Name: Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Öğrenin, bitki apoplastındaki Pseudomonas syringae popülasyonları için tek hücreli gen ekspresyonu analizi yöntemini. Akış sitometrisi kullanılarak bakteri kurtarma ve kontaminasyonu en aza indirme teknikleri sunulmaktadır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ tarafından finanse edilen RTI2018-095069-B-I00 Projesi Hibesi ve "ERDP: Avrupa'yı Yapmanın Bir Yolu" tarafından desteklenmiştir. J.S.R., Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020) tarafından finanse edildi. N.L.P., Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación'dan Project Grant P18-RT-2398 tarafından finanse edildi.

1. Bitki hazırlama
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek Arabidopsis Col-0 tesislerini hazırlayın.<ol><li>10 cm çapında bir tencereyi, daha önce sulanmış 1:3 vermikülit-bitki substrat karışımı ile doldurun (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız) ve tencereyi 1,6 mm x 1,6 mm deliklere sahip 15 cm x 15 cm metal bir ağ ile örtün. Metal ağı bir lastik bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın (Şekil 1A).</li>
		<li>Islak bir kürdanla, Arabidopsis tohumlarını metal ağın deliklerine ekin. Üç ila dört tohumu saksı içinde uzak konumlara yerleştirin (Şekil 1B, C).</li>
		<li>Yüksek bağıl nemi korumak için saksıları plastik bir kubbe ile örtün ve tabakalaşma için 4 ° C'de 72 saat boyunca inkübe edin. NOT: Tabakalaşma (tarif edildiği gibi yüksek nem ve düşük sıcaklıkta inkübasyon), tohumların çimlenme hızını ve senkronizasyonunu arttırır.</li>
		<li>Saksıları kısa gün koşullarında bir bitki büyüme odasına aktarın (21 °C'de 8 saat ışık/16 saat karanlık, ışık yoğunluğu: 100 μmol·m−2·s−1, bağıl nem: %70).</li>
		<li>Tohum çimlenmesinden sonra (8-10 gün), fidelerin çoğunu çıkarmak için cımbız kullanın, saksının her bir pozisyonunda (altı fide / saksı) bir fide tutun (Şekil 1D). Saksıları ortaya çıkarmak için plastik kubbeyi çıkarın. NOT: Bitkiler çimlenmeden 4-5 hafta sonra kullanıma hazır olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Phaseolus vulgaris fasulyesi (çeşit Kanada Harikası) bitkilerini hazırlayın.<ol><li>Bir Petri kabının altını ıslak bir havlu kağıdı ile örtün ve fasulye tohumlarını üstüne yerleştirin. Petri kabını cerrahi bantla kapatın ve 3-4 gün boyunca 28 ° C'de inkübe edin (Şekil 2A).</li>
		<li>Çimlenmiş tohumları ıslak 1: 3 vermikülit-bitki substrat karışımı ile doldurulmuş 10 cm çapında bir tencereye aktarın.</li>
		<li>Uzun gün ayarlarında bir bitki büyüme odasında kuluçkaya yatın (23 °C'de 16 saat ışık/8 saat karanlık, ışık yoğunluğu: 100 μmol·m−2·s−1, bağıl nem: %70). NOT: Bitkiler çimlenmeden 10 gün sonra kullanıma hazır olacaktır (Şekil 2B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Arabidopsis ve fasulye bitkilerinin aşılanması
NOT: Bu çalışmada P. syringae pv. domates DC3000 ve P. şırınga, pv. phaseolicola 1448A kullanıldı.
<ol><li>P. syringae inoculum'u hazırlayın.<ol><li>İlgilenilen P. syringae suşunu -80 ° C'lik bir gliserol stoğundan, uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir LB plakasına (10 g / L tripton, 5 g / L NaCl, 5 g / L maya ekstresi ve 16 g / L bakteriyolojik agar, Malzeme Tablosuna bakınız) çizin. 40-48 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin. NOT: İlgilenilen suş bir plazmid veya genomik direnç geni taşıyorsa antibiyotik kullanımı önerilir. P. syringae için önerilen antibiyotik konsantrasyonları aşağıdaki gibidir: kanamisin (15 μg / mL), gentamisin (10 μg / mL), ampisilin (300 μg / mL) ( bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Bakteriyel biyokütleyi kazıyın ve 5 mL'de 10 mM MgCl2'de yeniden askıya alın. OD600'ü ölçün ve 10 mM MgCl2 ekleyerek 0,1'e ayarlayın. NOT: Bir P. syringae kültürünün 0,1'lik bir OD 600'ü 5 x10 7 CFU·mL−1'e karşılık gelir.</li>
		<li>5 x 105 CFU·mL−1 nihai inokülum konsantrasyonuna ulaşmak için 10 mM MgCl2'ye seri seyreltmeler gerçekleştirin. Arabidopsis bitkileri için 200 mL ve fasulye bitkileri için 50 mL inokulum hazırlayın.</li>
		<li>Aşılamadan hemen önce, yüzey aktif madde Silwett L-77'yi ( bakınız Malzeme Tablosu) fasulye aşılaması için% 0.02 ve Arabidopsis için% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Silwett'in Arabidopsis dokusuna biraz zararlı olduğunu unutmayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Vakum infiltrasyonu gerçekleştirin.<ol><li>Arabidopsis infiltrasyonu için, tencerenin üzerine bir X oluşturan iki tahta çubuk yerleştirin (Şekil 1E) ve tencereyi 200 mL inokulum içeren 14 cm çapında bir Petri kabının üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 1F).</li>
		<li>Fasulye yapraklarının aşılanması için, yaprağı inokulumu içeren 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne sokun (Şekil 2C).</li>
		<li>İnokulum çözeltisine batırılmış bitkileri bir vakum odasına yerleştirin (Şekil 1G ve Şekil 2D) ve yapraklara sızması için 30 s boyunca 500 mbar'lık bir darbe verin. Yaprak tamamen sızana kadar vakum darbesini 2-3 kez tekrarlayın (Şekil 1H ve Şekil 2E).</li>
		<li>Fazla inokülum çözeltisini bir parça kağıtla boşaltın ve bitkileri karşılık gelen büyüme odalarına geri getirin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Apoplasttan bakteri ekstraksiyonu
