Name: Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Öğrenin, modifiye sandviç ELISA ile nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarını hassas şekilde ölçme yöntemini. Miyeloperoksidaz-DNA ve nötrofil elastaz-DNA komplekslerini klinik örneklerde hızlıca nicelendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, makalenin gözden geçirilmesinde yardımcı olduğu için Dr. Huq Muhammad Aminul'a teşekkür eder.

Bu çalışma Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütülmüş ve Aichi Tıp Üniversitesi kurumsal inceleme kurulları tarafından onaylanmıştır (2017-H341, 2019-H137). Her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Reaktif hazırlama
NOT: Sandviç ELISA testini gerçekleştirmek için reaktifler aşağıda açıklandığı gibi hazırlanır.
<ol><li>Kaplama tamponu:<ol><li>0,1 mol/L karbonat-bikarbonat tamponu yapmak için 10,6 g susuz sodyum karbonat (moleküler ağırlık, 106 g/mol) ve 8,4 g sodyum bikarbonat (moleküler ağırlık, 84 g/mol) tartın.</li>
		<li>Bir beherde yaklaşık 900 mL damıtılmış suya ekleyin.</li>
		<li>Gerekli miktarda seyreltilmiş hidroklorik asit veya sodyum hidroksit ekleyerek tamponun pH'ını 9.6'ya ayarlayın.</li>
		<li>pH'ı bir pH metre ile kontrol edin.</li>
		<li>Ardından, toplam 1.000 mL hacim elde etmek için gerekli hacimde damıtılmış su ekleyin.</li>
		<li>Bu 0.1 mol/L karbonat-bikarbonat tamponunu buzdolabında 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Engelleme tamponu:<ol><li>137 mmol/L NaCl, 8.1 mmol/LNa2HPO4, 2.68 mmol/L KCl ve 1.47 mol/L KH2PO 4 (pH 7.4) ve 1.47 mol/L KH'den oluşan 70 mL fosfat tamponlu saline (PBS) yaklaşık 250 μL %20 sodyum azid ve 1 g sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Toplam 100 mL hacim elde etmek için damıtılmış su ekleyin. Sığır serum albümini ve sodyum azidin nihai konsantrasyonları sırasıyla% 1 ve% 0.05'tir. 10 dakika bekleyin, ardından çözelti kullanıma hazırdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Yıkama çözeltisi: Damıtılmış suda% 0.5 t-oktilfenoksipolietoksietanol, polietilen glikol tert-oktilfenil eter (Triton X-100) hazırlayın.<ol><li>% 100 Triton X-100'ü% 10'a damıtılmış suyla seyreltin ve% 10'luk çözeltiyi kullanmadan önce 1 gün bekletin.</li>
		<li>Ardından, %0,5'lik bir konsantrasyon elde etmek için %10'luk Triton X-100 çözeltisini 20 kat damıtılmış suyla yeniden seyreltin.</li>
	</ol></li>
	<li>Antikor dilüsyon:<ol><li>Yakalama antikorunu (anti-MPO antikoru [1 mg / mL] veya anti-NE antikoru [1 mg / mL]) testin 1. gününde kullanmadan önce kaplama tamponunda (pH 9.6) 1: 2.000'e seyreltin (aşağıya bakınız) ve tespit antikoru (peroksidaz-konjuge anti-DNA antikoru) testin 3. gününde kullanmadan önce PBS ile 1:40'a kadar (aşağıya bakınız). NOT: Ön deney için, izo-tipi antikorları (IgG tavşanı [5 mg / mL] ve IgG1 fare klonu Ci4 [0.5 mg / mL]) kaplama tamponunda 1: 10.000 ve 1: 1.000'e seyreltin (pH 9.6).</li>
	</ol></li>
	<li>ABTS substrat çözeltisi: Numune sayısına bağlı olarak, bir, iki veya üç 2,2'-azino-bis(3 etilbenzotiazolin-6-sülfonik asit (ABTS) tabletini 5 mL, 10 mL veya 15 mL ABTS tamponunda çözün (sodyum perborat, sitrik asit ve disodyum hidrojen fosfat içerir); numune başına 100 μL gereklidir. Hazırlanan çözeltiyi ışıktan koruyarak 2-8 ° C'de saklayın. Çözelti 3 aya kadar stabildir.</li>
</ol>2. Numune toplama ve saklama
<ol><li>Plazma izolasyonu:<ol><li>22 G'lik bir şırınga ile damar delinerek bir lityum heparin kan alma tüpüne 4 mL periferik kan örneği toplayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı 2 mL'lik güvenli kilitli bir numune tüpüne aktarın.</li>
		<li>Kalıntı hücreleri çıkarmak için süpernatanı 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yeniden santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı, tüpün altındaki peleti bozmadan yeni bir güvenli kilitli numune tüpüne toplayın.</li>
