell. 19 (2), 13080(2020).</li>
<li>Mertens, J., Reid, D., Lau, S., Kim, Y., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+a+dish%3A+iPSC-derived+and+directly+induced+neurons+for+studying+brain+aging+and+age-related+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Aging in a dish: iPSC-derived and directly induced neurons for studying brain aging and age-related neurodegenerative diseases.</a> Annu Rev Genet. 52, 271-293 (2018).</li>
<li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+instability+of+mature+neuronal+fate+in+induced+neurons+from+Alzheimer%27s+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer's patients.</a> Cell Stem Cell. 28 (9), 1533-1548 (2021).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APOE4+causes+widespread+molecular+and+cellular+alterations+associated+with+Alzheimer%27s+disease+phenotypes+in+human+iPSC-derived+brain+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types.</a> Neuron. 98 (6), 1141-1154 (2018).</li>
<li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+inhibits+amyloid-%CE%B2+and+tau+pathology+and+reverses+cognitive+deficits+in+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer's disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 401-412 (2019).</li>
<li>Hu, J. L., Todhunter, M. E., LaBarge, M. A., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+organoids+as+new+models+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opportunities for organoids as new models of aging.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 39-50 (2018).</li>
<li>Choi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+human+neural+cell+culture+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease.</a> Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).</li>
<li>Gonzalez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+amyloid+beta+and+tau+pathology+in+human+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids.</a> Molecular Psychiatry. 23 (12), 2363-2374 (2018).</li>
<li>Yoon, S. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+human+cortical+organoid+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reliability of human cortical organoid generation.</a> Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Muratore, C. R., Srikanth, P., Callahan, D. G., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+optimization+of+hiPSC+forebrain+cortical+differentiation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols.</a> PLoS ONE. 9 (8), 105807(2014).</li>
<li>Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+long-term+culture+of+advanced+cerebral+organoids+for+studying+later+stages+of+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development.</a> Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2020).</li>
<li>Goto-Silva, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+fluid+dynamic+analysis+of+physical+forces+playing+a+role+in+brain+organoid+cultures+in+two+different+multiplex+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational fluid dynamic analysis of physical forces playing a role in brain organoid cultures in two different multiplex platforms.</a> BMC Developmental Biology. 19 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> Journal of Visualized Experiments. (68), e4327(2012).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cost-effective+and+efficient+reprogramming+platform+for+large-scale+production+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A cost-effective and efficient reprogramming platform for large-scale production of integration-free human induced pluripotent stem cells in chemically defined culture.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Wakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+gene+expression+criteria+for+identifying+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Morphologic and gene expression criteria for identifying human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS ONE. 7 (12), e48677(2012).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Choy Buentello, D., Koch, L. S., Trujillo-De Santiago, G., Alvarez, M. M., Broersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+standard+U-bottom+and+V-bottom+well+plates+to+generate+neuroepithelial+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of standard U-bottom and V-bottom well plates to generate neuroepithelial embryoid bodies.</a> PLOS ONE. 17 (5), 0262062(2022).</li>
<li>Ellis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2%2C+a+persistent+marker+for+multipotential+neural+stem+cells+derived+from+embryonic+stem+cells%2C+the+embryo+or+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult.</a> Developmental Neuroscience. 26 (2-4), 148-165 (2004).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TuJ1+%28class+III+%CE%B2-tubulin%29+expression+suggests+dynamic+redistribution+of+follicular+dendritic+cells+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue.</a> European Journal of Cell Biology. 84 (2-3), 453-459 (2005).</li>
<li>Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+stem%2Fprogenitor+cell+marker+nestin+is+expressed+in+proliferative+endothelial+cells%2C+but+not+in+mature+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).</li>
<li>Soltani, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+protein+2%2C+a+marker+of+neuronal+differentiation%2C+induces+mitotic+defects%2C+inhibits+growth+of+melanoma+cells%2C+and+predicts+metastatic+potential+of+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated protein 2, a marker of neuronal differentiation, induces mitotic defects, inhibits growth of melanoma cells, and predicts metastatic potential of cutaneous melanoma.</a> The American Journal of Pathology. 166 (6), 1841-1850 (2005).</li>
<li>Wilson, P. G., Stice, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+differentiation+of+neural+rosettes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews%22%5BJournal%5D)">Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Reviews. 2 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuN+as+a+neuronal+nuclear+antigen+and+neuron+differentiation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker.</a> Acta Naturae. 7 (25), 42-47 (2015).</li>
<li>Rao, M. S., Hattiangady, B., Shetty, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+window+and+mechanisms+of+major+age-related+decline+in+the+production+of+new+neurons+within+the+dentate+gyrus+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The window and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus.</a> Aging Cell. 5 (6), 545-558 (2006).</li>
<li>Meng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synapsin+I+cleavage+fragment+contributes+to+synaptic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A synapsin I cleavage fragment contributes to synaptic dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Aging Cell. 21 (5), 13619(2022).</li>
<li>Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+human+embryonic+stem+cells+differentiation+efficiency+by+screening+size-tunable+homogenous+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies.</a> Biomaterials. 35 (23), 5987-5997 (2014).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Lee, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Matrigel-based+culture+for+expansion+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Cells+and+Systems%22%5BJournal%5D)">Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells.</a> Animal Cells and Systems. 19 (3), 175-180 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+The+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Hocevar, S. E., Liu, L., Duncan, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+is+required+for+efficient+differentiation+of+isolated%2C+stem+cell-derived+otic+vesicles+into+inner+ear+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids.</a> Stem Cell Research. 53, 102295(2021).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+organoid+culture+without+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards organoid culture without Matrigel.</a> Communications Biology. 4 (1), 1-15 (2021).</li>
<li>Kaiser, A., Kale, A., Novozhilova, E., Olivius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+Matrigel%C2%AE+on+the+survival+and+differentiation+of+a+human+neural+progenitor+dissociated+sphere+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The effects of Matrigel® on the survival and differentiation of a human neural progenitor dissociated sphere culture.</a> The Anatomical Record. 303 (3), 441-450 (2020).</li>
<li>Kakni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid+culture+in+polymer+film-based+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays.</a> Advanced Biosystems. 4 (10), 2000126(2020).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+self-organization+and+cortical+plate+formation+in+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).</li>
<li>Tejchman, A., Znój, A., Chlebanowska, P., Frączek-Szczypta, A., Majka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+fibers+as+a+new+type+of+scaffold+for+midbrain+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959(2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

