Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi
December 9th, 2022
Multipl sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için, fareler bir otoantijen ve Freund'un adjuvanını tamamlayan bir yağda su emülsiyonu ile bağışıklanır. Bu emülsiyonların hazırlanması için çeşitli protokoller mevcut olsa da, emülsiyon hazırlığı için hızlı, basit ve standartlaştırılmış bir homojenizasyon protokolü burada sunulmaktadır.
Deneysel otoimmün ensefalomiyelit veya EAE, multipl skleroz hastası için yeni ve geliştirilmiş tedaviler geliştirmek için kullanılan bir hayvan modelidir. EAE'de hastalığı indüklemek, tutarlı sonuçlar elde etmek için mükemmel bir yağ ve su emülsiyonu gerektirir. Burada sunulan emülsiyon hazırlama yöntemi insan etkisinden arındırılmıştır, böylece tutarsızlıkları bir deneyden diğerine sınırlar.
Yöntem EAE için optimize edilmiş olsa da, diğer otoimmün hastalık modelleri için ve ayrıca kanser aşılarını test etmek için de kullanılabilir. CFA bulamacını 100 miligram dondurularak kurutulmuş M tüberküloz H37 RA ve yedi mililitrelik bir tüpe beş, 3.2 milimetre çelik boncukta hazırlamak. Boruyu homojenizatörde en yüksek hız ayarında 60 saniye çalkalayın.
Tüpe beş mililitre IFA adjuvan ekleyin ve en yüksek hızda 60 saniye boyunca tekrar çalkalayın. Daha sonra bulamacı, boncukları geride bırakan bir pipetle taze bir tüpe aktarın ve kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın. Bir CFA / Peptit emülsiyonu hazırlamak için, her bir reaktif için gereken miktarı hesaplamak üzere ek bir dosyayı indirin.
Daha sonra vidalı kapaklı tüpü ve buz üzerinde kullanılacak reaktifleri yerleştirin. Ardından, emülsiyon bileşenlerini ekleyin. Önce PBS, sonra peptid, CFA bulamacı.
Ve son olarak, IFA. Tüpü birkaç kez sıkarak ve gevşeterek kapakla sıkıca kapatın. Reaktifleri önceden karıştırmak için tüpü elle 5 ila 10 saniye boyunca kuvvetlice sallayın.
Tüpü sallanan homojenizatöre yerleştirin ve çubukla sabitleyin. Hızı en yüksek ayara ve süreyi 60 saniyeye ayarlayın. Koşu bittiğinde, tüpü üç dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve aynı ayarlarla koşuyu bir veya iki kez daha tekrarlayın.
Sıkışmış havayı çıkarmak ve emülsiyonu sıkıştırmak için tüpü bir dakikadan itibaren 300 G'de santrifüj yapın. Kapağı tüpten çıkarın. Pistonu tüpe yerleştirin ve emülsiyonun tepesine ulaşana kadar yavaşça aşağı doğru itin.
Borunun altındaki çıtçıtlı muhafazayı bükerek çıkarın. Ardından, pistonu tüm enjeksiyon şırıngalarından çıkarın ve enjeksiyon şırıngalarına bir iğne ekleyin. Ardından, enjeksiyon şırıngasının arkasını tüpün altındaki özel kilide takın ve kısa bir bükümle kilitleyin.
Emülsiyonu, pistonu yavaşça iterek tüpten enjeksiyon şırıngasına aktarın. Emülsiyon, enjeksiyon şırıngasının 0.15 mililitre mezuniyetine ulaştığında durun. Enjeksiyon şırıngasını tüpten ayırın ve bu şırıngaya hava girmemesine dikkat ederek pistonu dikkatlice yerleştirin.
Emülsiyon iğneden çıkana kadar pistonu itin ve işlemi tüpte bulunan emülsiyonun geri kalanı için tekrarlayın. Su ve yağ parçacıklarının boyutunu analiz etmek için mikroskop slaytına emülsiyonun küçük bir damlasını ekleyin, bir kapak kayması ile sürün ve ardından emülsiyonu düzleştirmek için dairesel bir hareketle sert bir şekilde itin. Bulaşmış emülsiyonu bir faz kontrast mikroskobu altında 400 kat büyütme ile inceleyin ve emülsiyonun tek katmanlı olduğu bir alana odaklanın.
Küçük, tekdüze, gri veya beyaz parçacıkların görünür olduğundan emin olun. Homojenizasyon yöntemiyle üretilen emülsiyonlar, küçük su damlacıklarını ve yağ emülsiyonlarını temsil eden gri veya beyaz fasulye şeklindeki parçacıkları sergiledi. Buna karşılık, şırınga yöntemi kullanılarak üretilen emülsiyon damlacıkları daha büyük ve daha genişti.