		<li>Elde edilen plazmayı daha fazla kullanana kadar −80 °C'de saklayın. NOT: Bu tahlil ile yüksek verimli sonuçlar elde etmek için kaliteli numuneler gereklidir. Plazma örnekleri kullanılıyorsa, kalan hücreleri çıkarmak için ikinci bir santrifüjleme gerçekleştirin. Numunelerin tekrar tekrar çözülmesinden kaçının. Antikoagülan olarak heparin kullanın, çünkü EDTA DNaz aktivitesini etkiler.</li>
	</ol></li>
	<li>Polimorfonükleer nötrofillerin izolasyonu<ol><li>Periferik kan örneklerini 22 G'lik bir şırınga ile damar delinerek bir lityum heparin kan alma tüpüne toplayın.</li>
		<li>6 mL kanı 6 mL tek adımlı polimorflar üzerine katmanlayın ve tüpleri oda sıcaklığında (RT) 45 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Nötrofiller içeren üçüncü buffy coat tabakasını hasat edin ve RT'de 10 dakika boyunca fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta 400 x g'da üç kez yıkayın.</li>
		<li>Nötrofilleri, %6 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile desteklenmiş 2 mM L-glutamin içeren fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta yeniden süspanse edin ve mikroskop alanındaki hücreleri bir hemositometre ile sayın. NOT: Bu yöntem, tripan mavisi boya hariç tutma ile değerlendirildiği gibi, %95'ten fazla canlılık ile %96 ila %98 saflık sağlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Polimorfonükleer nötrofillerin ve NETosis'in in vitro aktivasyonu
	<ol><li>Taze izole edilmiş polimorfonükleer nötrofilleri, %6 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 2 mM L-glutamin içeren fenol kırmızısı içermeyen RPMI-1640'ta 1 ×10 5 hücre/mL'ye seyreltin ve 35 mm'lik kültür kaplarında tohumlayın.</li>
		<li>NET'leri indüklemek için, polimorfonükleer nötrofilleri 25 nM PMA ile 37 ° C'de 4 saat boyunca% 5 CO2/95% havada uyarın.</li>
		<li>4 saatlik inkübasyondan sonra, RT'de 15 dakika boyunca doğrudan kültür kaplarına 0.6 μg/mL DNaz I ekleyerek NET'leri kısmen sindirin ve 5 mM EDTA ekleyerek DNaz I aktivitesini durdurun.</li>
		<li>Sentezlenen NET'leri içeren ortamı toplayın ve hücre kalıntılarını gidermek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanları dört sağlıklı kontrolden alın, karıştırın ve kullanana kadar −80 °C'de saklayın. NOT: Dört sağlıklı kontrolden elde edilen DNaz sindirilmiş PMA ile uyarılmış nötrofiller, NET standardı 1,14,15 olarak kullanılır. PBS ile seri olarak seyreltilmiş bir NET standardından bir kalibrasyon eğrisi oluşturun ve seyreltilmemiş bir NET standardından elde edilen optik yoğunluk (OD) değerlerini %100 NET olarak atayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tahlil yöntemi
NOT: Testi gerçekleştirme adımları aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
<ol><li>1. Gün<ol><li>Boş kuyucuk da dahil olmak üzere plakanın her bir oyuğuna toplam 100 μL seyreltilmiş anti-MPO veya 0.05 μg antikor içeren anti-NE antikoru uygulayın. NOT: Kaplama tamponu herhangi bir deterjan içermemelidir, aksi takdirde antikorlar her bir oyuğun duvarlarına eşit ve düzgün bir şekilde bağlanmayabilir. Kanca etkisini önlemek için, kaplama proteini konsantrasyonu 20 μg/mL'den fazla olmamalıdır, çünkü bu seviyenin üzerindeki konsantrasyonlar mikrotitre plakasındaki mevcut bölgelerin çoğunu doyuracaktır. Protein kaplama çözeltilerinin tipik konsantrasyon aralığı 2-10 μg/mL'dir. Ön deney için, MPO'ya karşı spesifik monoklonal antikorlar yerine kaplama için seyreltilmiş izo-tip kontrol antikoru IgG tavşanı kullanın. NE'ye karşı spesifik monoklonal antikorlar yerine kaplama için seyreltilmiş izo tipi kontrol antikoru IgG1 faresi kullanın.</li>
		<li>Numunenin buharlaşmasını önlemek için plakayı yapışkan plastik bir kapakla örtün ve yakalama antikorlarının bağlanmasına izin vermek için gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>Seyreltilmiş antikor çözeltisini kuyucuklardan atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama çözeltisi pipetleyin ve bu yıkama prosedürünü üç ila dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>Plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurulayarak fazla PBS'yi çıkarın.</li>