EB'lerin standartlaştırılmış oluşumu, pluripotent kök hücrelerin beyin organoidlerine çoğaltılabilir dönüşümünde kritik bir adımdır. Kök hücrelerin tekil dokulara kuvvet toplanması, içbükey kuyucukların geometrisine, tohumlama yoğunluğuna ve iyi muameleye bağlı olarak değişebilir. Mevcut yöntem, 6 gün sonra 500-600 μm'lik bir çap aralığına işaret etse de, bu çaplar, diğer birçok çapın başarılı olduğu kanıtlandığı gibi, uygun organoid oluşumunun diğer çaplarını dışlamaz. Bununla birlikte, değişen çapların farklılaşma oranlarını ve başarıyı etkilediği gösterilmiştir29. Tekrarlanabilirlik amacıyla, 50 μm'nin altındaki çap değişimleri şiddetle tavsiye edilir20. Ek olarak, nöral indüksiyon günlerinin sayısı, EB'lerin çapının büyümesine izin vermek için 6 ila 10 gün arasında uzatılabilir, çünkü SMAD inhibitörlerinin kullanımının, sadece 5 günlük maruziyetten sonra nöroepitel oluşumunu verimli bir şekilde ürettiği ve sürdürdüğü gösterilmiştir30. SMAD inhibitörlerinin yokluğunda, nöral indüksiyon tutarsız sonuçlar verebilir ve daha uzun indüksiyon süreleri gerektirir. Bu çalışmada belirtilen SMAD inhibitörleri en etkili olanlardır, ancak diğer dorsomorfin ve TGF-β küçük moleküller etkili konsantrasyonlarında kullanılabilir.
Bazal membran matrisi, büyüme için mükemmel bir substrat sağlar ve farklı şekilde uygulanabilir. Matrisin erken kullanımları, bazal membranı bir kuyu kaplaması olarak içeriyordu31. Bununla birlikte, dokuyu gömmek için matrisin kullanılmasının, bu dokularda farklılaşmayı ve olgunlaşmayı iyileştirdiği gösterilmiştir32. Organoidler için, matrisin kullanımının EB'nin organoidlere farklılaşmasını iyileştirdiği, olgunlaşmayı teşvik ettiği ve kültür periyotlarını uzattığı gösterilmiştir33. Organoidler matriks olmadan hala oluşturulabilirken, birçok grup matrikssiz bir doku kültürü elde etmek için çaba sarf ettiğinden 34,35, çalışmalar matrikse gömülü organoidlerin uzun kültür süreleri için daha yüksek bir şansa sahip olduğunu ve daha az bakım gerektirdiğini bulmuştur36. Gamze gömme yöntemi, organoid yüzeyin eşit şekilde kaplanmasını sağlayarak benzer difüzyon, besin maddelerine erişim ve tekrarlanabilir farklılaşma sağlar. Alternatif olarak, organoidleri tamamen kapsüllemek için kubbe gömme kullanılabilir37.
EB'lerin membran matris çukurlarına aktarılması kritik bir adımdır. 1 mL'lik bir pipet ucu EB'leri aktarmak için yeterince geniş bir açıklığa sahip olsa da, aktarım kolaylığı için 200 μL'lik bir uç tercih edilir. Pipetleme sırasında kayma stresini azaltmak için pürüzsüz bir kenar sağlayan yeterince büyük bir açıklık oluşturmak için 200 μL uçların kesilmesi gerekir. Alternatif olarak, aktarım kolaylığı için geniş delikli 200 μL uçlar mevcuttur. Hızlı pipetleme organoid çevresini bozabileceğinden ve düzgün büyümeyi engelleyebileceğinden pipetleme yavaş yapılmalıdır. Besin sağlamak için yeterli ortamın aktarıldığından emin olmak için özel dikkat gösterilmelidir. Çok az ortam, organoidin kuruması ve nekroza neden olma riskini taşır. EB'yi çok fazla kültür ortamıyla aktarmak, matrisin çok seyreltilmesine ve organoidin güvenli bir şekilde kapsüllenememesine neden olabilir. İdeal olarak, matris, polimerizasyonunu sağlamak ve EB'ler için bir ECM olarak işlev görmek için% 50'den fazla seyreltilmemelidir. Gömme başarısız olursa, EB kurtarılabilir ve yeniden kapsüllenebilir. Taze matriste yeniden kapsülleme, organoide ek destek sağlamak için herhangi bir noktada yapılabilir.
İskele için matris gömmeye benzer şekilde, PLGA lifleri üç boyutlu büyüme için ek destek sağlar. Başlangıçta uzatılmış organoidler üretmek ve yüzey alanı38'i arttırmak için dahil edilen PLGA liflerinin dahil edilmesi, organoid farklılaşmasını ve olgunlaşmasını iyileştirmek için ek bir araç olarak aşamalı olarak tanımlanmıştır39. Daha fazla laboratuvar matrisin kullanımını azaltmaya veya tamamen ortadan kaldırmaya çalıştıkça, birleştirilmiş lifler tarafından desteklenen organoidlerin kendi kendini organize eden özellikleri, üç boyutlu doku oluşturma ve farklılaşma için yeterli iskele sağlar39. Burada, uzun vadeli kültür şansını artırmak için her iki yöntem birleştirildi38,39. İlk toplama sırasında liflerin dahil edilmesi kritiktir, çünkü bunlar daha sonraki bir aşamada tanıtılmayabilir. Santrifüjlemeden sonra, birkaç lifin toplanmış hücreler arasında olup olmadığını kontrol etmek, bir lifin EB'ye dahil edilmesini sağlayacaktır. Başarılı olmazsa, kuyunun nazik bir şekilde aspire edilmesi ve yeniden santrifüjleme karıştırmayı sağlamalıdır.
Organoid bakımında bir diğer kritik adım, daha iyi ortam perfüzyonu için bir orbital çalkalayıcının kullanılmasıdır. Organoid protokollerin erken yinelemelerinde, ajitasyon11'i oluşturmak için dönen bir biyoreaktör kullanıldı. 90 rpm'de bir orbital çalkalayıcı, matris damlacığını tahrip etmeden veya organoid morfolojiye zarar vermeden yeterli ajitasyon sağlar. Bazı gruplar matris iskelesini kullanmaktan kaçınır, ancak uygun bir ortam sağlamak için çalkalayıcı ajitasyonunu korurlar34. Tüm protokollerde olduğu gibi, kayma gerilimi miktarını azaltmak için çalkalayıcıya bağlı olarak rotasyonların hızı ayarlanmalıdır. Bir kubbe gömme seçilirse, kesme gerilmesi miktarınıazaltmak için eğimli bir çalkalayıcı kullanılabilir 11,34.
Birlikte ele alındığında, seçilen birkaç tekniğin entegrasyonu, iPSC kaynaklı organoid oluşumunun sağlam bir yöntemini sağlar. Organoidleri yaratmanın ve sürdürmenin birkaç yolu vardır, ancak birçoğu erken farklılaşma yörüngelerine odaklanır. Bu çalışmada, kültür organoidlerine uzun süreler, farklılaşma fazını geçmiş ve yaşlanma fenotiplerinin gelişmeye başlayabileceği bir olgunlaşma döneminde birçok farklı teknik birleştirilmiştir. Bu tekniklerin dahil edilmesi, kültürleri korumak için eksojen biyolojik faktörlere ihtiyaç duymadan, kendi kendini organize etmeyi ve yaşlanmanın doğal ilerlemesini koruyarak uzun süreli olgunlaşmaya izin verir.

