Saccharomyces cerevisiae'de Haploidlerin Çiftleşme Etkinliğinin Belirlenmesi
December 2nd, 2022
Bu çalışmada, maya Saccharomyces cerevisiae'de çiftleşme verimliliğinin ölçülmesi için sağlam bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, türleşme çalışmalarında zigotik öncesi bariyerlerin nicelleştirilmesi için özellikle yararlıdır.
Bu protokol, farklı suşların ve maya türlerinin birbirleriyle çiftleştiği verimliliği ölçmek için basit bir yöntemdir. Önerilen yöntem basit, sağlam ve verimlidir. Yöntem, herhangi bir maya suşuna genişletilebilir.
Bu çalışmada açıklanan yöntem, mayada türleşmenin nasıl gerçekleştiğini anlamak için kullanılabilir. Dahası, tanımladığımız suşlar, gen akışı ile deneyler tasarlamak için özellikle yararlı olabilir. Yöntemin gücü, gerçekten basit olmasıdır.
Kullanılan belirli suşa bağlı olarak inkübasyon zamanı gibi bazı küçük ayarlamalar gerekebilir. Maya inokulumunu bir maya ekstresi, pepton dekstroz veya YPD agar plakası üzerine çizerek dondurulmuş stoklardan haploidleri A ve Alfa'yı canlandırmaya başlayın. Tek koloniler elde etmek için 30 santigrat derecede 48 saat büyümelerine izin verin.
Kuluçkadan sonra, YPD plakasından ve beş mililitre YPD ortamından tek kolonileri aşılayın ve 250 RPM sallama ile 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler bu inkübasyon döneminden sonra büyümenin durağan fazındadır. Yeni bir YPD plakasında, çiftleşme verimliliği ızgarasını, her biri 1 x 0,5 santimetre boyutunda üç kutuya bölünmüş 1 x 1,5 santimetrelik bir dikdörtgen olarak çizin.
İki çiftleşme tipinin YPD kültürünün beş mikrolitresini en soldaki ve en sağdaki dikdörtgenlere aşılayın. Bu hacim, her bölümdeki beşinci haploid hücrelere kabaca 5 kez 10 ila 10 karşılık gelir. Plakaları 30 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin.
Eşit sayıda maya hücresini karıştırmak için, steril bir kürdan kullanarak dış kutularda gelişen maya büyümesinin yaklaşık 1 / 3'ünü çıkarın ve çıkarılan hücreleri steril 1.5 mililitrelik bir şişede 20 mikrolitre suda yeniden askıya alın. Her haploid için bunu takip edin. Daha sonra, bu süspansiyonun beş mikrolitresini iki mililitre suda seyreltin ve 600 nanometrede bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu ölçün.
Optik yoğunluk değerine ve bir optik yoğunlukta mililitre başına hücre sayısına dayanarak, her iki haploidin gerekli hacimlerini taze ve steril 1.5 mililitrelik bir şişeye ekleyin. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Bu süspansiyonun son hacmi genellikle altı ila sekiz mikrolitre civarındadır.
Ardından, bu süspansiyonu orta ızgaraya aşılayın. Plakayı yedi saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve haploidlerin çiftleşmesine izin verin. Yedi saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri bir kürdan veya pipet ucu kullanarak merkez dikdörtgenden kazıyın ve iki mililitre steril suda seyreltin.
Daha fazla seyreltme yapın ve daha sonra tek koloniler elde etmek için hücre süspansiyonunu YPD agar üzerine yayın. Kaplamadan sonra, tek koloniler geliştirmek için YPD plakalarını 36 ila 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Verilerin istatistiksel anlamlılığını sağlamak için tarama için her çiftleşme deneyinden birkaç yüz bireysel koloni elde edildiğinden emin olun.
Plaka üzerindeki diploid kolonileri tanımlamak için, tek kolonileri, suşların öksotrofik olduğu amino asitlerden yoksun olan çift bırakma plakasına ayrı ayrı çizerek aktarın. Plakaları 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve çiftleşme verimliliğini hesaplayın, nu. Protokolün sağlamlığı, iki suş, SK1AM ve ScAM arasındaki çiftleşme verimliliğinin kolayca ayırt edilmesini sağladı.
SK1 suşları çok yüksek bir verimlilikle çiftleşirken, ScAM suşları nispeten daha düşük bir verimlilikle çiftleşti. ScAM suşlarının çiftleşme verimliliği, çevre birincil karbon kaynağı olarak glikoz içermediğinde önemli ölçüde düşmüştür, bu da çiftleşmenin enerjik olarak pahalı bir süreç olduğunu ve alternatif karbon kaynaklarındaki büyümenin çiftleşmenin verimliliğini niteliksel olarak azalttığını göstermektedir. Farklı zaman dilimlerinde çiftleşmelerine izin verildiğinde, ilk dört ila beş saat boyunca çiftleşme gözlenmedi.
