Name: Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Öğrenin, Nicotiana benthamiana hücrelerinde histon modifiye edici enzimler ile transkripsiyon faktörleri arasındaki protein-protein etkileşimlerini in vivo FRET tekniği ile nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem epigenetik düzenlemeyi anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

V.C.'nin laboratuvarındaki çalışmalar, NIH (R35GM144059 ve R01GM50224), NSF (MCB1913165 ve IOS1758046) ve BARD'dan (IS-5276-20) V.C.'ye verilen hibelerle desteklenmektedir.

Bu çalışmada Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens suşu EHA105 veya GV3101 kullanılmıştır.
1. FRET vektör yapısı
<ol><li>Donör/alıcı FRET çifti için floresan etiketleri seçin.<ol><li>Donör vektörünü oluşturmak için pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 15,28'den EGFP kullanın (bkz.</li>
		<li>Alıcı vektörü oluşturmak için pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1'den mRFP kullanın (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Ağ Geçidi rekombinasyon klonlama sistemi35 gibi bölgeye özgü bir rekombinasyon klonlama tekniği34 kullanarak donör/alıcı FRET yapılarını oluşturun.<ol><li>İlgilenilen proteinlerin kodlama dizilerini yükseltin36 (yani, Arabidopsis OTLD1 ve LSH10)15. NOT: Etkileşen proteinlerden birinin homologunu temsil eden, ancak etkileşim göstermesi beklenmeyen negatif bir kontrol kullanmak da iyi bir fikirdir; OTLD1-LSH10 etkileşim çalışması, OTLD1'i tanımayan LSH10, LSH4'ün bir homologunu kullanır. OTLD1, LSH10 ve LSH4 cDNA'ları, Tablo 1'de listelenen primerler kullanılarak PCR ile güçlendirilir.</li>
		<li>OTLD1, LSH10 ve LSH4'ü, bölgeye özgü rekombinasyon klonlama tekniği34 ile pDONR207 giriş vektörüne klonlayın.</li>
		<li>LSH10 ve LSH4'ü pDONR207'den pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 ikili hedef vektörüne aktarmak için Ağ Geçidi LR Clonase II'yi (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak p35S::LSH10-GFP (test edilmiş yapı) ve p35S::LSH4-GFP (negatif kontrol) ikili donör yapılarını oluşturun.</li>
		<li>OTLD1'i pDONR207'den pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 ikili hedef vektörüne aktarmak için piyasada bulunan aynı enzimi (adım 1.2.3) kullanarak p35S::OTLD1-mRFP (test edilmiş yapı) ikili alıcı yapısını oluşturun.</li>
		<li>Tablo 1'de listelenen primerleri kullanarak pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1'den36 mRFP'yi PCR-amplify edin, rekombinasyon klonlama tekniği ile pDONR207'ye klonlayın ve ardından ikili füzyon yapısı p35S::mRFP-GFP'yi (pozitif kontrol) oluşturmak için mRFP'yi pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1'e aktarmak için LR Clonase II'yi kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Donör ve alıcı yapılarının Agrobacterium'a dönüşümünü gerçekleştirin.<ol><li>Standart protokoller 37 kullanılarak hazırlanan veya ticari olarak elde edilen Agrobacterium tumefaciens suşu EHA105 veya GV3101'in yetkin hücrelerinin kültürünün 1.2.3-1.2.5 ila 100 μL adımlarından her plazmidin 1 μG'sini ekleyin ve 5 dakika boyunca37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Yetkili hücre karışımına 1 mL LB ortamı (% 1 tripton,% 0.5 maya ekstraktı ve% 1 NaCl; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 1.5 saat boyunca 200 rpm ve 28 ° C'de çalkalayın. Hücreleri, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleme yoluyla toplayın.</li>
		<li>Pipetleme yoluyla hücreleri 0.1 mL LB ortamında yeniden askıya alın ve uygun antibiyotiklerle desteklenmiş LB agarına yayın (örneğin,% 0.01 spektinomisin ve% 0.005 rifampisin; bakınız Malzeme Tablosu). 2 gün boyunca 28 ° C'de büyüyün.</li>