Yaşlanma hastalığı modelleri, insan yaşam beklentisi artmaya devam ettikçe giderek daha alakalı hale gelmiştir. Büyük ölçekli genomik çalışmalar, moleküler süreçlerin düzensizliği ve yaşam kalitesini etkileyen genetik değişiklikler ile yaşlı popülasyonları ortaya çıkarmıştır1. Yaşlanma süreci, bilişsel işlev kaybı, nörodejeneratif bozukluklar için artmış risk ve bir dizi kronik hastalık2 dahil olmak üzere organizmanın genel işlevsellik kaybı ile karakterizedir.
Mevcut hücre kültürü teknikleri, yaşlanmanın çok faktörlü doğasını uygun şekilde temsil etmemektedir, çünkü bu işlev bozuklukları mutasyonlar, toksinler veya enfeksiyonlar kullanılarak düzgün bir şekilde çoğaltılamaz3. Yaşlanma sürecini araştıran hayvan modelleri genellikle uzun deneysel süreler ve yüksek maliyetlerle ilişkilidir, ancak aynı zamanda etik hususları da beraberinde getirir. Hastalardan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) kullanılması, iPSC'lerin hücrelerin olgun dokuya doğal gelişimine izin vermesi nedeniyle hastalığın ilerlemesinin altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatabilir3. iPSC'ler, nörodejeneratif bozuklukları araştıran birçok laboratuvarın çalışan atı haline gelmiştir, çünkü hasat edilen hücrelerin hücresel olarak yeniden programlanması, donörlerin hastalık veya yaşlanma izlerini silmiyor gibi görünmektedir4. Bu izler, insan ve hayvan modellerinde gösterilen hücresel fenotipleri özetleyerek, iPSC'leri oldukça yoğun beyin dokusunun bireysel hücresel bozulmasını incelemek için uygun hale getirir 5,6. IPSC türevli organoidler, dokunun üç boyutlu kültürlenmesi için önde gelen model haline gelmiş, daha karmaşık hücreden hücreye etkileşimlere ve gelişmiş bir gelişimsel özetlemeye olanak sağlamıştır. Öncelikle gelişimsel veriler için kullanılmasına rağmen, organoidler hastalık modellemesine, özellikle inflamasyon, nörodejenerasyon ve yaşlanma modellerine giderek daha fazla uygulanmaktadır7. Önceki iPSC çalışmalarına dayanarak, organoidler hastalık fenotiplerini ve hücresel fenotipleri doku benzeri ağ bağlantılarının fizyolojik bağlamında tutar 8,9. Bununla birlikte, belirli boyutlardaki üç boyutlu dokuyu kültürlemek, özellikle uzun süreler boyunca zor olabilir.
Bu çalışma, dokunun daha uzun süreler boyunca büyük ölçüde olgunlaşmasını sağlayan serebral organoidlerin tekrarlanabilir üretimi için ayrıntılı bir yöntem sunmaktadır. Serebral organoid oluşumu nispeten standartlaştırılmış kalmıştır ve birkaç önemli protokolden yöntemler benimsenmiştir10,11. Bununla birlikte, gelişmiş farklılaştırma ve bakım için çeşitli değişiklikler önerilmiştir. Bu alternatif yöntemler arasında nöral farklılaşmayı arttırmak için nörojenik faktörlerin kullanılması12, hücresel uzun ömürlülüğü teşvik eden gelişmiş besin değişimi için ek iskeleler 13 ve uzun süreli kültür ve büyüme için düşük saf stres ajitasyonu14 bulunmaktadır. Bu gelişmeler, nörodejeneratif ve yaşlanma fenotiplerini eksprese edebilen olgun organoidler geliştirmek için bu yönteme dahil edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>2-&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindolidihidroklorür (DAPI)</td><td>İnvitrojen</td><td>D1306</td><td>1:4000</td></tr><tr><td>6 kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı CELLSTAR Hücre Kültürü Çok Kuyulu Plaka&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657185</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Şeffaf Düz Tabanlı Ultra Düşük Bağlantı Kuyusu</td><td>Plakası Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu Şeffaf Yuvarlak Tabanlı Ultra Düşük Bağlantılı</td><td>Mikroplaka Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyulu, Nunclon Delta İşlemli, Düz Tabanlı Mikroplaka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46964</td><td>Hücre Ayırma Çözeltisi&nbsp;</td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi (A Vitamini ile) (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 Takviyesi (eksi A Vitamini) (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer ve ticaret; Cam Mononükleer Hücre Hazırlama (CPT) Tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-685-125</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Plaka tutucular</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune Sendai Yeniden Programlama</td><td>Vektörü Thermo Fisher Scientific</td><td></td> A1378001 <td></td></tr><tr><td>ddPCR primerleri | insan | MAPT</td><td>Bio-Rad</td><td>dHsaCPE192234</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR primerleri | insan | RBFOX3 (NeuN)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>dHsaCPE5052108</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>Doublecortin (DCX)</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-8066</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>kalsiyum içermez, magnezyum içermez</td></tr><tr><td>Eppendorf kapları, 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.215</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel 6</td><td>Gibco</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td></td> Etilendiamintetraasetik <td></td> asit (EDTA) A1517001 <td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpleri, 15 mL, konik</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271-N Formaldehit</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>%37 Stok çözeltisi, PBS Geltrex LDEV'de %4'e seyreltilmiş</td></tr><tr><td>LDEV-Free Azaltılmış Büyüme Faktörü Bazal Membran Matrisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Hemasitometre hücre sayacı</td><td>Hausser scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>LDN 193189</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>72147</td><td></td></tr><tr><td>MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab32454</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, LDEV-free</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>bazal membran matrisi</td></tr><tr><td>MEM-Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (MEM-NEAA; 100x)</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Çok Etiketli Sayaç Victor 3 Plaka Okuyucu</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>1420</td><td>luminometre</td></tr><tr><td>MycoAlert Mikoplazma Tespit Kiti</td><td>Lonza</td><td>LT07-318</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Nörobazal Orta</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Ekim-3/4 Antikor (C-10) Alexa Fluor 647</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-5279 AF647</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>termoplastik film levha</td></tr><tr><td>PAX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42-6600</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) mikrofilamentler</td><td>Ethicon</td><td>J463</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık dijital PCR sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü (Y27632)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>1614/50</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Monoklonal Antikor (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>53-9811-80</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Synapsin I (SYN)</td><td>Calbiochem</td><td>574777</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Triton-X 100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-80005</td><td>Beta-3-tubulin; 1:500</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Tocris Biyobilim</td><td>3748</td><td></td></tr></tbody></table>