		<li>ELISA plakasının her bir kuyusunu 200 μL bloke edici tampon ile bloke edin.</li>
		<li>Plakayı yapışkan plastik bir kapakla sıkıca örtün ve kuyucukları tıkamak için RT'de 1.5-2 saat inkübe edin.</li>
		<li>Engelleme solüsyonunu kuyucuklardan tamamen atın ve ardından kuyucuk başına 300 μL yıkama solüsyonu pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>Plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurulayarak fazla PBS'yi çıkarın.</li>
		<li>Boş kuyu hariç her bir oyuğa toplam 25 μL plazma veya ortam uygulayın ve son hacmi 100 μL yapmak için seyreltici olarak 75 μL PBS ekleyin; boş kuyuya 100 μL PBS ekleyin.</li>
		<li>Ardından, plakayı 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek numuneleri RT'de 10 saniye karıştırın.</li>
		<li>Boş kuyucuk da dahil olmak üzere her bir oyuğa 2 μL 100 kat seyreltilmiş DNaz I (0.03 mg/mL) uygulayın (reaksiyon karışımındaki DNaz I'in nihai konsantrasyonu: 0.6 μg/mL).</li>
		<li>Plakayı yapışkan plastik bir kapakla kapatın ve plakayı 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek numuneleri RT'de 10 saniye boyunca iyice karıştırın. NOT: DNA sindirimi için optimum koşulları değerlendirmek için, testi geliştirirken, COVID-19'lu hastalardan MPO ile ilişkili DNA içeren numuneleri RT'de 0-0.9 μg/mL DNaz I ile 15 dakika inkübe ettik ve MPO için spesifik yakalama antikoru veya türle uyumlu bir izo tipi kontrol antikoru ile kaplanmış plakalar kullandık.</li>
		<li>Numuneleri RT'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Yapışkan plastik kapağı çıkarın ve DNaz reaksiyonunu durdurmak için her bir oyuğa 1 μL 0,5 M EDTA uygulayın.</li>
		<li>Plakayı yapışkan plastik bir kapakla tekrar kapatın ve 250 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirerek RT'de 15 saniye çalkalayın.</li>
		<li>Daha sonra, NET'lerin protein bileşenlerinin yakalama antikorlarına bağlanmasına izin vermek için plakayı gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün<ol><li>Yapışkan plastik kapağı çıkarın ve çözeltiyi kuyulardan atın.</li>
		<li>Çözeltiyi kuyucuklardan tamamen atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama solüsyonu pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>Her bir oyuğa toplam 100 μL seyreltilmiş peroksidaz konjuge anti-DNA tespit antikoru uygulayın.</li>
		<li>Plakayı yapışkan plastik bir kapakla sıkıca kapatın ve RT'de 1,5 saat inkübe edin.</li>
		<li>Çözeltiyi kuyulardan tamamen atın ve ardından oyuk başına 300 μL yıkama çözeltisi pipetleyin ve bu yıkama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın.</li>
		<li>Kalan çözeltiyi dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Her bir oyuğa toplam 100 μL ABTS substrat çözeltisi uygulayın ve plakayı yapışkan plastik bir örtü ile örtün.</li>
		<li>Plakayı karanlıkta RT'de 250 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde 20-30 dakika inkübe edin. NOT: İstenen OD okumaları elde edilene kadar plakayı 5 dakikalık aralıklarla izleyin.</li>
		<li>Reaksiyonu durdurmak için toplam 50 μL 2 M sülfürik asit ekleyin.</li>
		<li>Kuyucukların sıvı içeriğini, plakanın kenarına dikkatlice vurarak karıştırın.</li>
		<li>Mikroplaka okuyucuyu açın ve bilgisayara bağlayın.</li>
		<li>Bilgisayardaki yazılım uygulamasını açın.</li>
		<li>Durum çubuğundan yeni bir deneme oluşturun ve adlandırın.</li>
		<li>Plaka okuması için aşağıdaki tüm parametreleri ayarlayın: Okuma tipi, Absorbans; Okuma modu, Uç nokta; Dalga boyları, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Otomatik karıştırma ve Boşaltma öncesi, Kapalı; Ön okuma plakası, Kapalı; Otomatik kalibrasyon, Açık; Şeritler, Tüm plakayı okuyun; Kolon dalga boyu önceliği, Kolon önceliği; Taşıma hızı, Normal; ve Otomatik okuma, Kapalı.</li>
		<li>Ardından, numuneleri içeren 96 oyuklu plakayı çekmeceye koyun ve kapatın.</li>
		<li>Son olarak, plakanın hemen okunması için Oku düğmesini seçin.</li>
