Nötrofil Hücre Dışı Tuzaklardan Miyeloperoksidaz-DNA ve Nötrofil Elastaz-DNA Komplekslerinin Modifiye Sandviç ELISA Kullanılarak Miktarının Belirlenmesi

NET'ler son zamanlarda dikkat çekmiştir, ancak NET'lerin in vivo olarak ölçülmesinin zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, klinik ortamlarda NET'lerin özelliklerinin araştırılması için arzu edilen, son derece duyarlı ve değerli bir yöntem sağlar. Bu teknik, sepsis veya septik ARDS, akut solunum sıkıntısı sendromunun şiddetini değerlendirmek için genişletilmelidir.

Dökümlerin veya hasarla ilişkili moleküler paternlerin düzenlenmesinin, sepsisin klinik durumunu iyileştirmenin anahtarı olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. Bu yöntemin en büyük avantajı, miyeloperoksidaz-DNA ve nötrofil elastaz-DNA gibi dolaşımdaki NET kalıntılarının kısa sürede doğru bir şekilde ölçülmesini içerir. Numunelerin tahlilden önce döndürülmesi ve tekrarlanan çözülmeden kaçınılması tavsiye edilir.

Protokolde verilen kuluçka sürelerine uyulması önemlidir. Fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640'ta taze izole edilmiş polimorfonükleer nötrofilleri mililitre başına 10.000 hücreye seyrelterek başlayın. Onları 35 milimetrelik kültür kaplarında eleyin.

Nötrofil hücre dışı tuzakları veya NET'leri indüklemek için, önce polimorfonükleer nötrofilleri 25 nanomolar PMA ile uyarın. Daha sonra, mililitre DNaz I başına 0.6 mikrogram ekleyerek hücre dışı tuzakları kısmen sindirin ve karışımı oda sıcaklığında 50 dakika inkübe edin. Şimdi, DNaz aktivitesini durdurmak için beş milimolar EDTA ekleyin ve sentezlenen NET'leri içeren ortamı toplayın.

Hücre kalıntılarını temizlemek için santrifüjleyin. Süpernatanları dört sağlıklı kontrolden toplayın. Daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın.

0.05 mikrogram antikor içeren 100 mikrolitre seyreltilmiş anti-miyeloperoksidazı bir ELISA plakasına pipetleyin. Şimdi, numunenin buharlaşmasını önlemek için plakayı yapışkan plastik bir kapakla örtün ve yakalama antikorlarının bağlanmasına izin vermek için numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, seyreltilmiş antikor çözeltisini kuyulardan atın ve her bir oyuğa 300 mikrolitre yıkama çözeltisi pipetleyin.

Fazla PBS'yi çıkarmak için plakayı bir kağıt havlu üzerinde kurulayın. Plakanın her bir kuyusunu 200 mikrolitre engelleme tamponu ile bloke edin. Yapışkan plastik bir kapakla örtün ve inkübe ederek kuyuları kapatın.

Engelleme solüsyonunu kuyulardan attıktan ve plakayı üç ila dört kez yıkadıktan sonra, bir kağıt havlu üzerinde kurulayın. Daha sonra, boşluk hariç tüm kuyucuklara 25 mikrolitre plazma pipetleyin. Ve 75 mikrolitre PBS ile seyreltin, son kuyu hacmini 100 mikrolitre yapın.

Ardından boş kuyuya 100 mikrolitre PBS ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 250 rpm'de 10 saniye boyunca bir çalkalayıcı üzerine yerleştirerek numuneleri karıştırın. Tüm kuyucuklara iki mikrolitre 100 tam seyreltilmiş DNaz I ekleyin ve numuneleri iyice karıştırmak için kapalı plakayı çalkalayıcıya 10 saniye yerleştirin.

Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. DNaz reaksiyonunu durdurmak için her oyuğa bir mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin. Ardından, numuneleri iyice karıştırmak için kapalı plakayı çalkalayıcıya 15 saniye yerleştirin.

Son olarak, NET'lerin protein bileşenlerinin yakalama antikorlarına bağlanmasına izin vermek için plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, çözeltiyi kuyulardan atın. Birden fazla kuyu yıkamadan sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş peroksidaz konjuge anti-DNA tespit antikoru pipetleyin.

Plakayı 1 1/2 saat inkübe edin ve ardından çözeltiyi kuyucuklara atın. Kuyucukları üç kez yıkadıktan sonra, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre ABTS substrat çözeltisi pipetleyin ve kapalı plakayı karanlıkta bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. 50 mikrolitre iki molar sülfürik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Plaka kenarlarına dikkatlice vurarak kuyu içeriğini karıştırın. Ardından, mikroplaka okuyucuyu bilgisayara bağlayın ve yazılım uygulamasını başlatın. Durum çubuğundan yeni bir deneme oluşturun ve adlandırın.

Ardından, okuma türü olarak Absorbans'ı, okuma modu olarak Uç Nokta'yı ve dalga boyları olarak ikiyi seçerek plaka okuma parametrelerini ayarlayın. Ardından, lambda bir 405 nanometre, lambda iki 490 nanometre olarak ayarlayın. Şimdi, Otomatik Kalibrasyonu Açık olarak tutarken hem Otomatik Karıştırma hem de Karartma için Kapalı durumunu seçin.Ardından Şeritler altında Tüm plakayı oku'yu seçin.

Son olarak, Sütun Dalga Boyu Önceliği'ni Taşıma Hızı olarak Normal olarak ayarlayın ve ardından Otomatik Okuma altında Kapalı'yı seçin. Plakayı alet çekmecesine iyice yerleştirin ve kapatın. Plakanın hemen okunması için Oku'ya tıklayın.

Her bir oyuğun absorbansını 405 nanometrede okuyun ve tüm bilinmeyen numunelerden tahlil ortamı absorbansının otomatik olarak çıkarılmasını gerçekleştirin. Absorbans değerleri sırasıyla 0.93 ve 0.9'u geçmediğinde hem MPO-DNA hem de NE-DNA için güvenilir standart kalibrasyon eğrileri elde edildi. En yüksek OD, mililitre başına 0.6 mikrogram DNaz I uygulandığında elde edildi.

Sağlıklı kontrollerde kompleksler için testler arası değişkenlik katsayıları sırasıyla 1.871 ve 0.987 iken, COVID-19 hastaları sırasıyla 2.532 ve 2.010 değişkenlik katsayıları gösterdi. MPO-DNA ve NE-DNA için ortalama testler arası değişkenlik katsayıları sırasıyla 6.524 ve 4.389 idi. Yakalama antikorlarının MPO-DNA ve NE-DNA komplekslerine özgüllüğü, izo-tipi kontrol antikorlarının komplekslere çok az tepki verdiğini gösterdi.

Her iki kompleksin yüzdesi, sağlıklı kontrollere göre COVID-19'lu hastalardan alınan plazmada daha yüksekti. DNaz sindirim süresi optimize edilmelidir, aksi takdirde aşırı sindirim emilimi azaltacaktır.