yaşlanma araştırmaları için ipsc kaynaklı beyin organoidlerinin uzun süreli kültürü için sağlam doku Üretimi

Robust Tissue Fabrication for Long-Term Culture of iPSC-Derived Brain Organoids for Aging Research

Şu anda mevcut olan hayvan ve hücresel modeller, yaşlanan insan beyninde meydana gelen değişikliklerin karmaşıklığını tam olarak özetlememektedir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen insan serebral organoidlerinin neslini tanımlayan prosedürlerin yeni bir gelişimi, insan beyninin yaşlanmasını ve ilgili patojenik süreçleri modelleme ve anlama yeteneğini temel olarak dönüştürme potansiyeline sahiptir. Burada, insan iPSC türevi serebral organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi, yaşlanması ve karakterize edilmesi için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol, beyin organoidlerini tekrarlanabilir bir şekilde üretmek için uygulanabilir ve kültürde organoid olgunlaşması ve yaşlanması ile sonuçlanan en son teknikleri içeren adım adım bir rehber görevi görür. Organoid olgunlaşma, nekroz, değişkenlik ve toplu etkilerle ilgili spesifik konular ele alınmaktadır. Birlikte ele alındığında, bu teknolojik gelişmeler, çeşitli genç ve yaşlı insan donörlerinden türetilen organoidlerde ve ayrıca yaşa bağlı beyin bozukluklarından muzdarip bireylerde beyin yaşlanmasının modellenmesine izin verecek ve insan beyni yaşlanmasının fizyolojik ve patojenik mekanizmalarının tanımlanmasına izin verecektir.