		<li>Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir oyuğun absorbansını 405 nm dalga boyunda okuyun (bu aşamada referans olarak 490 nm dalga boyu kullanın).</li>
		<li>Bilinmeyen tüm numunelerden tek başına tahlil ortamının absorbans değerinin otomatik olarak çıkarılmasını sağlayın ve verileri kaydedin. NOT:Örnek 1,14,15'teki NET'in nispi konsantrasyonunu hesaplamak için seri olarak seyreltilmiş NET standardından elde edilen standart bir eğri kullanın. Burada, nihai sonuçlar "MPO- veya NE-DNA kompleksleri (NET standardının %'si)" olarak sunulur. Algılama limiti (LOD), standart sapmadan (SD) ve kalibrasyon eğrisinin eğiminden (S) aşağıdaki gibi hesaplandı: LOD = 3.3(SD/S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. İstatistik
<ol><li>Uygun istatistiksel analiz yazılımını kullanarak tüm istatistiksel analizleri gerçekleştirin. Burada SigmaPlot v14.5 kullanıldı. Yüzdeler ve sürekli değişkenler, parametrelerin çoğunun çarpık dağılımı nedeniyle çeyrekler arası aralığa sahip medyan olarak gösterilir.</li>
	<li>Wilcoxon sıra toplamı testini kullanarak COVID-19 hastaları ve sağlıklı kontroller arasındaki plazma MPO-DNA ve NE-DNA düzeylerini karşılaştırın. Optik yoğunluk ile NET standardının yüzdesi arasındaki ilişkiyi keşfetmek için korelasyon analizini kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e52779(2016).</li>
<li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).</li>
<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).</li>
<li>Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+NETosis+for+treatment+purposes%3A+Friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).</li>
<li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases.</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li>
<li>Sørensen, O. E., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+-+The+dark+side+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).</li>
<li>Abrams, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+neutrophil+extracellular+traps+%28NETs%29+formation+independently+predicts+disseminated+intravascular+coagulation+and+mortality+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps.</a> Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).</li>
<li>Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sandwich+ELISA+for+circulating+myeloperoxidase-+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes+released+from+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps.</a> Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196(2016).</li>
<li>Prevel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+markers+of+neutrophil+extracellular+trap+are+linked+to+survival+but+not+to+pulmonary+embolism+in+COVID-19-related+ARDS+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 851497(2022).</li>
<li>Schechter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+extracellular+trap+%28NET%29+levels+in+human+plasma+are+associated+with+active+TB%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB.</a> PLoS One. 12, e0182587(2017).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histone+H3+bound+DNA+for+detection+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps.</a> Cancers. 12 (11), 3424(2020).</li>
<li>Thålin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histones%3A+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> JCI Insight. 5 (11), e138999(2020).</li>
<li>Masso-Silva, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+peripheral+blood+neutrophil+activation+phenotypes+and+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+critically+ill+Coronavirus+disease+2019+%28COVID-19%29+patients%3A+A+case+series+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature.</a> Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).</li>
<li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587(2020).</li>
<li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li>
</ol>