		<li>Bireysel kolonileri seçin ve her birini ayrı ayrı uygun antibiyotiklerle desteklenmiş 1 mL LB suyuna aşılayın.</li>
		<li>Hücreleri 24 saat boyunca 28 ° C'de büyütün ve kültürün 0.2 mL'sini yeni bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 30 s için 10.000 × g'da santrifüjleme yoluyla toplayın.</li>
		<li>Plazmid DNA'sını, plazmidleri Agrobacterium hücrelerinden izole etmek için standart bir protokolle ekstrakte edin 38 ve ekstrakte edilen DNA'yı30 μL suda yeniden askıya alın. İstenilen plazmidleri barındıran kolonileri tanımlamak için, DNA preparatının 2 μL'sini, Tablo 1'de listelenen gen-spesifik primerlerle PCR için bir şablon olarak kullanın. Tanımlanan kültürün 0.7 mL'sini 0.3 mL gliserol ile karıştırın ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tarımsal sızma
<ol><li>Nicotiana benthamiana bitkilerini yetiştirin. NOT: Tüm deney boyunca, tüm bitkiler sağlıklı olmalıdır.<ol><li>N. benthamiana tohumlarını yüksek yoğunlukta ıslak toprak içeren bir tencereye ekin ve yetiştirin.</li>
		<li>Ekilenleri, öfilin çapı 0,5 cm'ye ulaşana kadar 16 saat ışık ve 8 saat karanlık döngü ile 150-170 μmol / m2 s ışık yoğunluğu ile23° C'de ayarlanmış bir büyüme odasında tutun.</li>
		<li>Fideleri daha büyük saksılara aktarın ve aynı odada aynı parametrelerle büyümelerine izin verin. NOT: Bitkiler, en büyük yaprakları 5-7 cm çapında, genellikle 4-5 hafta içinde agroinfiltrasyona hazırdır. Çok genç olan daha küçük bitkilerde, agroinfiltrasyonun etkileri FRET analizi için çok şiddetli olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Agroinfiltrasyon için bakteri hücreleri hazırlayın.<ol><li>FRET yapılarını içeren her bir Agrobacterium kolonisini, uygun antibiyotiklerle (adım 1.3.3) ve 28 ° C'de 150 μM asetosirringon ile desteklenmiş 5 mL LB ortamında bir gecede büyütün (bkz.</li>
		<li>Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüj yapın. </li>
		<li>Agroinfiltrasyon tamponundaki hücreleri (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5.6, 150 μM asetosirringon) OD600 = 0.5'e kadar yeniden askıya alın.</li>
		<li>Yeniden askıya alınan hücreleri, uygun yapıları barındıran hücreler arasında 1: 1 v / v oranında birleştirin (adım 2.2.5).</li>
		<li>Çift yapılı tarımsal sızmalar için, iki kültürün alikotlarını karıştırın ve tek yapılı tarımsal sızmalar için aynı kültürün alikotlarını karıştırın:<ol><li>Test edilen proteinler: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (p35S::OTLD1-mRFP ve p35S::LSH10-GFP yapılarını barındıran bakteriler).</li>
			<li>Negatif kontrol: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (p35S::OTLD1-mRFP ve p35S::LSH4-GFP yapılarını barındıran bakteriler).</li>
			<li>Negatif kontrol: LSH10-GFP + serbest mRFP (p35S::LSH10-GFP ve pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 yapılarını barındıran bakteriler).</li>
			<li>Pozitif kontrol: mRFP-GFP (p35S::mRFP-GFP yapısını barındıran bakteriler).</li>
		</ol></li>
		<li>Hücreleri 0.5-1 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Agroinfiltrasyon gerçekleştirin.<ol><li>Bakteri kültürünü 1 mL'lik iğnesiz bir şırıngaya yükleyin.</li>
		<li>Şırınganın nozulunu tamamen genişlemiş N. benthamiana yapraklarının abeksenel tarafına nazikçe ama sıkıca bastırırken, yaprağı adaksiyal tarafta eldivenli bir parmakla tutun.</li>
		<li>Bir yaprak üzerinde dört noktaya kadar sızın, bitki başına üç yaprak, her bakteri kültürü için iki veya üç bitki yapın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında eldiven değiştirin.</li>