PLGA liflerinin, çukur gömmenin ve ajitasyonun entegre edilmesi, iPSC türevi kültürlerin uzun süre korunmasını sağlayan sağlam bir serebral organoid nesline yol açar (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig01.jpg"> Şekil 1: Bu yöntemin iş akışının ve zaman çizelgesinin şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
İlk nöral indüksiyon periyodu daha önce yayınlanmış prosedürlerle karşılaştırılabilir11. Embriyoid cisimler (EB) beyaz veya şeffaf kenarlı dairesel agregalar olarak başlar (Şekil 2B). EB, DIV7'de nöral indüksiyon ortamından nöral bakım ortamına dönüştüğünde, dairesel dokudan 24 saat içinde çıkıntılar ve tomurcuklanmalar ortaya çıkar (Şekil 2C). Ayrıca, organoid büyümeye devam ettikçe, PLGA lifinin yüzey alanı organoidin uzamasına yardımcı olur (Şekil 2D). Olgunlaşma sırasında, organoidin kenarlarının, sağlıklı hücrelerin ve gelişimin iyi bir işareti olduğu için bozulmadan kalması gerekir; aksi takdirde ek besin maddeleri sağlanmalıdır13 (Şekil 2E). Organoidlerin büyümesi, organoid kültürün ajitasyonu ile daha da kolaylaştırılır, çünkü bu, besinlerle perfüzyonu iyileştirir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig02.jpg"> Şekil 2: Serebral organoidlerin farklılaşması ve olgunlaşması . (A<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig06large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig07.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig07large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr></tbody></table>

Mevcut protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen serebral organoidlerin çoğaltılabilir üretimi, bakımı ve yaşlanması için adım adım bir prosedür sunmaktadır. Bu yöntem, beyin yaşlanması ve yaşa bağlı patogenezde yer alan süreçlerin modellenmesini kolaylaştıran serebral organoidlerin uzun süreler boyunca kültürlenmesini ve olgunlaşmasını sağlar.

Yaşlanma Araştırmaları için iPSC Kaynaklı Beyin Organoidlerinin Uzun Süreli Kültürü için Sağlam Doku Üretimi

The currently available animal and cellular models do not fully recapitulate the complexity of changes that take place in the aging human brain. A recent ...