Bu çalışma sırasında üretilen ve/veya analiz edilen tüm veriler bu yayınlanan makalede yer almaktadır. Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında MPO veya NE'nin yakalama antikorunun bir bölgesine bağlandığı bir sandviç ELISA yöntemini tanımladık. Yıkandıktan sonra, numunelerin peroksidaz ile ilişkili bir anti-DNA monoklonal antikoru ile inkübe edilmesiyle "sandviç" tamamlanır. Bağlanmamış sekonder antikorun çıkarılmasından sonra, bağlı peroksidaz konjugatı, 405 nm'de spektrofotometrik olarak okunabilen çözünür bir son ürün veren bir kromojenik ABTS peroksidaz substratının eklenmesiyle t...

Bu makale, DNA 1,2 ile miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) komplekslerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) kullanarak biyolojik sıvılarda nötrofil hücre dışı tuzak (NET) oluşumunu ölçmek için bir yöntemi özetlemektedir. NET'ler, nötrofil granüllerinden kaynaklanan antimikrobiyal proteazlarla süslenmiş bir DNA omurgasından oluşur 3,4. Hem MPO-DNA hem de NE-DNA kompleksleri, NET'lerin önemli ve spesifik bileşenleridir ve NET'lerinparçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınır 3,4.
Antimikrobiyal savunmadaki önemli fizyolojik rollerinin3 yanı sıra, NET'lerin trombogenezin6 teşviki ve sepsisinkötüleşmesi 7 dahil olmak üzere çeşitli patolojik etkileri de vardır 4,5. Bu doğrultuda, NET'ler son zamanlarda dikkat çekmektedir. Bununla birlikte, NET'lerin in vivo kantitifikasyonu, hassas, güvenilir bir kantitatif test yönteminin olmaması nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır.
NET'lerin floresan mikroskobu8,9 ve akış sitometrisi 10 ile doğrudan ölçümü ve dolaşımdaki hücresiz DNA, nükleozomlar ve sitrüline histon H3'ün dolaylı ölçümü dahil olmak üzere birkaç yöntem mevcuttur, ancak her yöntemin kendi avantajları ve sınırlamalarıvardır 11. İmmünofloresan mikroskobik yöntem NET'lere özgü olmasına ve NET oluşumunun lokalizasyonunu ve derecesini net olarak göstermesine rağmen, örnekler biyopsi dokusu ve salgılanan materyallerle sınırlıdır. Üstelik bu yöntemin yetenekli araştırmacılar tarafından yapılması gerekiyor ve sonuçların elde edilmesi uzun zaman alıyor. NET ile ilgili bileşenlerin dolaşımdaki seviyelerinin akış sitometrisi ile ölçülmesi kolaydır ve hızlı bir şekilde sonuç verir; ancak, yöntem NET12'ye özgü değildir.
Biz13 ve diğerleri1,2, yakalama antikorları olarak MPO veya NE için spesifik antikorlar ve DNA'ya özgü bir tespit antikoru kullanan modifiye edilmiş bir ELISA tekniği ile insan plazmasında dolaşımdaki NET bileşenlerini, MPO-konjuge veya NE-konjuge DNA'yı ölçmek için oldukça hassas ve güvenilir bir test geliştirdik. Bu test, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) stimülasyonuna yanıt olarak aktive edilmiş nötrofiller tarafından salınan hücre kültürü süpernatantlarındaki NET bileşenlerini tanımlamak için ex vivo olarak da kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>1 Adımlı Polimorflar</td><td>Doğru Kimyasal ve Bilimsel Corporation</td><td>AN221725</td><td>PMN'lerin insan kanından izolasyonu.</td></tr><tr><td>96 oyuklu mikrotitre plakası</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td><td>düz tabanlı</td></tr><tr><td>ABTS tampon çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>Sodyum perborat, sitrik asit ve disodyum hidrojen fosfat içerir.</td></tr><tr><td>ABTS tabletleri</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp;</td><td>Her tablet 5 mg ABTS substratı ve 60 mg araç maddesi içerir.</td></tr><tr><td>Yapışkanlı plastik kapak, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO antikoru</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&nbsp; 07-496-I</td><td>2-8 ° C'de saklayın 1 yıl boyunca stabil. Ev sahibi tür tavşandır.</td></tr><tr><td>Anti-NE antikoru, klon AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td><td>2-8 ° C'de saklayın. 1 yıl boyunca stabildir. Ev sahibi tür faredir.</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Biyomedikal Bilim</td><td>BR-220700081</td><td>Sığır fraksiyonundan albümin V. 2 & ndash'ta saklayın; 8 & derece C. 2 yıl boyunca kararlıdır.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>Mağazası -20 > C</td></tr><tr><td>IgG, tavşan, İzotip Kontrolü</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>2 & ndash'ta konsantre çözelti olarak saklayın; 8 derece >C.</td></tr><tr><td>IgG1, fare İzotip Kontrolü, klon Ci4</td><td>Merck&nbsp;</td><td>MABC002</td><td>2&ndash'ta konsantre çözelti olarak saklayın; 8 derece >C.</td></tr><tr><td>Lityum heparin kan alma tüpü</td><td>Becton Dickinson ve Şirketi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka karıştırıcı</td><td>Bir şirket olarak</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SpectraMax 190&nbsp;</td><td>405&ndash dalga boylarını okuyabilen herhangi bir mikroplaka okuyucu; 490 nm kullanabilir.</td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu uygulaması</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>Peroksidaz konjuge anti-DNA antikoru, Hücre ölümü Tespiti ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp; şişe 2. 2&ndash'ta saklayın; 8 & derece C. 1 yıl boyunca kararlıdır.</td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristat 13-asetat</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>PMN'lerin insan kanından aktivasyonu.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu çözelti</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>Oda sıcaklığında saklayın. 6 ay boyunca kararlıdır.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&nbsp; Systat Software Inc. San Jose, CA, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>t-Oktilfenoksipolietoksietanol, Polietilen glikol tert-oktilfenil eter</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr></tbody></table>