		<li>Agrosızmış bitkileri, adım 2.1.2'de açıklandığı gibi, aynı büyüme odasında, 24 saat ila 36 saat boyunca aynı koşullar altında tutun. Agrosızmış bitkileri 36 saatten daha uzun süre tutmayın, çünkü bu floresan sinyalini azaltacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Konfokal mikroskopi
<ol><li>Floresan görselleştirme için mikroskop slaytları hazırlayın.<ol><li>İnfiltrasyonun 24-36 saatinden sonra, her agroinfiltre edilmiş yaprağı damarlar arasında küçük parçalara (2 mm x 4 mm) kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.</li>
		<li>Yaprak parçalarını, abeksenel yaprak yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine yerleştirin. Yaprak parçalarına bir damla su koyun ve kapak camıyla örtün. Hava kabarcıklarını gidermek için kapak camına hafifçe dokunun.</li>
		<li>Mikroskop ve lazeri açın (bkz. Slaytı, belirli FRET parametreleri altında görüntüleme için mikroskop sahne tutucusuna yerleştirin (adım 3.2 ve 3.3).</li>
		<li>Hem GFP hem de mRFP sinyallerini sergileyen hücreleri tanımlamak için 10x objektif lens kullanarak gözlemlere başlayın ve ardından sonraki ayrıntılı gözlemler için 40x objektif lens kullanın. NOT: Önemli olarak, SE-FRET ve AB-FRET genellikle aynı doku örneği üzerinde gerçekleştirilir ve sırasıyla SE-FRET ve AB-FRET gözlemleri için açılıp kapatılan FRET kanalı hariç (adım 3.2) aynı kanal ayarlarının (adım 3.2) kullanılmasına izin verir (adım 3.2.3 ve 3.3.1).</li>
	</ol></li>
	<li>SE-FRET parametrelerini ayarlayın (Şekil 1A).<ol><li>Çok Boyutlu Alma (MDA) aracını açın.</li>
		<li>Aynı görüş alanında üç konfokal kanaldan oluşan bir küme oluşturun (Ek Şekil 1).<ol><li>405 nm uyarma lazeri ve 400-597 nm emisyon filtresi ile donör florokromun uyarılması ve emisyonu için donör kanalını (GFP kanalı) ayarlayın.</li>
			<li>561 nm uyarma lazeri ve 400-597 nm emisyon filtresi ile alıcı florokromun uyarılması ve emisyonu için alıcı kanalı (mRFP kanalı) ayarlayın. NOT: mRFP emisyon filtresi, mRFP sinyalini FRET sinyalinden 597-617 nm'de (adım 3.2.2.3) ayırmak ve böylece FRET'den bağımsız mRFP emisyonunu azaltmak için 400-597 nm olarak ayarlanmıştır.</li>
			<li>405 nm uyarma lazeri ve 597-617 nm emisyon filtresi ile vericinin uyarılması ve alıcı florokromların emisyonu için FRET kanalını ayarlayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Fotobeyazlatmayı önlerken FRET'yi gözlemlemek için donör uyarma yoğunluğunu minimum seviyeye ayarlayın ve SE-FRET verimliliğini azaltın. NOT: Bu uyarma yoğunluğu, fotobeyazlatmayı önlemek için FRET prosedürü uygulanmadan önce deneysel olarak seçilir. Yaprak kalınlığına, yaşına ve aşırı ekspresyondan sonraki zamana bağlı olarak değişir.</li>
		<li>Donörü uyarın ve alıcının beklenen floresan sinyalini içeren hücreleri tarayın.</li>
		<li>İlgilenilen floresan sinyalini içeren bölgeyi seçin.</li>
		<li>Tutturma düğmesine basarak bir SE-FRET görüntü dizisi edinin.<ol><li>Önce mRFP-GFP yapısını (pozitif kontrol) ifade eden görüntü 10-15 hücre; odaklanım, yakınlaştırma ve akıllı kazanç parametrelerini yakalanacak ilgi alanına odaklanacak şekilde ayarlayın (Ek Şekil 2).</li>
			<li>Aynı ayarları kullanarak, her biri OTLD1-mRFP, serbest mRFP, LSH10-GFP veya LSH4-GFP'yi ayrı ayrı ifade eden 10-15 hücreyi görüntüleyin. NOT: Bu görüntüler, alıcılar ve bağışçılar için spektral kanama (SBT) değerlerini belirlemek üzere FRET veri analizleri (adım 3.4.1) için kullanılan ImageJ'nin "PixFRET" eklentisi (bkz. Malzeme Tablosu) tarafından edinilir; Bu görüntüler yazılım tarafından OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP ve LSH10-GFP + serbest mRFP protein çiftleri için SE-FRET görüntüleri oluşturmak için kullanılır (adım 3.2.6.3).</li>