<ol><li>Aşılamadan dört gün sonra, Arabidopsis bitkisinin hava kısmını veya fasulye bitkisinden aşılanmış yaprağı kesin ve iğnesiz 20 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin (Şekil 2G). Fasulye yaprakları için, yaprağı kendi üzerine yuvarlayın, Şekil 2F'de gösterildiği gibi abaksiyel yüzü dışa doğru bırakın.</li>
	<li>Dokuyu örtmek için yeterli miktarda damıtılmış su ekleyin (genellikle 10-15 mL).</li>
	<li>Pistonu yerleştirin ve şırınga, ucu yukarı bakacak şekilde dikey konumdayken, tüm hava ucun yanına yerleştirilene kadar namluya hafifçe dokunarak şırınganın içindeki fazla hava ve hava kabarcıklarını çıkarın. Havayı dışarı çıkarmak için pistonu kaydırın. Şırınganın içinde mümkün olduğunca az hava olduğunda, şırınga namlusunun ucunu parafin filmi ile örtün.</li>
	<li>Doku koyulaşana kadar pozitif basınç oluşturmak için pistona dikkatlice bastırın (Şekil 1I ve Şekil 2H). Ardından, negatif basınç oluşturmak için pistonu çekin (Şekil 1J ve Şekil 2I). Bu adımı 3-5 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Parafin filmi ve pistonu çıkarın ve Şekil 2J'de olduğu gibi apoplastla ekstrakte edilen bakterileri içeren sıvıyı toplayın.</li>
</ol>4. Apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin tek hücreli analizi
<ol><li>Aşağıdaki adımları izleyerek konfokal mikroskopi ile görselleştirin.<ol><li>Damıtılmış suda% 1.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Eritildikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopi slaytı arasındaki boşluğu doldurmak için yeterli hacim ekleyin ve üstüne başka bir slayt yerleştirin (Şekil 3). 15 dakika kurumasını bekleyin ve üstüne yerleştirilen slaytı dikkatlice çıkarın. Bir bıçak kullanarak, agaroz pedini kullanımdan hemen önce 5 mm x 5 mm parçalara ayırın.</li>
		<li>Buna paralel olarak, apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin 1 mL'sini oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüjleyin, bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri konsantre etmek için peleti 20 μL suya yeniden askıya alın. Konsantre hücrelerin 2 μL'lik bir damlasını 0,17 mm'lik bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve damlayı, Şekil 3'te gösterildiği gibi, daha önce adım 1'de elde edilen 5 mm x 5 mm'lik agaroz pedi parçası ile örtün.</li>
		<li>Bakteriyel preparatı konfokal mikroskop altında görselleştirin (bakınız Malzeme Tablosu). Yeşil floresan bakterileri tanımlamak için, 488 nm'de uyarma lazerini ve 500 nm ila 550 nm arasında değişen bir emisyon filtresi kullanın. Tüm bakterileri tanımlamak için parlak alanı kullanın ve her iki alanı birleştirin.</li>
		<li>Fiji'yi kullanarak konfokal görüntüleri işleyin (bkz. Bunu yapmak için, bakteri hücresinin konturunu tanımlamak ve içindeki floresan yoğunluğunu ölçmek için MicrobeJ eklentisini kullanın. NOT: Bu analiz için izole edilmiş bakterilerden (kümelenmemiş) görüntü elde edilmesi önerilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometrisi ile analiz yapın.<ol><li>Akış sitometresini kullanarak analiz etmek için apoplastla ekstrakte edilen bakteri süspansiyonlarının bir alikotunu alın. 100.000 etkinlik alın.</li>
		<li>Bakteriler ve bitki kalıntıları arasında ayrım yapmak için, aşılanmamış bir bitkiden ekstrakte edilen apoplastı analiz edin ve ileri saçılma (FSC) hücre boyutunu yan saçılma (SSC) hücre boyutuna karşı gösteren nokta grafiğini apoplastla ekstrakte edilen bakteriyel süspansiyonunkiyle karşılaştırın. Floresan olmayan bakterileri tanımlamak için, floresan olmayan izojenik bakterilerle aşılanmış bitkilerden ekstrakte edilen apoplastları kullanın ve floresan emisyonlarını karşılaştırın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity%3A+A+bacterial+virulence+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic%2C+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li>
<li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors%3A+Beyond+suppression+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li>
<li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li>
<li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039(2002).</li>
<li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li>
<li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+PJ+%22Robust+Statistics%22">Robust Statistics</a>. , Wiley. New York, NY. (1981).</li>
<li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307(2008).</li>
<li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen%2C+ice+nucleus%2C+and+epiphyte%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li>
<li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae%3A+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364(2015).</li>
<li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113(2014).</li>
<li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Burada sunulan yöntem, bakterilerin bitki yaprak dokusuna sızmasına izin veren, doku bozulmasını en aza indirirken büyük hacimlerin hızlı bir şekilde aşılanmasına izin veren invaziv olmayan bir prosedürü açıklamaktadır. P. syringae tür kompleksinin özelliklerinden biri, bitki apoplastının içinde ve bitki yüzeyinde epifit14 olarak hayatta kalma ve çoğalma yeteneğidir. Bu nedenle, mevcut protokol kullanılarak ekstrakte edilen bakterilerin sadece bitki apoplastından gelme olasılığı göz ardı ...