Vorteks yönteminde, emülsiyonda sıkışmış hava kabarcıklarına karşılık gelen büyük gri veya siyah parçacıklar gözlenmiştir. Su ve yağ emülsiyonları için bir lazer kırma partikül boyutu analizörü kullanılarak ölçülen zaman içindeki partikül boyutu dağılımındaki değişiklikler, altı haftalık bir süre boyunca partikül boyutunda herhangi bir değişiklik göstermedi. Taze 3 haftalık ve 15 haftalık emülsiyonların tümü, deney boyunca test edilen tüm hayvanlarda benzer EAE hastalıklarına neden oldu.
Fareler, burada sunulan homojenizasyon yönteminin, EAE'yi tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde indükleyen emülsiyonlar ürettiğini ortaya koyan tüm deneylerde benzer bir hastalık paterni geliştirdi. Bir deney için emülsiyon yapmadan önce, israfı en aza indirmek için gereken her bileşenin miktarını hesaplamak için bir numaralı ek dosyayı indirin. Burada sunulan yöntem, sadece klinik öncesi araştırmalar için değil, gelecekte klinikte kanser aşıları hazırlamak için emülsiyon preparatını standartlaştırmak için de kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl sklerozun bir hayvan modeli, oluşturmak için su-yağ emülsiyonu hazırlamak için standart bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, emülsiyon hazırlama sırasında insan etkisini en aza indirerek sonuçlardaki değişkenliği azaltmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Immunoloji
- Otoimmün hastalık araştırması
Arka Plan
- Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl skleroz çalışmak için kullanılır.
- Tutarlı emülsiyon hazırlama, güvenilir deneysel sonuçlar için çok önemlidir.
- Mevcut yöntemler önemli ölçüde değişebilir ve tekrarlanabilirliği etkileyebilir.
- Bu çalışma, hızlı ve basit bir homojenizasyon protokolü sunar.
Çalışmanın Amacı
- Emülsiyon hazırlama için standart bir yöntem sunmak.
- EAE indüksiyonundaki değişkenliği azaltmak.
- Diğer otoimmün modeller ve kanser aşı testlerine uygulanabilen bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Dondurularak kurutulmuş M tuberculosis H37 RA kullanarak bir CFA süspansiyonu hazırlanması.
- Emülsiyon hazırlama için çelik boncuklar ve homojenizatör kullanımı.
- Tutarlılık için çalkalama süresi ve hızının optimize edilmesi.
- Yöntemin EAE ve diğer modellerde uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, EAE indüksiyonuna uygun kararlı bir emülsiyon üretti.
- İnsan etkisinin azaltılması, daha tutarlı deneysel sonuçlara yol açtı.
- Diğer otoimmün hastalık modellerine uygulanabilirliği gösterildi.
- Kanser aşılarının testinde potansiyel kullanım belirlendi.
Sonuçlar
- Standartlaştırılmış emülsiyon hazırlama yöntemi, EAE çalışmalarında tekrarlanabilirliği artırır.
- Bu yaklaşım çeşitli araştırma uygulamaları için uyarlanabilir.
- Gelecek çalışmalar, deneysel sonuçları iyileştirmek için bu protokolden faydalanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Standardized antigen/adjuvant emulsion preparation is critical for reproducible induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a key preclinical model for multiple sclerosis drug discovery. This homogenization-based method minimizes operator variability, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable emulsion quality directly impacts predictive confidence and portfolio triage for autoimmune and immunotherapy programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables consistent EAE induction for functional target validation in neuroimmunology.
- Reduces mechanistic ambiguity by standardizing antigen delivery and immune activation.
- Supports predictive confidence in disease-relevant preclinical models.
- Facilitates portfolio triage by ensuring reproducible biological outcomes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated emulsions for downstream immunization workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization across studies.
- Enables quantitative assessment of emulsion particle size and stability.
- Supports scalable and transferable protocols for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EAE model induction with disease-relevant translational endpoints.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by minimizing batch-to-batch variability.
- De-risks advancement decisions by providing robust, reproducible disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This homogenization method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification.
- Discovery Biology: Standardizes antigen/adjuvant delivery for hypothesis-driven immune activation studies.
- Screening: Provides reproducible emulsions for reliable compound or biologic evaluation in EAE models.
- Analytics: Enables quantitative particle size analysis and stability monitoring for quality control.
- Translational Research: Maintains disease model fidelity for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, operator-independent protocol adaptable to other autoimmune and immunotherapy models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in autoimmune model studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable emulsion preparation across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology and neuroinflammation assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in homogenizer operation and emulsion quality assessment.
- Needs access to shaking homogenizers, phase contrast microscopy, and particle size analyzers for QC.
- Demands cross-team standardization of reagent calculations and handling protocols.
- Adaptable to various antigens and adjuvants for different autoimmune or immunotherapy models.
- Practical limitations include initial equipment investment and protocol adherence for reproducibility.