			<li>Ayrıca, aynı ayarları kullanarak, OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP ve LSH10-GFP + serbest mRFP protein çiftlerini birlikte ifade eden görüntü 10-15 hücre.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>AB-FRET için parametreleri ayarlayın (Şekil 1B).<ol><li>SE-FRET için ayarlanan donör ve alıcı kanal parametrelerini kullanın (adım 3.2.2) ancak FRET kanalını kapatın.</li>
		<li>Alıcının fotobeyazlatılması için parametreleri ayarlayın (mRFP) (Ek Şekil 3).<ol><li>Beyazlatmanın beş görüntüden sonra başladığından emin olun. Her alan ağartıcısı için 200 yinelemeye izin verin. % 100 lazer yoğunluğunu 561 nm'de tutun.</li>
			<li>Beyazlatma süresini 45 sn tutun. 400 Hz'de 512 x 512 piksel tarama hızı sağlayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Ağartılacak hücrenin bölgesini çizin; Örneğin, nükleer etkileşimler için, ilgilenilen bölgeler hücre çekirdeğinin tüm alanı etrafında çizilir39.</li>
		<li>Denemeyi başlat düğmesine basarak ağartmayı etkinleştirin; Bu fonksiyonun etkinleştirilmesi fotobeyazlatmayı gerçekleştirecek ve AB-FRET görüntü dizisini elde edecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>FRET verilerini analiz edin.<ol><li>SE-FRET verilerini analiz etmek için, SBT40'ı çıkardıktan sonra SE-FRET verimliliğinin düzeltilmiş görüntülerini oluşturmak üzere ImageJ yazılımı için "PixFRET" eklentisini kullanın (adım 3.2.6.2).</li>
		<li>AB-FRET verilerini analiz etmek için, aşağıdaki formülü41 kullanarak mRFP fotobeyazlatma işleminden sonra GFP emisyonundaki yüzde artış olarak %AB-FRET hesaplayın: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, burada GFPpost, mRFP fotobeyazlatmadan sonra GFP emisyonudur ve GFPpre, mRFP fotobeyazlatmadan önce GFP emisyonudur.</li>
		<li>FRET görüntülerini incelerken, FRET sinyalinin hücre altı lokalizasyonuna dikkat edin. NOT: Birçok durumda, bu hücresel bölmeler (örneğin, çekirdek, kloroplastlar, ER, vb.) kolayca tanımlanabilir ve FRET tekniğinin ek bir yararı olarak, etkileşime giren proteinlerin biyolojik işlevine önemli ipuçları sağlar.</li>
	</ol></li>
</ol>

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.

Bu FRET protokolü basit ve yeniden üretilmesi kolaydır; aynı zamanda minimum tedarik yatırımı gerektirir ve birçok modern laboratuvar için standart ekipman kullanır. Spesifik olarak, beş ana teknik özellik bu prosedürün çok yönlülüğünü ayırt eder. İlk olarak, FRET yapıları, kullanımı kolay, doğru sonuçlar üreten ve geleneksel kısıtlama enzimi tabanlı klonlamaya kıyasla zamandan tasarruf sağlayan bir klonlama yaklaşımı olan bölgeye özgü rekombinasyon kullanılarak oluşturulur. İkincisi, N. benthamiana bitkilerinin...

Bitki histon deubikitinazları, histonların post-translasyonel modifikasyonuyla, özellikle monoubikitilasyon işaretlerini silerek gen ekspresyonunu kontrol etmede önemli bir rol oynar1. Şimdiye kadar, OTLD1, Arabidopsis 2,3'te moleküler düzeyde karakterize edilen birkaç bitki histon deubikitinazından biridir. OTLD1, monoubikitin gruplarını H2B histon moleküllerinden uzaklaştırır, böylece hedef gen kromatin 4,5'teki H3 histonlarının ekromatik asetilasyon ve metilasyon modifikasyonlarının çıkarılmasını veya eklenmesini teşvik eder. Ayrıca, OTLD1, hedef genlerin transkripsiyonel baskılanmasını etkilemek için başka bir kromatin modifiye edici enzim olan histon lizin demetilaz KDM1C ile etkileşime girer 6,7.
