Saccharomyces cerevisiae'de Haploidlerin Çiftleşme Etkinliğinin Belirlenmesi

Bu protokol, farklı suşların ve maya türlerinin birbirleriyle çiftleştiği verimliliği ölçmek için basit bir yöntemdir. Önerilen yöntem basit, sağlam ve verimlidir. Yöntem, herhangi bir maya suşuna genişletilebilir.

Bu çalışmada açıklanan yöntem, mayada türleşmenin nasıl gerçekleştiğini anlamak için kullanılabilir. Dahası, tanımladığımız suşlar, gen akışı ile deneyler tasarlamak için özellikle yararlı olabilir. Yöntemin gücü, gerçekten basit olmasıdır.

Kullanılan belirli suşa bağlı olarak inkübasyon zamanı gibi bazı küçük ayarlamalar gerekebilir. Maya inokulumunu bir maya ekstresi, pepton dekstroz veya YPD agar plakası üzerine çizerek dondurulmuş stoklardan haploidleri A ve Alfa'yı canlandırmaya başlayın. Tek koloniler elde etmek için 30 santigrat derecede 48 saat büyümelerine izin verin.

Kuluçkadan sonra, YPD plakasından ve beş mililitre YPD ortamından tek kolonileri aşılayın ve 250 RPM sallama ile 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler bu inkübasyon döneminden sonra büyümenin durağan fazındadır. Yeni bir YPD plakasında, çiftleşme verimliliği ızgarasını, her biri 1 x 0,5 santimetre boyutunda üç kutuya bölünmüş 1 x 1,5 santimetrelik bir dikdörtgen olarak çizin.

İki çiftleşme tipinin YPD kültürünün beş mikrolitresini en soldaki ve en sağdaki dikdörtgenlere aşılayın. Bu hacim, her bölümdeki beşinci haploid hücrelere kabaca 5 kez 10 ila 10 karşılık gelir. Plakaları 30 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin.

Eşit sayıda maya hücresini karıştırmak için, steril bir kürdan kullanarak dış kutularda gelişen maya büyümesinin yaklaşık 1 / 3'ünü çıkarın ve çıkarılan hücreleri steril 1.5 mililitrelik bir şişede 20 mikrolitre suda yeniden askıya alın. Her haploid için bunu takip edin. Daha sonra, bu süspansiyonun beş mikrolitresini iki mililitre suda seyreltin ve 600 nanometrede bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu ölçün.

Optik yoğunluk değerine ve bir optik yoğunlukta mililitre başına hücre sayısına dayanarak, her iki haploidin gerekli hacimlerini taze ve steril 1.5 mililitrelik bir şişeye ekleyin. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın. Bu süspansiyonun son hacmi genellikle altı ila sekiz mikrolitre civarındadır.

Ardından, bu süspansiyonu orta ızgaraya aşılayın. Plakayı yedi saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve haploidlerin çiftleşmesine izin verin. Yedi saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri bir kürdan veya pipet ucu kullanarak merkez dikdörtgenden kazıyın ve iki mililitre steril suda seyreltin.

Daha fazla seyreltme yapın ve daha sonra tek koloniler elde etmek için hücre süspansiyonunu YPD agar üzerine yayın. Kaplamadan sonra, tek koloniler geliştirmek için YPD plakalarını 36 ila 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Verilerin istatistiksel anlamlılığını sağlamak için tarama için her çiftleşme deneyinden birkaç yüz bireysel koloni elde edildiğinden emin olun.

Plaka üzerindeki diploid kolonileri tanımlamak için, tek kolonileri, suşların öksotrofik olduğu amino asitlerden yoksun olan çift bırakma plakasına ayrı ayrı çizerek aktarın. Plakaları 48 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve çiftleşme verimliliğini hesaplayın, nu. Protokolün sağlamlığı, iki suş, SK1AM ve ScAM arasındaki çiftleşme verimliliğinin kolayca ayırt edilmesini sağladı.

SK1 suşları çok yüksek bir verimlilikle çiftleşirken, ScAM suşları nispeten daha düşük bir verimlilikle çiftleşti. ScAM suşlarının çiftleşme verimliliği, çevre birincil karbon kaynağı olarak glikoz içermediğinde önemli ölçüde düşmüştür, bu da çiftleşmenin enerjik olarak pahalı bir süreç olduğunu ve alternatif karbon kaynaklarındaki büyümenin çiftleşmenin verimliliğini niteliksel olarak azalttığını göstermektedir. Farklı zaman dilimlerinde çiftleşmelerine izin verildiğinde, ilk dört ila beş saat boyunca çiftleşme gözlenmedi.

İlk diploidler sadece dört ila beş saat sonra ortaya çıktı, bu da çiftleşme işleminin verilen ortamda tamamlanması için gereken süre olduğunu gösteriyor. Bundan sonra, çiftleşme verimliliği hızla arttı. Yedi saatin ötesinde, çiftleşme verimliliği hesaplamaları, mitotik büyümenin plakada başladığı gerçeğinden etkilendi.

Her iki haploidin eşit sayıda karıştırıldığından emin olun. Bundan sapmalar, protokolün bağımsız tekrarlarında değişikliklere yol açacaktır. Gen akışının adaptasyonu ve türleşmeyi nasıl etkilediği açık bir sorudur.

Öksotrofik belirteçler, suşlarımızdaki MAT lokusunun yanına yerleştirildiğinden, bu önemli sorunun ele alınmasına yardımcı olur.