Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi
6 Ekim 2022
Bu protokol, bitki apoplastı içinde yetiştirilen Pseudomonas şırıngası popülasyonları üzerinde tek hücreli gen ekspresyon analizine izin veren bir yöntemi açıklamaktadır.
Protokolümüz, yaprak apoplastında yetişen bakteri popülasyonlarının geri kazanılmasını sağlayan nazik bir bitki aşılama ve ekstraksiyon yöntemi sağlar, bu da akış sitometrisi gibi tek hücreli gen ekspresyon analizi için uygundur. Bu yöntem, numuneleri bitki hücresel kalıntıları ile önemli ölçüde kirletmeden apoplasttan önemli miktarda bakterinin ekstraksiyonuna izin verir. Apoplastik bakterilerin geri kazanımı için optimize edilmiş bu yöntem, bitki patojenik bakterileri veya faydalı endositik bakterileri içeren bir dizi bitki bakteri sistemine doğrudan veya küçük değişikliklerle uygulanabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Nieves Lopez-Pagan olacaktır. Başlamak için, 10 santimetre çapında bir tencereyi önceden sulanmış 1:3 vermikülit bitki substratı karışımı ile doldurun. Tencereyi delikli bir metal ağ ile örtün ve metal ağı lastik bir bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın.
Daha sonra, Arabidopsis tohumlarını ıslak bir kürdan ile metal ağın deliklerine ekin. Üç ila dört tohumu tencerenin içinde uzak pozisyonlara yerleştirin. Yüksek bağıl nemi korumak için tencereyi plastik bir kubbe ile örtün ve 72 saat boyunca dört santigrat derecede tabakalaşma için inkübe edin.
Saksıyı kısa gün koşullarında bir bitki büyüme odasına aktarın. Tencereyi ortaya çıkarmak için plastik kubbeyi çıkarın. Tohumlar çimlendikten sonra, fidelerin çoğunu çıkarmak için cımbız kullanın, saksının her birinde bir fide tutun.
Daha sonra bir Petri kabının altını ıslak bir kağıt havluyla kaplayarak ve fasulye tohumlarını üstüne yerleştirerek Phaseolus vulgaris fasulye bitkilerini hazırlayın. Petri kabını cerrahi bantla kapatın ve üç ila dört gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Çimlenmiş tohumları ıslak 1: 3 vermikülit bitki substratı karışımı ile doldurulmuş 10 santimetre çapında bir tencereye aktarın ve uzun gün ayarları altında bir bitki büyüme odasında inkübe edin.
İlgilenilen Pseudomonas şırıngasının gliserol stoğunu eksi 80 santigrat dereceden uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir LB plakasına çizin. Plakayı 40 ila 48 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Bakteriyel biyokütleyi kazıyın ve beş mililitre 10 milimolar magnezyum klorür içinde yeniden askıya alın.
Optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün ve 10 milimolar magnezyum klorür ekleyerek 0.1'e ayarlayın. Mililitre başına beş kez 10 ila beşinci CFU'luk nihai bir inokülum konsantrasyonu elde etmek için 10 milimolar magnezyum klorürde seri seyreltmeler yapın. Daha sonra, Arabidopsis bitkileri için 200 mililitre inokülum ve fasulye bitkileri için 50 mililitre hazırlayın.
Aşılamadan önce, yüzey aktif madde Silwet L-77'yi fasulye aşılaması için% 0.02 ve Arabidopsis için% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Arabidopsis infiltrasyonu için, tencerenin üzerine bir X oluşturan iki tahta çubuk yerleştirin ve tencereyi 200 mililitre inokülum içeren 14 santimetre çapında bir Petri kabının üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Fasulye yapraklarının aşılanması için, bitkileri ve inokulum çözeltisini bir vakum odasına yerleştirin ve yaprağı, inokulumu içeren 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
Yapraklara sızmak için 30 saniye boyunca 500 milibar nabız verin. Fazla inokülum çözeltisini bir parça kağıtla boşaltın ve planları karşılık gelen büyüme odalarına geri gönderin. Aşılamadan dört gün sonra, Arabidopsis bitkisinin hava kısmını veya aşılanmış yaprağı fasulye bitkisinden kesin ve iğnesiz 20 mililitrelik bir şırıngaya yerleştirin.
Fasulye yaprakları için, yaprağı kendi üzerine yuvarlayın ve abaksiyel yüzü dışa doğru bırakın. Dokuyu örtmek için yeterli miktarda damıtılmış su ekleyin. Daha sonra, şırıngayı dik konumda tutan pistonu yerleştirin ve tüm hava ucun yanına yerleşene kadar namluya hafifçe dokunarak şırınganın içindeki fazla hava ve hava kabarcıklarını çıkarın ve havayı çıkardıktan sonra şırınga namlusunun ucunu parafin filmi ile örtün.
Şimdi doku koyulaşana kadar pozitif basınç oluşturmak için pistona dikkatlice bastırın. Ardından, negatif basınç oluşturmak için pistonu çekin. Parafin filmi ve pistonu çıkarın ve apoplastla ekstrakte edilen bakterileri içeren sıvıyı toplayın.
Tek hücreli bir analiz için, damıtılmış suda% 1.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Eritildikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopi slaytı arasındaki boşluğu doldurmak için yeterli hacim ekleyin ve üstüne başka bir slayt yerleştirin. 15 dakika sürmelerine izin verin ve üstüne yerleştirilen slaytı dikkatlice çıkarın.