nötrofil hücre dışı tuzaklardan miyeloperoksidaz-dna ve nötrofil elastaz-dna komplekslerinin modifiye sandviç elisa kullanılarak miktarının belirlenmesi

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Mikroorganizmalar gibi bazı uyaranlar, nötrofillerin, temel olarak miyeloperoksidaz (MPO) ve nötrofil elastaz (NE) gibi granül proteinli DNA'dan ve sitoplazmik ve hücre iskeleti proteinlerinden oluşan ağ benzeri yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) serbest bırakmasına neden olur. Son zamanlarda NET'lere olan ilgi artmış olsa da, klinik ortamlarda NET'leri ölçmek için hassas, güvenilir bir test yöntemi mevcut değildir. Bu makalede, NET'lerin spesifik bileşenleri olan ve NET'lerin parçalanma ürünleri olarak hücre dışı boşluğa salınan dolaşımdaki NET'lerin iki bileşenini, MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent testi açıklanmaktadır. Test, yakalama antikorları ve DNA'ya özgü bir tespit antikoru olarak MPO veya NE için spesifik monoklonal antikorlar kullanır. MPO veya NE, MPO-DNA veya NE-DNA kompleksleri içeren numunelerin ilk inkübasyonu sırasında yakalama antikorunun bir bölgesine bağlanır. Bu tahlil, iyi doğrusallık ve yüksek tahliller arası ve tahlil içi hassasiyet gösterir. Eşlik eden akut solunum sıkıntısı sendromu olan COVID-19'lu 16 hastada kullandık ve MPO-DNA ve NE-DNA'nın plazma konsantrasyonlarının sağlıklı kontrollerden elde edilen plazmadan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulduk. Bu tespit testi, insan plazması ve kültür süpernatantlarındaki NET'lerin özelliklerini araştırmak için güvenilir, oldukça hassas ve kullanışlı bir yöntemdir.

Bu yöntem, MPO ile ilişkili ve NE ile ilişkili DNA'yı ölçmek için anti-MPO, anti-NE ve anti-DNA monoklonal antikorları olan bir sandviç ELISA kullandı (Şekil 1). Bu yöntemde, bir mikrotitre plakasının kuyucukları, DNA ile ilişkili MPO ve DNA ile ilişkili NE'nin yanı sıra DNA ile ilişkili olmayan MPO ve NE'yi yakalamak için MPO'ya özgü veya NE'ye özgü bir monoklonal antikor ile kaplandı. Test içi değişkenlik katsayısını (CV) hesaplamak için, COVID-19'lu hastalardan ve sağlıklı kontrollerden t...

Aktive edilmiş nötrofillerden türetilen nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarının, miyeloperoksidaz konjuge DNA ve nötrofil elastaz konjuge DNA komplekslerinin iki bileşenini kantitatif olarak ölçmek için modifiye edilmiş bir sandviç enzime bağlı immünosorbent test tekniği için bir protokol sunuyoruz.