Patojenik bakteriler, çeşitli fenotiplerde farklılıklar göstererek, genetik olarak özdeş popülasyonlarda alt popülasyonların oluşumuna yol açar. Bu fenomen fenotipik heterojenite olarak bilinir ve bakteriyel-konakçı etkileşimleri sırasında bir adaptasyon stratejisi olarak önerilmiştir1. Konfokal mikroskopların, akış sitometrisinin ve mikroakışkanların optik çözünürlüğündeki son gelişmeler, floresan proteinlerle birleştiğinde, bakteri popülasyonlarının tek hücreli analizlerini teşvik etmiştir2.
Gram-negatif Pseudomonas şırıngası, hem akademik hem de ekonomik önemi nedeniyle arketipik bir bitki patojenik bakterisidir3. P. syringae'nin yaşam döngüsüsu döngüsü 4 ile bağlantılıdır. P. syringae, mezofil hücreleri, bitki yaprağı apoplastı arasındaki hücreler arası boşluklara, stoma veya yaralar gibi doğal açıklıklardan girer5. Apoplastın içine girdikten sonra, P. syringae, bitki bağışıklığını baskılamak ve patojen6'nın yararına bitki hücresel fonksiyonlarını manipüle etmek için tip III sekresyon sistemine (T3SS) ve tip III-translokasyonlu efektörlere (T3E) güvenir. T3SS ve T3E'nin ekspresyonu, hedef genlerinpromotör bölgesindeki hrp-box motiflerine bağlanan alternatif bir sigma faktörü olan ana düzenleyici HrpL'ye bağlıdır 7.
İlgili genin aşağı yönündeki floresan protein genlerine kromozom yerleşimli transkripsiyonel füzyonlar üreterek, tek hücreli seviye8'de yayılan floresan seviyelerine dayanarak gen ekspresyonunu izleyebiliriz. Bu yöntem kullanılarak, hrpL ekspresyonunun hem laboratuvarda yetiştirilen bakteri kültürlerinde hem de apoplast 8,9 bitkisinden elde edilen bakteri popülasyonlarında heterojen olduğu tespit edilmiştir. Tek hücreli düzeyde gen ekspresyon analizi tipik olarak laboratuvar ortamında yetiştirilen bakteri kültürlerinde yapılmasına rağmen, bu tür analizler bitki içinde büyüyen bakteri popülasyonları üzerinde de gerçekleştirilebilir, böylece doğal bağlamda alt popülasyonların oluşumu hakkında değerli bilgiler sağlanır. Bitkiden ekstrakte edilen bakteri popülasyonlarının analizi için potansiyel bir sınırlama, apoplasta şırınga basıncı infiltrasyonu ile klasik aşılama yöntemlerinin, ardından yaprak dokusunun maserasyonu ile bakteriyel ekstraksiyonun tipik olarak aşağı akış analizine müdahale eden büyük miktarda hücresel bitki kalıntısı oluşturmasıdır10. Çoğu hücresel enkaz, GFP floresansı ile örtüşen ve yanıltıcı sonuçlara neden olan otofloresan kloroplast parçalarından oluşur.
Mevcut protokol, iki model patosistemde tek hücreli gen ekspresyon heterojenitesini analiz etme sürecini açıklamaktadır: P. syringae pv tarafından oluşturulan. domates suşu DC3000 ve Arabidopsis thaliana (Col-0), diğeri ise P. syringae pv. phaseolicola suşu 1448A ve fasulye bitkileri (Phaseolus vulgaris çeşidi Kanada Harikası). Bir vakum odası ve bir pompa kullanılarak vakum infiltrasyonuna dayanan bir aşılama yöntemi önerilmiştir, bu da tüm yapraklara sızmak için hızlı ve hasarsız bir yöntemle sonuçlanır. Ayrıca, geleneksel protokollerde bir gelişme olarak, bakteri popülasyonunu apoplasttan çıkarmak için, bir şırınga içinde az miktarda hacim kullanarak pozitif ve negatif basınç döngüleri uygulayarak apoplastik sıvının ekstraksiyonuna dayanarak, doku bozulmasını önemli ölçüde azaltan daha yumuşak bir yöntem kullanılır.

