Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit veya EAE, multipl skleroz hastası için yeni ve geliştirilmiş tedaviler geliştirmek için kullanılan bir hayvan modelidir. EAE'de hastalığı indüklemek, tutarlı sonuçlar elde etmek için mükemmel bir yağ ve su emülsiyonu gerektirir. Burada sunulan emülsiyon hazırlama yöntemi insan etkisinden arındırılmıştır, böylece tutarsızlıkları bir deneyden diğerine sınırlar.

Yöntem EAE için optimize edilmiş olsa da, diğer otoimmün hastalık modelleri için ve ayrıca kanser aşılarını test etmek için de kullanılabilir. CFA bulamacını 100 miligram dondurularak kurutulmuş M tüberküloz H37 RA ve yedi mililitrelik bir tüpe beş, 3.2 milimetre çelik boncukta hazırlamak. Boruyu homojenizatörde en yüksek hız ayarında 60 saniye çalkalayın.

Tüpe beş mililitre IFA adjuvan ekleyin ve en yüksek hızda 60 saniye boyunca tekrar çalkalayın. Daha sonra bulamacı, boncukları geride bırakan bir pipetle taze bir tüpe aktarın ve kullanana kadar dört santigrat derecede saklayın. Bir CFA / Peptit emülsiyonu hazırlamak için, her bir reaktif için gereken miktarı hesaplamak üzere ek bir dosyayı indirin.

Daha sonra vidalı kapaklı tüpü ve buz üzerinde kullanılacak reaktifleri yerleştirin. Ardından, emülsiyon bileşenlerini ekleyin. Önce PBS, sonra peptid, CFA bulamacı.

Ve son olarak, IFA. Tüpü birkaç kez sıkarak ve gevşeterek kapakla sıkıca kapatın. Reaktifleri önceden karıştırmak için tüpü elle 5 ila 10 saniye boyunca kuvvetlice sallayın.

Tüpü sallanan homojenizatöre yerleştirin ve çubukla sabitleyin. Hızı en yüksek ayara ve süreyi 60 saniyeye ayarlayın. Koşu bittiğinde, tüpü üç dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve aynı ayarlarla koşuyu bir veya iki kez daha tekrarlayın.

Sıkışmış havayı çıkarmak ve emülsiyonu sıkıştırmak için tüpü bir dakikadan itibaren 300 G'de santrifüj yapın. Kapağı tüpten çıkarın. Pistonu tüpe yerleştirin ve emülsiyonun tepesine ulaşana kadar yavaşça aşağı doğru itin.

Borunun altındaki çıtçıtlı muhafazayı bükerek çıkarın. Ardından, pistonu tüm enjeksiyon şırıngalarından çıkarın ve enjeksiyon şırıngalarına bir iğne ekleyin. Ardından, enjeksiyon şırıngasının arkasını tüpün altındaki özel kilide takın ve kısa bir bükümle kilitleyin.

Emülsiyonu, pistonu yavaşça iterek tüpten enjeksiyon şırıngasına aktarın. Emülsiyon, enjeksiyon şırıngasının 0.15 mililitre mezuniyetine ulaştığında durun. Enjeksiyon şırıngasını tüpten ayırın ve bu şırıngaya hava girmemesine dikkat ederek pistonu dikkatlice yerleştirin.

Emülsiyon iğneden çıkana kadar pistonu itin ve işlemi tüpte bulunan emülsiyonun geri kalanı için tekrarlayın. Su ve yağ parçacıklarının boyutunu analiz etmek için mikroskop slaytına emülsiyonun küçük bir damlasını ekleyin, bir kapak kayması ile sürün ve ardından emülsiyonu düzleştirmek için dairesel bir hareketle sert bir şekilde itin. Bulaşmış emülsiyonu bir faz kontrast mikroskobu altında 400 kat büyütme ile inceleyin ve emülsiyonun tek katmanlı olduğu bir alana odaklanın.

Küçük, tekdüze, gri veya beyaz parçacıkların görünür olduğundan emin olun. Homojenizasyon yöntemiyle üretilen emülsiyonlar, küçük su damlacıklarını ve yağ emülsiyonlarını temsil eden gri veya beyaz fasulye şeklindeki parçacıkları sergiledi. Buna karşılık, şırınga yöntemi kullanılarak üretilen emülsiyon damlacıkları daha büyük ve daha genişti.

Vorteks yönteminde, emülsiyonda sıkışmış hava kabarcıklarına karşılık gelen büyük gri veya siyah parçacıklar gözlenmiştir. Su ve yağ emülsiyonları için bir lazer kırma partikül boyutu analizörü kullanılarak ölçülen zaman içindeki partikül boyutu dağılımındaki değişiklikler, altı haftalık bir süre boyunca partikül boyutunda herhangi bir değişiklik göstermedi. Taze 3 haftalık ve 15 haftalık emülsiyonların tümü, deney boyunca test edilen tüm hayvanlarda benzer EAE hastalıklarına neden oldu.

Fareler, burada sunulan homojenizasyon yönteminin, EAE'yi tutarlı ve tekrarlanabilir bir şekilde indükleyen emülsiyonlar ürettiğini ortaya koyan tüm deneylerde benzer bir hastalık paterni geliştirdi. Bir deney için emülsiyon yapmadan önce, israfı en aza indirmek için gereken her bileşenin miktarını hesaplamak için bir numaralı ek dosyayı indirin. Burada sunulan yöntem, sadece klinik öncesi araştırmalar için değil, gelecekte klinikte kanser aşıları hazırlamak için emülsiyon preparatını standartlaştırmak için de kullanılabilir.