Protokolümüz, uzun süreli organoid bakımı için etkili olduğu kanıtlanmış çeşitli teknikleri birleştirdi. Bu, klinik belirtilerin gelişim döneminin dışında olduğu yaşa bağlı hastalıklarda yaşlanmayı incelemek için yararlıdır. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir özel ekipman veya reaktif gerektirmemesidir.Ağırlıklı olarak laboratuvarda yaygın olarak bulunan malzemelere dayanmaktadır. Yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıklar, mevcut modelleme yöntemlerimiz çoğunlukla erken gelişimsel aşamalardan ziyade yerleşik hastalık fenotiplerine odaklandığı için özel bir ilgi noktası haline gelmiştir. Embriyonik kök hücreler ve iPSC'ler çok hassas hücrelerdir.İlk kez kullananlar nazik olmalı ve sabırlı olmalıdır. Bunlar uzun süreli kültürler olduğundan, baştan beri sabırlı olunmalıdır Başlamak için, bir dikiş ipliğine %70 etanol püskürtün ve dikiş ipliğini neşterin kör ucuyla yıpratarak PLGA mikrofilamentleri hazırlayın. Elyafı mikroskop altına yerleştirin.Ve bir cetvel kullanarak, lifi 500 mikrometre ila bir milimetre uzunluğundaki iplikçiklerden oluşan parçalar halinde kesmeye başlayın. Toplamda yaklaşık 25 milimetre lif kesin ve filamentleri bir mililitre Antibiyotik-Antimikotik çözelti içeren 15 mililitrelik bir tüpe ekleyin. Daha sonra, davlumbazda, iyice karıştırmak için fiber çözeltisini 10 mililitre DMEM / F-12 ve vorteks ile seyreltin.Ardından, 96 delikli bir plakanın üç kuyucuğuna 20 mikrolitre fiber çözeltisi ekleyin. Parlak alan mikroskobu kullanarak, kuyu başına lifleri sayın ve ortalamasını alın. Kuyucukları elyaf çözeltisi ile kuyu başına ortalama 5 ila 10 mikrofilamente seyreltin veya konsantre edin.Daha önce kültürlenmiş indüklenmiş pluripotent kök hücreler% 70 ila% 80 akıcılığa ulaştığında, hücreleri mikroskop altında 10 veya 20x büyütmede kontrol edin. Kolonilerin% 10'dan daha az spontan farklılaşma alanı gösterdiğinden emin olun. Ortamı bir pipetle aspire edin ve hücreleri bir kez DPBS ile yıkayın.Daha sonra, kolonileri ayrıştırmak için 500 mikrolitre hücre ayrılma çözeltisi veya 0.5 milimolar EDTA ekleyin ve üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, her bir kuyucuğa bir mililitre taze E8 ortamı ekleyin ve tüm hücreleri ayırmak için yavaşça pipet yapın. Tüm hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir mililitre daha taze E8 ortamı ekleyin.Ardından, hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 290 g'da döndürün. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini 50 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş E6 ortamının bir mililitresinde yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. ROCK inhibitörü ile desteklenmiş E6 ortamında istenen oturma yoğunluğuna sahip bir hücre süspansiyonu hazırlayın.Ardından, 96 delikli ultra düşük bir bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna 150 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, hücreleri toplamaya zorlamak için plakayı oda sıcaklığında üç dakika boyunca 290 g'da santrifüj edin. Daha sonra, embriyoid vücut oluşumu için% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir atmosferde plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.24 saatlik inkübasyondan sonra, plakayı davlumbaza aktarın ve pipet ucunu kuyuya çok fazla indirerek embriyoid gövdesini aspire etmemeye dikkat ederek, bir pipet kullanarak ortamın 120 mikrolitresini dikkatlice aspire edin. Daha sonra, iki mikromolar XAV939 ile desteklenmiş 150 mikrolitre taze E6 ortamı ve her bir kuyucuğa SMAD inhibitörleri ekleyin. Plakayı inkübatöre geri aktarın ve ortamı günlük olarak inhibitörlerle desteklenmiş taze hazırlanmış E6 ile değiştirin.