<table><tbody><tr><td>0,17 mm lamel</td><td></td><td></td><td>Özel gereksinim yok</td></tr><tr><td>1,6 x 1,6 mm metal örgü</td><td>Buzifu</td><td></td><td>Fiberglas elek örgüsü</td></tr><tr><td>10 cm çapında tencere</td><td></td><td></td><td>Özel gereksinim yok</td></tr><tr><td>140 mm Petri kapları</td><td></td><td></td><td>Özel gereksinim yok</td></tr><tr><td>20 mL şırınga</td><td></td><td></td><td>Özel gereksinim yok</td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Sarstedt</td> Agaroz, <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merk,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin, sodyum</td><td>, GoldBio</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Bakteriyolojik agar</td><td>Roko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Konfokal Mikroskop, Stellaris</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td>,</tr><tr><td>FACSVerse hücre analizörü</td>, <td>BD Biosciences,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji yazılımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin sülfat</td><td>Duchefa</td><td>G-0124</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin monosülfat</td><td>Fitoteknoloji</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastik Ambalaj</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bitki substratı</td><td></td><td></td><td>Özel bir gereklilik yok</td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cromton Europe Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kürdan</td><td></td><td></td><td>Özel gereksinim yok</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td></td><td></td><td>Özel gereksinim yok</td></tr><tr><td>Vakum odası 25 cm çap</td><td>Kartell</td><td>554</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>GAST</td><td>DOA-P504-BN</td><td></td></tr><tr><td>Vermikülit</td><td></td><td></td><td>Özel bir gereklilik yoktur</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bitki dokusu İçindeki pseudomonas syringae genlerinin ekspresyonunun tek hücreli analizi