Çoğu histon modifiye edici enzim DNA bağlanma yeteneklerinden yoksundur ve bu nedenle hedef genlerini doğrudan tanıyamazlar. Bir olasılık, bu enzimleri bağlayan ve onları kromatin hedeflerine yönlendiren DNA bağlayıcı transkripsiyon faktörü proteinleriyle işbirliği yapmalarıdır. Spesifik olarak, bitkilerde, birkaç ana histon modifiye edici enzimin (yani, histon metiltransferazlar8,9, histon asetiltransferazlar 10, histon demetilatazlar 11 ve Polycomb baskılayıcı kompleksleri12,13,14) transkripsiyon faktörleri tarafından işe alındığı bilinmektedir. Bu fikirle tutarlı olarak, son zamanlarda, OTLD1'in hedef promotörlere işe alınması için OTLD1'in bir transkripsiyon faktörü LSH1015 ile spesifik protein-protein etkileşimlerine dayanan olası bir mekanizma önerilmiştir.
LSH10, merkezi gelişimsel düzenleyiciler 16,17,18,19,20,21,22 olarak işlev gören bitki ALOG (Arabidopsis LSH1 ve Oryza G1) proteinlerinin bir ailesine aittir. ALOG protein ailesinin üyelerinin DNA bağlayıcı motifler23 içermesi ve transkripsiyonel düzenleme22, nükleer lokalizasyon 19 ve homodimerizasyon24 kapasitelerini sergilemesi,LSH10 da dahil olmak üzere bu proteinlerin transkripsiyonun epigenetik düzenlenmesi sırasında spesifik transkripsiyon faktörleri olarak hareket edebileceği fikrine daha fazla destek vermektedir. LSH10-OTLD1 etkileşimini in vivo olarak karakterize etmek için kullanılan ana deneysel tekniklerden biri floresan rezonans enerji transferidir (FRET)15.
FRET, canlı hücrelerin içinde birbirlerinden25 <10 nm içindeki proteinler arasındaki yakın mesafeli etkileşimleri doğrudan tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. FRET yaklaşım26'nın iki ana varyasyonu vardır: duyarlılaştırılmış emisyon (SE-FRET) (Şekil 1A) ve alıcı beyazlatma (AB-FRET) (Şekil 1B). SE-FRET'te, biri donör florokrom (örneğin, yeşil floresan proteini, GFP) ve diğeri alıcı florokrom (örneğin, monomerik kırmızı floresan protein, mRFP27,28) ile etiketlenmiş olan etkileşimli proteinler, uyarılmış durum enerjisini radyal olmayan bir şekilde donörden alıcıya aktarır. Bu aktarım sırasında hiçbir foton yayılmadığından, alıcınınkine benzer bir ışınımsal emisyon spektrumuna sahip bir floresan sinyali üretilir. AB-FRET'te, protein etkileşimleri, alıcı fotobeyazlatma ile kalıcı olarak inaktive edildiğinde ve bu nedenle donörden aktarılan ışınımsal olmayan enerjiyi alamadığında donörün yüksek radyasyon emisyonuna dayanarak tespit edilir ve ölçülür (Şekil 1). Önemli olarak, FRET floresansının hücre altı konumu, hücredeki etkileşimli proteinlerin lokalizasyonunun göstergesidir.
FRET'yi canlı dokulara yerleştirme ve etkileşen proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu belirleme yeteneği, bu etkileşimi kendi başına tespit etmekle aynı anda FRET'yi çalışmalar ve protein-protein etkileşimlerinin in vivo olarak ilk karakterizasyonu için tercih edilen teknik haline getirmektedir. Karşılaştırılabilir bir in vivo floresan görüntüleme metodolojisi olan bimoleküler floresan tamamlama (BiFC)29,30,31,32, iyi bir alternatif yaklaşımdır, ancak FRET'in aksine, BiFC, otofloresan BiFC muhabirlerinin spontan montajı nedeniyle yanlış pozitifler üretebilir 33 ve verilerinin nicelleştirilmesi daha az hassastır.