İnkübasyonun yedinci gününde, tüm embriyoid cisimlerinin 550 ila 600 mikrometre çapa ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin ve pürüzsüz, net bir kenar gösterin. Bu aşamada, hücre dışı bir matrise gömülmeye hazırdırlar. Organoidleri gömmek için, boş bir P200 kutusuna dört inç uzunluğunda bir termoplastik tavan filmi tabakası yerleştirerek çukurlu gömme tabakaları hazırlayın.Daha sonra, 15 mililitrelik bir konik tüp veya 500 mikrolitrelik bir mikro santrifüj tüpü kullanın ve 12 veya istenen sayıda çukur yapmak için film tabakasını yavaşça deliklere bastırın. Daha sonra, film tabakasına% 70 etanol püskürtün ve UV ışığı açıkken davlumbazın içinde en az 30 dakika kurumasını bekleyin. Bu arada, yeterli miktarda bazal membran matrisini buz üzerinde çözün.Daha sonra, geniş delikli bir P200 ucu kullanarak, 96 delikli plakadan her bir çukura bir embriyoid gövdesi aktarın. Normal bir pipet ucuyla mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın, ancak embriyoid gövdesinin kurumasına izin vermeyin. Daha sonra, düzenli olarak önceden soğutulmuş bir P200 ucu ile, her organoide yaklaşık 30 mikrolitre seyreltilmemiş membran matrisi ekleyin ve embriyo gövdesinin damlacığın merkezine mümkün olduğunca yakın olmasını sağlayın.Tüm embriyoid cisimler matrise gömüldükten sonra, film tabakasını steril bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, membran matrisinin katılaşmasını sağlamak için Petri kabını% 5 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir atmosferde 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Organoid farklılaşması için, hazırlanan farklılaştırma ortamının beş mililitresini, ultra düşük bir bağlantı 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna A vitamini olmadan B-27 ile ekleyin.Plakayı bir inkübatörde önceden 37 santigrat dereceye ısıtın. Membran matrisi katılaştıktan sonra, çukurları film tabakasının arkasından iterek gömülü embriyoid gövdelerini 6 delikli plakaya aktarın. Gerekirse, kuyudan bir mililitre ortam kullanın ve damlacıkları film tabakasından ayırmak için tabakanın üzerine borulayın.Membran matriksindeki gömülü embriyoid cisimler, in vitro 10 gün boyunca farklı tomurcuklanma oluşumları gösteren serebral organoidlere doğru farklılaştı. İn vitro 30. günde, organoidler çukur veya sandviç gömme kullanılarak daha da olgunlaştırılır. Uzun süreli kültür, serebral organoidlerin önemli boyutlara büyüdüğünü gösterir.İn vitro yedi günde, embriyoid cisimler SOX2 pozitif nöral rozetleri, dağınık olgunlaşmamış nöronları ve nöral progenitör hücreleri gösterir. Oysa gün geçtikçe in vitro 120, MAP2 ve NeuN gibi olgun nöronal belirteçler sergilerler. Bu sitoiskelet belirteçleri, sinaptik plastisite ve yaşa bağlı diğer düşüşlerin yanı sıra astrositler ve glia gibi ek beyin dokusunu araştırmak için doublekortin ve sinapsin gibi diğer postmitotik belirteçlerle birlikte kullanılabilir.Dokunun kenarlarının sağlam kalmasını sağlamak çok önemlidir. Zararlı kesme kuvvetini en aza indirmek için, örneğin ortam ve organoid gömme değiştirilirken borulama yavaşça yapılmalıdır. Yavaşlamış organoid büyüme, hastalığın erken hücresel belirtilerde ilerlemesini incelememizi sağlar.Organoid oluşumu birçok hastalığın tedavisinde erken teşhisin önünü açmaktadır.