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Patojenik mikroorganizmaların bolluğu sürekli olarak bitkilere saldırır. Pseudomonas syringae tür kompleksi, çok sayıda konakçı için özel öneme sahip Gram-negatif bitki-patojenik bakterileri kapsar. P. syringae bitkiye yaprak yüzeyinden girer ve apoplast içinde hızla çoğalarak hücreler arası boşluğu işgal eden mikrokoloniler oluşturur. Floresan proteinlerin bakteriler tarafından yapısal ekspresyonu, mikrokolonilerin görselleştirilmesine ve enfeksiyonun gelişiminin mikroskobik düzeyde izlenmesine izin verir. Tek hücreli analizdeki son gelişmeler, klonal izojenik bakteri popülasyonlarının ulaştığı büyük karmaşıklığı ortaya koymuştur. Fenotipik heterojenite olarak adlandırılan bu karmaşıklık, bakteri topluluğu arasındaki gen ekspresyonundaki (genetik farklılıklarla bağlantılı olmayan) hücreden hücreye farklılıkların sonucudur. Tek hücreli düzeyde bireysel lokusların ekspresyonunu analiz etmek için, floresan proteinlere transkripsiyonel füzyonlar yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitki apoplastının kolonizasyonu sırasında meydana gelenler gibi stres koşulları altında, P. syringae , anahtar virülans genlerinin heterojen ekspresyonuna (yani, Hrp tip III sekresyon sistemi) dayanarak farklı alt popülasyonlara ayrılır. Bununla birlikte, bitki dokusundan geri kazanılan herhangi bir P. şırınga popülasyonunun tek hücreli analizi, aşılama ve bakteriyel ekstraksiyon işlemlerine özgü mekanik bozulma sırasında salınan hücresel enkaz nedeniyle zordur. Bu rapor, Arabidopsis ve fasulye bitkilerinin kolonizasyonu sırasında ilgilenilen P. syringae genlerinin ekspresyonunu tek hücre düzeyinde izlemek için geliştirilen bir yöntemi detaylandırmaktadır. Bitkilerin hazırlanması ve bir vakum odası kullanılarak aşılama için kullanılan bakteriyel süspansiyonlar açıklanmaktadır. Endofitik bakterilerin apoplastik sıvı ekstraksiyonu ile enfekte olmuş yapraklardan geri kazanımı da burada açıklanmaktadır. Hem bakteriyel aşılama hem de bakteriyel ekstraksiyon yöntemleri, bitki ve bakteri hücresi hasarını en aza indirmek için ampirik olarak optimize edilmiştir, bu da mikroskopi ve akış sitometri analizi için en uygun bakteriyel preparatlarla sonuçlanır.