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NET'ler son zamanlarda dikkat çekmiştir, ancak NET'lerin in vivo olarak ölçülmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, klinik ortamlarda NET'lerin özelliklerinin araştırılması için arzu edilen, son derece duyarlı ve değerli bir yöntem sağlar. Bu teknik, sepsis veya septik ARDS, akut solunum sıkıntısı sendromunun şiddetini değerlendirmek için genişletilmelidir.Dökümlerin veya hasarla ilişkili moleküler paternlerin düzenlenmesinin, sepsisin klinik durumunu iyileştirmenin anahtarı olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. Bu yöntemin en büyük avantajı, miyeloperoksidaz-DNA ve nötrofil elastaz-DNA gibi dolaşımdaki NET kalıntılarının kısa sürede doğru bir şekilde ölçülmesini içerir. Numunelerin tahlilden önce döndürülmesi ve tekrarlanan çözülmeden kaçınılması tavsiye edilir.Protokolde verilen kuluçka sürelerine uyulması önemlidir. Fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640'ta taze izole edilmiş polimorfonükleer nötrofilleri mililitre başına 10.000 hücreye seyrelterek başlayın. Onları 35 milimetrelik kültür kaplarında eleyin.Nötrofil hücre dışı tuzakları veya NET'leri indüklemek için, önce polimorfonükleer nötrofilleri 25 nanomolar PMA ile uyarın. Daha sonra, mililitre DNaz I başına 0.6 mikrogram ekleyerek hücre dışı tuzakları kısmen sindirin ve karışımı oda sıcaklığında 50 dakika inkübe edin. Şimdi, DNaz aktivitesini durdurmak için beş milimolar EDTA ekleyin ve sentezlenen NET'leri içeren ortamı toplayın.Hücre kalıntılarını temizlemek için santrifüjleyin. Süpernatanları dört sağlıklı kontrolden toplayın. Daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın.0.05 mikrogram antikor içeren 100 mikrolitre seyreltilmiş anti-miyeloperoksidazı bir ELISA plakasına pipetleyin. Şimdi, numunenin buharlaşmasını önlemek için plakayı yapışkan plastik bir kapakla örtün ve yakalama antikorlarının bağlanmasına izin vermek için numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, seyreltilmiş antikor çözeltisini kuyulardan atın ve her bir oyuğa 300 mikrolitre yıkama çözeltisi pipetleyin.Fazla PBS'yi çıkarmak için plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurulayın. Plakanın her bir kuyusunu 200 mikrolitre engelleme tamponu ile bloke edin. Yapışkan plastik bir kapakla örtün ve inkübe ederek kuyuları kapatın.Engelleme solüsyonunu kuyulardan attıktan ve plakayı üç ila dört kez yıkadıktan sonra, bir kağıt havlu üzerinde kurulayın. Daha sonra, boşluk hariç tüm kuyucuklara 25 mikrolitre plazma pipetleyin. Ve 75 mikrolitre PBS ile seyreltin, son kuyu hacmini 100 mikrolitre yapın.Ardından boş kuyuya 100 mikrolitre PBS ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 250 rpm'de 10 saniye boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek numuneleri karıştırın. Tüm kuyucuklara iki mikrolitre 100 tam seyreltilmiş DNaz I ekleyin ve numuneleri iyice karıştırmak için kapalı plakayı çalkalayıcıya 10 saniye yerleştirin.Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. DNaz reaksiyonunu durdurmak için her oyuğa bir mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin. Ardından, numuneleri iyice karıştırmak için kapalı plakayı çalkalayıcıya 15 saniye yerleştirin.Son olarak, NET'lerin protein bileşenlerinin yakalama antikorlarına bağlanmasına izin vermek için plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, çözeltiyi kuyulardan atın. Birden fazla kuyu yıkamadan sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş peroksidaz konjuge anti-DNA tespit antikoru pipetleyin.Plakayı 1 1/2 saat inkübe edin ve ardından çözeltiyi kuyucuklara atın. Kuyucukları üç kez yıkadıktan sonra, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre ABTS substrat çözeltisi pipetleyin ve kapalı plakayı karanlıkta bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. 50 mikrolitre iki molar sülfürik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun.Plaka kenarlarına dikkatlice vurarak kuyu içeriğini karıştırın. Ardından, mikroplaka okuyucuyu bilgisayara bağlayın ve yazılım uygulamasını başlatın. Durum çubuğundan yeni bir deneme oluşturun ve adlandırın.Ardından, okuma türü olarak Absorbans'ı, okuma modu olarak Uç Nokta'yı ve dalga boyları olarak ikiyi seçerek plaka okuma parametrelerini ayarlayın. Ardından, lambda bir 405 nanometre, lambda iki 490 nanometre olarak ayarlayın. Şimdi, Otomatik Kalibrasyonu Açık olarak tutarken hem Otomatik Karıştırma hem de Karartma için Kapalı durumunu seçin.Ardından Şeritler altında Tüm plakayı oku'yu seçin.Son olarak, Sütun Dalga Boyu Önceliği'ni Taşıma Hızı olarak Normal olarak ayarlayın ve ardından Otomatik Okuma altında Kapalı'yı seçin. Plakayı alet çekmecesine iyice yerleştirin ve kapatın. Plakanın hemen okunması için Oku'ya tıklayın.Her bir oyuğun absorbansını 405 nanometrede okuyun ve tüm bilinmeyen numunelerden tahlil ortamı absorbansının otomatik olarak çıkarılmasını gerçekleştirin. Absorbans değerleri sırasıyla 0.93 ve 0.9'u geçmediğinde hem MPO-DNA hem de NE-DNA için güvenilir standart kalibrasyon eğrileri elde edildi. En yüksek OD, mililitre başına 0.6 mikrogram DNaz I uygulandığında elde edildi.Sağlıklı kontrollerde kompleksler için testler arası değişkenlik katsayıları sırasıyla 1.871 ve 0.987 iken, COVID-19 hastaları sırasıyla 2.532 ve 2.010 değişkenlik katsayıları gösterdi. MPO-DNA ve NE-DNA için ortalama testler arası değişkenlik katsayıları sırasıyla 6.524 ve 4.389 idi. Yakalama antikorlarının MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerine özgüllüğü, izo-tipi kontrol antikorlarının komplekslere çok az tepki verdiğini gösterdi.Her iki kompleksin yüzdesi, sağlıklı kontrollere göre COVID-19'lu hastalardan alınan plazmada daha yüksekti. DNaz sindirim süresi optimize edilmelidir, aksi takdirde aşırı sindirim emilimi azaltacaktır.

quantifying-myeloperoxidase-dna-neutrophil-elastase-dna-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET), patojen bakteriler, mantarlar ve parazitler mücadele için önemli bir doğuştan gelen bağışıklık mekanizması. Burada insan kan nötrofil granülositler izole etmek ve NET'ler oluşturmak için bunları etkinleştirmek yöntemleri açıklanmaktadır. Biz ışık ve elektron mikroskobu NET'ler görselleştirmek için hazırlama teknikleri mevcut.

Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar: Onları nasıl oluşturun ve görselleştirin için

Bu video, anti-nötrofil sitoplazmik antikorlar içeren hasta serumu kullanılarak önceden etiketlenmiş nötrofillerde nötrofil hücre dışı tuzakların veya NET'lerin indüksiyonunu ve görselleştirilmesini göstermektedir. Ayrıca, geçirimsiz bir DNA boyası ve floresan mikroskobu kullanmak, NET'lerin görüntülenmesini sağlar.

Önceden Etiketlenmiş Nötrofillerde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların İndüksiyonu ve Görselleştirilmesi

İnsan nötrofillerinden NET salınımını ölçmek için mükemmel araçlar sağlayan yüksek verimli testler sunulmaktadır.

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Lipidler hücresel fonksiyonlarda önemli rol oynadıkları bilinmektedir. Burada, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması için HPTLC ve HPLC birlikte kullanarak, kolesterol seviyesi üzerinde durularak, nötrofillerin lipit bileşimini belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Nötrofil dışı tuzaklar (NET) DNA, histon ve nötrofil proteinlerin ağlardır. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir bileşeni olmasına rağmen, ağ otoimmün ve tromboz implike edilmiştir. Bu protokol, köpek nötrofil izolasyon ve bir mikroplaka flüoresans deneyi kullanılarak NET'ler ölçümü için basit bir yöntem tarif eder.

Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Biz tam kan gelen köpek nötrofil yalıtmak ve NET canlı nötrofil floresans mikroskobu kullanılarak oluşumunda görselleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Ayrıca açıklanan NET oluşumu ve citrullinated histon H3 ölçmek için iletişim kurallarıdır ayirt mikroskobu kullanarak (citH3) ifade.

Vitro Köpek nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu: Floresans mikroskobu dinamik ve nicel analiz

Burada, nötrofil ekstrasellüler tuzakları (NETTs) ve işletim NETQUANT, immünororesans görüntüleri NTs quantification için tam otomatik bir yazılım seçeneği oluşturmak için bir protokol salıyoruz.

NETQUANT Kullanarak Nötrofil Ekstrasellüler Tuzakların Otomatik Görüntü Tabanlı Niceliği

Bu iletişim kuralı bir son derece hassas ve yüksek üretilen iş nötrofil hücre dışı tuzak (NET) tahlil için ex vivo NET oluşumu miktar yarı otomatik ayirt üç boyutlu confocal mikroskobu tarafından açıklanır. Bu iletişim kuralı NET oluşumu ve bozulma farklı uyaranlara sonra değerlendirmek için kullanılan ve potansiyel NET hedefli tedaviler çalışma için kullanılabilir.

Nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu ölçmek ve değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tahlil

Burada in vitro nötrofil hücre dışı tuzakların (NET'ler) indüksiyonu ve analizi için bir protokol sunulmaktadır. DNA, katelisidin (LL37) ve enzim aktivitesinin nicelleştirilmesi, benzer kontrollü koşullar altında mikrobiyal ve kimyasal uyaranlar tarafından indüklenen NET'lerin bileşimindeki ve morfolojisindeki değişkenliği gösteren veriler vermiştir.

Mikrobiyal ve Kimyasal Uyaranlar Tarafından İndüklenen Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Morfolojik ve Bileşimsel Analizi

Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET'ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.

İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği

Bu tanımlanmış protokol, insan nötrofil hücre dışı tuzak (NET) salınımını in vitro olarak görselleştirmek ve ölçmek için gerçek zamanlı, yüksek verimli bir mikroskopi yaklaşımını tanımlar. Tekrarlanabilir yöntem, farklı NETosis indükleyicileri ile stimülasyon üzerine NET salınımının özelliklerinin ve kinetiğinin araştırılmasına olanak tanır ve NETosis antagonistlerinin farmakolojisinin değerlendirilmesini sağlar.

İnsan Nötrofil Hücre Dışı Tuzak Salınımının Gerçek Zamanlı, Yüksek Verimli Mikroskobik Miktar Tayini ve Antagonistlerin Farmakolojisinin Değerlendirilmesi

Öğrenin, modifiye sandviç ELISA ile nötrofil hücre dışı tuzak kalıntılarını hassas şekilde ölçme yöntemini. Miyeloperoksidaz-DNA ve nötrofil elastaz-DNA komplekslerini klinik örneklerde hızlıca nicelendirin.

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi (Video) | JoVE Journal

Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

Daha fazla video keşfet