Bir bıçak kullanarak, agaroz pedini kullanmadan önce beş milimetre beş milimetre parçaya bölün. Paralel olarak, apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin bir milimetresini santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri konsantre etmek için peleti 20 mikrolitre suya yeniden askıya alın.
Konsantre hücrelerin iki mikrolitrelik bir damlasını 0.17 milimetrelik bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve damlayı bir parça agaroz pedi ile örtün. Belirli lazerler kullanarak yeşil floresan bakterileri tanımlamak için bakteri preparatını konfokal mikroskop altında görselleştirin. Parlak alanı kullanarak tüm bakterileri tanımlayın ve her iki alanı birleştirin.
Akış sitometrisi ile analiz yapmak için, apoplastla ekstrakte edilen bakteri süspansiyonlarının bir alikotunu alın. Akış sitometresini kullanarak analiz edin ve 100.000 olay elde edin. HRPL GFP ekspresyonu GFP floresan ile izlenir.
Nokta grafiği grafikleri, GFP'nin popülasyondaki hücre boyutuna karşı floresan yoğunluğu dağılımını gösterirken, histogramlar GFP'nin hücre sayılarına karşı floresan yoğunluğunu gösterir. Floresan mikroskopi görüntüleri, hrpL OFF ekspresyonu ile ilişkili heterojen GFP seviyelerini göstermektedir.
GFP floresansı düşük olan veya hiç olmayan bakteriler gözlenir. En iyi sonuçlar için, bitki dokusuna zarar vermemek ve böylece bitki hücresel içeriğinden kaynaklanan kontaminasyonu sınırlamak için bakteri ekstraksiyon adımları sırasında nazik olun. Elde edilen bakteri örnekleri, bitki kontaminasyonunu azaltmanın, sonraki bakteriyel genomik veya transkriptomik analiz için nükleik asit ekstraksiyonları gibi bir avantaj olduğu diğer amaçlar için kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bitki apoplastinde Pseudomonas syringae popülasyonlarının tek hücreli gen ekspresyon analizine yönelik bir yöntem sunmaktadır. Prosedür, bakteri popülasyonlarının kurtarılmasını optimize ederken, bitki artıklarından gelen kirliliği en aza indirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Bitki-patojen etkileşimleri
- Bitki sistemlerinde mikrobiyal ekoloji
- Tek hücreli analiz teknikleri
Arka Plan
- Bitkilerde bakteri gen ekspresyonunu incelemenin önemi.
- Bitki dokularında bakteri izole etmenin zorlukları.
- Kirlenme içermeyen ekstraksiyon yöntemlerine duyulan ihtiyaç.
Kullanılan Yöntemler
- Apoplastten şırınga tabanlı bir yöntem kullanılarak bakteri ekstraksiyonu.
- Pseudomonas syringae'nin model organizma olarak kullanılması.
- Tek hücreli gen ekspresyon analizine yönelik akış sitometrisi.
Ana Sonuçlar
- Tek hücreli analiz için uygun bakterilerin başarılı bir şekilde kurtarılması.
- GFP floresansı kullanılarak gen ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi.
- Yöntemin diğer bitki bakteri sistemlerine uygulanabilirliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Bu çalışma, bitkilerde bakteri gen ekspresyonunu incelemek için optimize edilmiş bir yöntemi ortaya koymaktadır.
- Bulgular, bitki-bakteri etkileşimlerinin anlaşılmasına katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Single-cell analysis of Pseudomonas syringae gene expression within plant tissue enables precise interrogation of bacterial phenotypic heterogeneity during host colonization. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for plant-pathogen interaction studies, informing early discovery and translational research pipelines. The method's optimized extraction and analysis workflow enhances predictive confidence in functional genomics and microbial ecology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of bacterial gene expression heterogeneity in planta.
- Supports functional validation of virulence factors and stress response pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing subpopulation behaviors under host-induced stress.
- Improves predictive confidence for target prioritization in plant-microbe interaction studies.
Screening & Assay Development
- Provides validated bacterial preparations suitable for quantitative flow cytometry and microscopy assays.
- Enables reproducible measurement of gene expression at the single-cell level.
- Supports assay standardization by minimizing plant-derived contamination in samples.
- Prepares biological systems for downstream screening of genetic or chemical perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling in situ analysis of bacterial gene expression.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation in plant-microbe systems.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative single-cell data.
- Provides mechanistic insights relevant to disease-relevant plant models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation in plant-microbe research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of bacterial gene expression and pathway activity in host tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative single-cell readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables robust statistical analysis of gene expression distributions and subpopulation dynamics.
- Translational Research: Connects single-cell bacterial phenotypes to plant disease outcomes and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable workflow for diverse plant-bacterial systems with minimal adaptation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in plant-pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes extraction and analysis, improving reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-microbe research assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant handling, bacterial culture, and single-cell analysis techniques.
- Needs access to confocal microscopy and flow cytometry instrumentation for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of extraction and analysis protocols to ensure reproducibility.
- Adaptable to various plant and bacterial systems with empirical optimization of extraction steps.
- Sample integrity depends on gentle handling to minimize plant debris contamination, as supported by the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:54
Plant Preparation
2:14
Inoculation of Arabidopsis and Bean Plants
3:53
Extraction of Bacteria from the Apoplast
4:55
Single-Cell Analysis of the Apoplast-Extracted Bacteria
6:14
Results: Analysis of the Apoplast-Extracted Bacteria Obtained from Arabidopsis or Bean Leaves After Bacterial Inoculation
6:57
Conclusion