Tip III sekresyon sisteminin ekspresyonu, bitki içindeki bakteri büyümesi için gereklidir. T3SS genlerinin zamanında ekspresyonu, merkezinde T3SS ile ilişkili genlerin ekspresyonunun anahtar aktivatörü olan ekstrasitoplazmik fonksiyon (ECF) sigma faktörü HrpL olan karmaşık düzenleme yoluyla elde edilir11. HRPL ekspresyonunun bir analizi daha önce aşağı akış promotersiz gfp genine kromozom yerleşimli bir transkripsiyonel füzyon kullanılarak ve konfokal mikroskopi ve akış sitometri...

Bu protokol, bitki apoplastı içinde yetiştirilen Pseudomonas şırıngası popülasyonları üzerinde tek hücreli gen ekspresyon analizine izin veren bir yöntemi açıklamaktadır.

Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Protokolümüz, yaprak apoplastında yetişen bakteri popülasyonlarının geri kazanılmasını sağlayan nazik bir bitki aşılama ve ekstraksiyon yöntemi sağlar, bu da akış sitometrisi gibi tek hücreli gen ekspresyon analizi için uygundur. Bu yöntem, numuneleri bitki hücresel kalıntıları ile önemli ölçüde kirletmeden apoplasttan önemli miktarda bakterinin ekstraksiyonuna izin verir. Apoplastik bakterilerin geri kazanımı için optimize edilmiş bu yöntem, bitki patojenik bakterileri veya faydalı endositik bakterileri içeren bir dizi bitki bakteri sistemine doğrudan veya küçük değişikliklerle uygulanabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Nieves Lopez-Pagan olacaktır. Başlamak için, 10 santimetre çapında bir tencereyi önceden sulanmış 1:3 vermikülit bitki substratı karışımı ile doldurun. Tencereyi delikli bir metal ağ ile örtün ve metal ağı lastik bir bant kullanarak ıslak toprağa ayarlayın.Daha sonra, Arabidopsis tohumlarını ıslak bir kürdan ile metal ağın deliklerine ekin. Üç ila dört tohumu tencerenin içinde uzak pozisyonlara yerleştirin. Yüksek bağıl nemi korumak için tencereyi plastik bir kubbe ile örtün ve 72 saat boyunca dört santigrat derecede tabakalaşma için inkübe edin.Saksıyı kısa gün koşullarında bir bitki büyüme odasına aktarın. Tencereyi ortaya çıkarmak için plastik kubbeyi çıkarın. Tohumlar çimlendikten sonra, fidelerin çoğunu çıkarmak için cımbız kullanın, saksının her birinde bir fide tutun.Daha sonra bir Petri kabının altını ıslak bir kağıt havluyla kaplayarak ve fasulye tohumlarını üstüne yerleştirerek Phaseolus vulgaris fasulye bitkilerini hazırlayın. Petri kabını cerrahi bantla kapatın ve üç ila dört gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Çimlenmiş tohumları ıslak 1: 3 vermikülit bitki substratı karışımı ile doldurulmuş 10 santimetre çapında bir tencereye aktarın ve uzun gün ayarları altında bir bitki büyüme odasında inkübe edin.İlgilenilen Pseudomonas şırıngasının gliserol stoğunu eksi 80 santigrat dereceden uygun antibiyotiklerle desteklenmiş bir LB plakasına çizin. Plakayı 40 ila 48 saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Bakteriyel biyokütleyi kazıyın ve beş mililitre 10 milimolar magnezyum klorür içinde yeniden askıya alın.Optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün ve 10 milimolar magnezyum klorür ekleyerek 0.1'e ayarlayın. Mililitre başına beş kez 10 ila beşinci CFU'luk nihai bir inokülum konsantrasyonu elde etmek için 10 milimolar magnezyum klorürde seri seyreltmeler yapın. Daha sonra, Arabidopsis bitkileri için 200 mililitre inokülum ve fasulye bitkileri için 50 mililitre hazırlayın.Aşılamadan önce, yüzey aktif madde Silwet L-77'yi fasulye aşılaması için% 0.02 ve Arabidopsis için% 