İlk diploidler sadece dört ila beş saat sonra ortaya çıktı, bu da çiftleşme işleminin verilen ortamda tamamlanması için gereken süre olduğunu gösteriyor. Bundan sonra, çiftleşme verimliliği hızla arttı. Yedi saatin ötesinde, çiftleşme verimliliği hesaplamaları, mitotik büyümenin plakada başladığı gerçeğinden etkilendi.
Her iki haploidin eşit sayıda karıştırıldığından emin olun. Bundan sapmalar, protokolün bağımsız tekrarlarında değişikliklere yol açacaktır. Gen akışının adaptasyonu ve türleşmeyi nasıl etkilediği açık bir sorudur.
Öksotrofik belirteçler, suşlarımızdaki MAT lokusunun yanına yerleştirildiğinden, bu önemli sorunun ele alınmasına yardımcı olur.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, Saccharomyces cerevisiae mayalarının çeşitli suşlarının çiftleşme verimliliğini ölçmek için türleşme çalışmalarıyla ilgili ön-zigot engellerini odaklanan sağlam ve basit bir yöntem sunmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Maya çiftleşme verimliliği
- Türleşme çalışmaları
- Gen akışı deneyleri
Arka Plan
- Çiftleşme verimliliği, mayada türleşmeyi anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Protokol, farklı maya suşları ve koşulları ile deney yapılmasını sağlar.
- Çiftleşme başarısındaki değişkenlik, evrimsel süreçler hakkında bilgi sağlayabilir.
Kullanılan Yöntemler
- Dondurulmuş stoklardan maya suşlarının canlandırılması ve YPD ortamında büyütülmesi
- Kontrollü inkübasyonlarla haploid çiftleşme verimliliğinin ölçülmesi
- Hücre konsantrasyonunu değerlendirmek için optik yoğunluk ölçümleri
Ana Sonuçlar
- SK1AM ve ScAM suşları arasında çiftleşme verimliliğinde önemli farklılıklar gözlemlendi.
- Glukoz yokluğunda çiftleşme verimi azalır ve metabolik talepleri vurgular.
- Zamana bağlı çiftleşme verimliliği kalıpları belgelendi, bu da inkübasyon süresinin önemini vurgulamaktadır.
Sonuçlar
- Protokol, çiftleşme verimliliğini ölçmek için etkilidir ve gen akışı ile adaptasyon hakkında bilgiler sunar.
- Bulgular, türleşme ve evrimsel biyoloji ile ilgili soruları cevaplamaya yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantifying mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of pre-zygotic reproductive barriers, supporting mechanistic de-risking in genetic and evolutionary studies. This robust protocol provides standardized, reproducible outputs critical for early discovery and target validation in yeast-based model systems. Reliable measurement of mating efficiency informs portfolio decisions in strain engineering and gene flow experiments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of reproductive isolation and gene flow between yeast strains.
- Supports functional validation of genetic modifications impacting mating pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pre-zygotic barriers in model systems.
- Provides reproducible data for hypothesis-driven strain selection and triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative outputs for mating efficiency across diverse yeast backgrounds.
- Supports assay reproducibility through controlled mixing, incubation, and colony quantification.
- Enables scalable screening of genetic or environmental variables affecting mating success.
- Prepares validated biological systems for downstream genetic or phenotypic screens.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by quantifying functional reproductive outcomes.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation in yeast models.
- Supports risk-adjusted advancement of engineered strains for further study.
- Provides predictive confidence for gene flow and adaptation studies relevant to evolutionary biology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, enabling robust hypothesis testing and biological de-risking in yeast genetics workflows.
- Discovery Biology: Quantifies mating efficiency to test genetic or environmental hypotheses about reproductive barriers.
- Screening: Standardizes assay conditions for reproducible, quantitative comparison of strain performance.
- Analytics: Employs optical density and colony counts for objective, statistical measurement of mating outcomes.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical model validation in yeast-based systems.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, strain-agnostic protocol for repeated use across genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of yeast mating assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in strain engineering pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of strains and experimental conditions for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics and sterile technique for accurate execution.
- Needs access to standard microbiology instrumentation, including incubators and spectrophotometers.
- Demands cross-team standardization of incubation times, cell mixing, and colony quantification.
- Adaptable to various yeast strains with minor protocol adjustments for strain-specific growth rates.
- Dependent on auxotrophic marker availability for clear haploid/diploid distinction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Patching of Haploids in the Mating Efficiency Grids
1:55
Mixing of Haploids and Mating
2:55
Plating of Mixed Cells on YPD Agar and Screening for Diploids using Auxotrophic Markers
3:53
Results: Quantification and Dynamics of Mating Efficiency in Saccharomyces cerevisiae (Yeast)
5:03
Conclusion