Bu makale, hem SE-FRET hem de AB-FRET tekniklerinin uygulanmasındaki başarılı deneyimi paylaşmakta ve bitki hücrelerinde OTLD1 ve LSH10 arasındaki etkileşimleri araştırmak için konuşlandırılmaları için bir protokol sunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Asetosiringon (3&asal;,5&prime;-Dimetoksi-4&prime;-hidroksiasetofenon)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>#214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto trypton</td><td>BD Biosciences</td><td>#211705</td> Bacto maya özü BD Biosciences#212750<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td>Benzer yeteneklere sahip herhangi bir CLSM uygundur</td></tr><tr><td>EHA105</td><td>VWR</td><td>104013-310</td><td>Citovsky bakteri laboratuvarı stok koleksiyonundaki stoğu kullanıyoruz</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>#11789100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GV3101</td><td>VWR</td><td>104013-296</td><td>Citovsky bakteri laboratuvarı stok koleksiyonundaki stoğu kullanıyoruz</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#69889-10G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 </td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td> Nicotiana benthamiana </td><td>tohumlar Herbalistics Pty</td><td>RA4 veya LAB</td><td>Citovsky tohum laboratuvarı stok koleksiyonundaki stoğu</td></tr><tr><td>kullanıyoruz pDONR207</td><td>Invitrogen</td> <td># 12213013</td><td></td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td><td>Ref. 15, 28</td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1</td><td>N/A</td><td></td><td>pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 yapısına dayalı olarak oluşturulmuştur (bkz. ref. 15, 28)</td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td><td>pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 yapısına dayalı olarak üretilmiştir</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#R7382-5G</td><td></td></tr><tr><td>Spektinomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>İğnesiz Şırıngalar</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>CLSM görüntüleme için Zen yazılımı</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 3.0 sürümü</td><td>Yazılım, kullanılan CLSM ile uyumlu olmalıdır</td></tr></tbody></table>

histon modifiye edici enzimler ve transkripsiyon faktörleri arasındaki etkileşimlerin in vivo floresan rezonans enerji transferi ile İncelenmesi

Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer

Gen ekspresyonunun epigenetik regülasyonu, transkripsiyonel baskı veya aktivasyon için sırasıyla heterokromatik veya ekromatik histon işaretleri üreten histon modifiye edici enzimlerden (HME'ler) sıklıkla etkilenir. HME'ler, transkripsiyon faktörleri (TF'ler) tarafından hedef kromatinlerine alınır. Bu nedenle, HME'ler ve TF'ler arasındaki doğrudan etkileşimleri tespit etmek ve karakterize etmek, işlevlerini ve özgüllüklerini daha iyi anlamak için kritik öneme sahiptir. Bu çalışmalar, canlı dokular içinde in vivo olarak gerçekleştirilirse biyolojik olarak daha alakalı olacaktır. Burada, bir bitki histon deubikitinaz ile bir bitki transkripsiyon faktörü arasındaki etkileşimleri, birbirinden <10 nm uzaklıktaki protein molekülleri arasındaki komplekslerin tespit edilmesini sağlayan floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak görselleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır. FRET tekniğinin iki varyasyonu sunulmaktadır: SE-FRET (duyarlılaştırılmış emisyon) ve AB-FRET (alıcı ağartma), burada enerji donörden alıcıya radyal olmayan bir şekilde aktarılır veya alıcının fotobeyazlatılması üzerine donör tarafından ışınımsal olarak yayılır. Hem SE-FRET hem de AB-FRET yaklaşımları, muzdaki diğer proteinler arasındaki diğer etkileşimleri keşfetmek için kolayca uyarlanabilir.

Şekil 2 , hücre çekirdeğinin aynı anda üç kanala (yani, donör GFP, alıcı mRFP ve SE-FRET) kaydedildiği bir SE-FRET deneyinin tipik sonuçlarını göstermektedir. Bu veriler, sahte renk ölçeğinde kodlanmış SE-FRET verimliliğinin görüntülerini oluşturmak için kullanıldı. Bu ölçekte, maviden kırmızıya geçiş, FRET verimliliğinde bir artışa, protein-protein yakınlığının% 0 ila% 100 arasında bir ölçüsüne karşılık gelir. Bu temsili deneyde, SE-FRET sinyali hücre çekirdeğine kaydedildi ve LSH10 ve OTLD...

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Epigenetic regulation of gene expression is commonly affected by histone modifying enzymes (HMEs) that generate heterochromatic or euchromatic histone ...