robust-tissue-fabrication-for-long-term-culture-ipsc-derived-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) serebral organoidler üretmek için bir testi göstermektedir. İnsan iPSC'leri embriyoid cisimler (EB'ler) oluşturmak için indüklenir. EB'ler, bir indüksiyon ortamı kullanılarak bir polimer iskele üzerinde kültürlenir ve nöral kök hücrelere, progenitör hücrelere ve olgunlaşmamış nöronlara farklılaşmayı teşvik eder. Son olarak, EB'ler bir matrise gömülür ve serebral organoid oluşumu için bir bakım ortamına aktarılır.

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Serebral organoids erken insan beyni geliştirme vitroaraştırmak için yeni bir modeli sistemi temsil eder. Bu makale verimli bir şekilde homojen dorsal ön-tipi organoids İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre de dahil olmak üzere kritik karakterizasyonu ve doğrulama adımları oluşturmak için ayrıntılı yöntembilim sağlar.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi beyin organoidlerinin üretimi ve mitokondriyal hastalıkların modelinde kullanımları için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Mitokondriyal Hastalık Modellemesi için İnsan Beyni Organoidlerinin Üretimi

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

Bu çalışmada, standart besleyicisiz hPSC kültürlerini kullanarak basit ama sağlam bir kortikal organoid kültür sistemi için ayrıntılı bir teknik sunuyoruz. Bu, in vitro beyin yaşlanmasının yönlerini modelleyen organoidler üretmek için hızlı, verimli ve tekrarlanabilir bir protokoldür.

Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Yeniden Üretilebilir Üretimi In Vitro

Bu protokol, yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonu ile birlikte tanımlamakta ve insan nörodejeneratif bozuklukları için kök hücre bazlı tedavileri daha fazla test etmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır.

İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri

Bu yazıda, hücresel replasman tedavilerini test etmek için ex vivo bir model olarak nöral kök hücrelerle nakledilen uzun süreli omurilik organotipik dilimleri oluşturmak ve sürdürmek için tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz.

Omurilik Yaralanmasında Hücre Transplantasyonunu Doğrulamak için Bir Platform Olarak Uzun Süreli Fare Omurilik Organotipik Dilim Kültürü

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi hematopoietik progenitör hücreleri (HPC'ler) organoid gelişimine dahil ederek yerleşik mikroglialı bir insan beyni organoidi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

Burada, genotip-fenotip bağımlılıklarını araştırmak ve glioblastoma tedavisi için potansiyel ilaçları taramak için laboratuvar mühendisliği glioblastoma organoidleri (LEGO) üretmek ve kullanmak için kapsamlı bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz.

Laboratuvar Mühendisliği: Glioblastoma Organoid Kültürü ve İlaç Taraması

Keşfedin iPSC kaynaklı beyin organoidlerinin uzun süreli kültür protokolünü. Bu yöntem, yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıkları in vitro ortamda modellemek için kullanılabilir.

Yaşlanma Araştırmaları için iPSC Kaynaklı Beyin Organoidlerinin Uzun Süreli Kültürü için Sağlam Doku Üretimi

Daha fazla video keşfet