0.01'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Arabidopsis infiltrasyonu için, tencerenin üzerine bir X oluşturan iki tahta çubuk yerleştirin ve tencereyi 200 mililitre inokülum içeren 14 santimetre çapında bir Petri kabının üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Fasulye yapraklarının aşılanması için, bitkileri ve inokulum çözeltisini bir vakum odasına yerleştirin ve yaprağı, inokulumu içeren 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.Yapraklara sızmak için 30 saniye boyunca 500 milibar nabız verin. Fazla inokülum çözeltisini bir parça kağıtla boşaltın ve planları karşılık gelen büyüme odalarına geri gönderin. Aşılamadan dört gün sonra, Arabidopsis bitkisinin hava kısmını veya aşılanmış yaprağı fasulye bitkisinden kesin ve iğnesiz 20 mililitrelik bir şırıngaya yerleştirin.Fasulye yaprakları için, yaprağı kendi üzerine yuvarlayın ve abaksiyel yüzü dışa doğru bırakın. Dokuyu örtmek için yeterli miktarda damıtılmış su ekleyin. Daha sonra, şırıngayı dik konumda tutan pistonu yerleştirin ve tüm hava ucun yanına yerleşene kadar namluya hafifçe dokunarak şırınganın içindeki fazla hava ve hava kabarcıklarını çıkarın ve havayı çıkardıktan sonra şırınga namlusunun ucunu parafin filmi ile örtün.Şimdi doku koyulaşana kadar pozitif basınç oluşturmak için pistona dikkatlice bastırın. Ardından, negatif basınç oluşturmak için pistonu çekin. Parafin filmi ve pistonu çıkarın ve apoplastla ekstrakte edilen bakterileri içeren sıvıyı toplayın.Tek hücreli bir analiz için, damıtılmış suda% 1.5'lik bir agaroz çözeltisi hazırlayın. Eritildikten sonra, yan yana yerleştirilmiş iki mikroskopi slaytı arasındaki boşluğu doldurmak için yeterli hacim ekleyin ve üstüne başka bir slayt yerleştirin. 15 dakika sürmelerine izin verin ve üstüne yerleştirilen slaytı dikkatlice çıkarın.Bir bıçak kullanarak, agaroz pedini kullanmadan önce beş milimetre beş milimetre parçaya bölün. Paralel olarak, apoplastla ekstrakte edilen bakterilerin bir milimetresini santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri konsantre etmek için peleti 20 mikrolitre suya yeniden askıya alın.Konsantre hücrelerin iki mikrolitrelik bir damlasını 0.17 milimetrelik bir kapak kayması üzerine yerleştirin ve damlayı bir parça agaroz pedi ile örtün. Belirli lazerler kullanarak yeşil floresan bakterileri tanımlamak için bakteri preparatını konfokal mikroskop altında görselleştirin. Parlak alanı kullanarak tüm bakterileri tanımlayın ve her iki alanı birleştirin.Akış sitometrisi ile analiz yapmak için, apoplastla ekstrakte edilen bakteri süspansiyonlarının bir alikotunu alın. Akış sitometresini kullanarak analiz edin ve 100.000 olay elde edin. HRPL GFP ekspresyonu GFP floresan ile izlenir.Nokta grafiği grafikleri, GFP'nin popülasyondaki hücre boyutuna karşı floresan yoğunluğu dağılımını gösterirken, histogramlar GFP'nin hücre sayılarına karşı floresan yoğunluğunu gösterir. Floresan mikroskopi görüntüleri, hrpL OFF ekspresyonu ile ilişkili heterojen GFP seviyelerini göstermektedir.GFP floresansı düşük olan veya hiç olmayan bakteriler gözlenir. En iyi sonuçlar için, bitki dokusuna zarar vermemek ve böylece bitki hücresel içeriğinden kaynaklanan kontaminasyonu sınırlamak için bakteri ekstraksiyon adımları sırasında nazik olun. Elde edilen bakteri örnekleri, bitki kontaminasyonunu azaltmanın, sonraki bakteriyel genomik veya transkriptomik analiz için nükleik asit ekstraksiyonları gibi bir avantaj olduğu diğer amaçlar için kullanılabilir.