Bu yöntem, protein-protein etkileşimindeki soruları cevaplamaya yardımcı olabilir, canlı hücre içinde birbirinden 10 nanometre içinde bulunan iki proteini doğrudan tespit etmemizi sağlayacaktır. Bu tekniğin temel avantajı, basit ve çoğaltılması kolay olmasıdır. Ayrıca birçok modern laboratuvarda bulunan basit malzemeler gerektirir.Bu önlem, ilgili proteinde geçiş yoluyla yayılan herhangi bir canlı doku veya kültür hücresi ile kullanılabilir. Bu tekniği ilk kez kullanıyorsanız, önce sistemi test etmek için pozitif kontrolü ve negatif kontrolü kullanmanız önerilir. Başlamak için, Nicotiana benthamiana tohumlarını yüksek yoğunlukta ıslak toprak içeren bir tencereye ekin.Ekilen tohumları 23 santigrat dereceye ayarlanmış bir büyüme odasında tutun. Öfilin çapı 0,3 ila 0,5 santimetreye ulaştığında, fideleri daha büyük saksılara aktarın ve aynı odada aynı parametrelerle büyümelerine izin verin. Daha sonra, FRET yapılarını içeren her bir agrobakteri kolonisini, antibiyotikler ve 150 mikromolar asetosirengon ile desteklenmiş beş mililitre LB ortamında aşılayarak agroinfiltrasyon için bakteri hücreleri hazırlayın.Kültürü bir gecede 28 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 3.000 G'de santrifüj edin. Agroinfiltrasyon tamponundaki hücreleri 0.5'lik bir OD 600'e yeniden askıya alın.Çift yapı agroinfiltrasyonu için, yeniden askıya alınan hücreleri bire bir hacim oranında uygun yapıları barındıran hücrelerle birleştirin. Hücreleri 30 dakika ila bir saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Agroinfiltrasyon yapmak için, bakteri kültürünü bir mililitrelik iğnesiz bir şırıngaya yükleyin.Yavaşça ama sıkıca şırınganın nozulunu tamamen genişlemiş Nicotiana benthamiana yapraklarının abaxial tarafına bastırırken, yaprağı adaksiyal tarafta eldivenli bir parmakla tutun. Bir yaprak üzerinde dört noktaya kadar sızın, bitki başına üç yaprak ve her bakteri kültürü için iki veya üç bitki için. Agrosızmış bitkileri, 24 ila 36 saat boyunca daha önce tarif edildiği gibi aynı koşullar altında aynı büyüme odasında tutun.24 ila 36 saatlik infiltrasyondan sonra, her tarımsal sızmış yaprağı damarlar arasında iki ila dört milimetrelik küçük parçalara ayırmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Yaprak parçalarını, abeksenel yaprak yüzeyi yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine yerleştirin. Yaprak parçalarına bir damla su koyun ve kapak camıyla örtün.Hava kabarcıklarını gidermek için kapak camına hafifçe dokunun. Ardından mikroskop ve lazeri açın. Slaytı mikroskop sahne tutucusuna yerleştirin.SE-FRET parametrelerini ayarlamak için çok boyutlu alma aracını açın. Ardından, donör florokrom GFP'nin uyarılması ve emisyonu için donör kanalını 405 nanometrelik bir uyarma lazerinde ve emisyon filtresini 400 ila 597 nanometrede ayarlayın. Alıcı florokrom mRFP'nin uyarılması ve emisyonu için alıcı kanalı ve 561 nanometrelik bir uyarma lazerini ve emisyon filtresini 400 ila 597 nanometrede ayarlayın.FRET kanalını, 405 nanometre uyarma lazeri ve 597 ila 617 nanometre emisyon filtresi ile vericinin uyarılması ve alıcı florokromların emisyonu için ayarlayın. Fotobeyazlatmadan kaçınırken FRET'yi gözlemlemek için donör uyarma yoğunluğunu minimum seviyeye ayarlayın. Donörü uyarın ve alıcının beklenen floresan sinyalini içeren hücreleri tarayın.İlgilenilen floresan sinyalini içeren bölgeyi seçin. Tutturma düğmesine basarak bir SE-FRET görüntü dizisi edinin. AB-FRET parametrelerini ayarlamak için, SE-FRET için ayarlanan donör ve alıcı kanal parametrelerini kullanın, ancak FRET kanalını kapatın.Ardından, alıcı mRFP'nin fotobeyazlatılması için parametreleri ayarlamaya hazırlanın. Beyazlatmanın beş görüntüden sonra başladığından emin olun. Her alan ağartıcısı için 200 yinelemeye izin verin.