single-cell-analysis-expression-pseudomonas-syringae-genes-within

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Kantitatif gerçek zamanlı PCR (QRT PCR) mRNA düzeyleri farklı böcek doku ve gelişim evreleri teşhis etmek için etkili bir araçtır. Bu yazıda farklı larva dokularında tespit mRNA düzeyleri ve istilacı böcek türlerinin, zümrüt kül delici gelişim evreleri QRT-PCR kullanımı göstermektedir.

Emerald Kül Freze Gen İfade Analizi ( Agrilus planipennis) Kullanarak Kantitatif Real Time PCR

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

Kaynak: Lee, H. ve diğerleri, Enfeksiyon Sırasında Bakterilerden Verilen Efektörleri Görselleştirmek için Bölünmüş Yeşil Floresan Protein Sistemi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, konfokal mikroskopi ile birlikte bölünmüş süper klasör yeşil floresan proteini (sfGFP) tamamlama kullanılarak bitki hücrelerinde bakteriyel enfeksiyonu ve efektör protein dağıtımını izlemek için bir yöntem göstermektedir. Yaklaşım, efektör translokasyonunun konakçı hücre sitozolüne hassas bir şekilde görselleştirilmesini...

Bitki Hücrelerinde Bakteriyel Enfeksiyon ve Efektör Protein Dağıtımının İzlenmesi

Kaynak: Rufián, J. S. ve diğerleri, Bitki dokusunda Pseudomonas şıringae genlerinin İfadesinin Tek Hücreli Analizi. J. Vis. Exp. (2022)Bu video, bitki hücreleri arasındaki hücrelerarası boşluk olan apoplast içinde çoğalan ve mikrokoloniler oluşturan apoplastik bakterilerin çıkarılması için şırınga tabanlı bir basınç yöntemini gösteriyor. Bu yöntem, aşağı akış tek hücre analizi için uygun olan kalıntısız bakteriyel örnekler elde eder.

Apoplastik bakterilerin şırınga bazlı basınç yöntemiyle ekstraksiyonu

Kaynak: Rufián, J. S. ve diğerleri. Bitki dokusunda Pseudomonas Syringae genlerinin tek hücreli analizi. J. Vis. Exp. (2022).Bu video, floresan etiketlenmiş transkripsiyon faktörü kullanılarak bitkiden ekstra edilmiş patojenik bakterilerde gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Konfokal görüntüleme, virülans gen ifadesinde heterojenliği ortaya koyarak klonal bakteri popülasyonundaki fonksiyonel çeşitliliği ortaya koyuyor.

Bitki Ekstraksiyonu Patojenlerinden Gen İfadesinin Tek Hücreli Analizi

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Patojen büyümesinin niceliksel olarak belirlenmesi, çeşitli Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis olarak anılacaktır) bağışıklık tepkilerini karakterize etmek için güçlü bir araçtır. Burada açıklanan yöntem, Pseudomonas syringae pv'yi ölçmek için optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi sunar. maculicola ES4326 yetişkin Arabidopsis yapraklarında büyüme.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Burada sunulan Protokolü amacı endosphere izole Bacillus mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Bu yöntem önemli bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tanımlamasını kolaylaştırır ve prensip olarak diğer endophytes ve bitkilerle küçük ayarlamalar için geçerli olduğunu.

Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

Öğrenin, bitki apoplastındaki Pseudomonas syringae popülasyonları için tek hücreli gen ekspresyonu analizi yöntemini. Akış sitometrisi kullanılarak bakteri kurtarma ve kontaminasyonu en aza indirme teknikleri sunulmaktadır.

Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

Daha fazla video keşfet