% 100 lazer yoğunluğunu 561 nanometrede tutun. Beyazlatma süresini 45 saniye koruyun. 400 hertz'de 512 x 512 piksel tarama hızı sağlayın.Ağartılacak hücrenin bölgesini arayıp çizin ve deneyi başlat düğmesine basarak ağartmayı etkinleştirin. Pozitif kontrol durumunda, beş görüntüden sonra, beyazlatma başlar ve ilgi alanı yeşile döner. GFP'ninki artarken mRFP'nin yoğunluğunun azaldığını doğrulamak için ortalama YG'yi kontrol edin.Alternatif olarak, mRFP'nin ağarttığını ve GFP'nin arttığını gösteren düzeni kontrol edin. SE-FRET verilerini analiz etmek için ImageJ yazılımını kullanın. Görüntüleri açın ve yalnızca bir bağışçı yığını oluşturun.Görüntüleri sekiz bit olarak TIF dosyası olarak kaydedin. Benzer şekilde, yığını yalnızca alıcı için oluşturun, ardından birleşik bir donör ve alıcı yığını oluşturun. Ardından, SE-FRET verimliliğinin görüntülerini oluşturmak için PixFRET eklentisini kullanın.Oluşturulan yığınları açın ve spektral kanamayı çıkardıktan sonra düzeltilmiş FRET görüntülerini oluşturun. Görüntüyü sahte renkli görüntü olarak sunun. AB-FRET verilerini analiz etmek için, bu formülü kullanarak mRFP fotobeyazlatma işleminden sonra GFP emisyonundaki yüzde artış olarak yüzde AB-FRET hesaplayın.Histon deubikitinaz OTLD1'in transkripsiyon faktörü LSH10 ile spesifik protein-protein etkileşimi SE-FRET tarafından incelendi. Hücre çekirdekleri aynı anda üç kanala kaydedildi ve SE-FRET verimliliğini göstermek için bir sahte renk ölçeği oluşturuldu. Maviden kırmızıya geçiş, FRET verimliliğinde ve protein-protein yakınlığında bir artışa karşılık gelir.LSH10 ve OTLD1'in birlikte ekspresyonunu takiben SE-FRET yoğunluğu, pozitif kontrol mRFP-GFP için gözlemlenenlerle karşılaştırılabilirdi. OTLD1, mRFP ve LSH4-GFP'nin birlikte ekspresyonu veya serbest mRFP ve LSH10-GFP gibi negatif kontrollerde SE-FRET gözlenmedi. AB-FRET görüntüleri, LSH10-GFP ve OTLD1-mRFP'nin birlikte ekspresyonunun, RFP alıcısı fotobeyazlatıldıktan sonra GFP donör floresansının artmasına neden olduğunu göstermiştir.Donör floresansında benzer bir artış pozitif kontrolde gözlendi, ancak alıcı floresan inaktive edildiğinde negatif kontrollerde gözlenmedi. AB-FRET verilerinin kantitatif analizi, LSH10 ve OTLD1'i birlikte ifade ettikten sonra donör floresansında istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğunu göstermiştir. Pozitif kontrol yaklaşık% 30'luk bir yüzde AB-FRET üretirken, negatif kontroller hiç üretmedi.SE-FRET ve AB-FRET, hücre çekirdeğinde, transkripsiyon faktörü histon modifiye edici enzim komplekslerinin hücre altı lokalizasyonu ve GFP-MRFP proteinlerinin nükleositoplazmik doğası ile tutarlı bir sinyal gösterdi. Protokolü takip etmeden önce hatırlanması gereken en önemli şey, konfokal nanoskopi modeline bağlı olarak doğru donör alıcı ekspres çiftini test etmektir. Çalıştırdıktan ve yinelememizi yaptıktan sonra, sonuçları almak için yalnızca 24 ila 36 saat gerekir.Bu videoyu izledikten sonra, protein-protein etkileşimini incelemek için FRET tekniğinin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır.

investigating-interactions-between-histone-modifying-enzymes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Biz Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak) ve embriyonik kök hücreleri (ES) kromatin protein dinamiklerini izlemek için (FLIP) Photobleaching Floresan kaybı da dahil olmak üzere photobleaching yöntemleri açıklanmaktadır. Kromatin plastisite çalışma araçlarının biri olarak kabul edilir Kromatin protein dinamiği, pluripotent hücreler geliştirilmiş.

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Bu videoda, transkripsiyon faktörleri ve DNA arasındaki etkileşimi izlemeye yardımcı olan yüksek performanslı floresan anizotropisi açıklanmaktadır. Test, florofor etiketli DNA'nın moleküler rotasyonu veya anizotropisine bağlı polarizasyon derecesini ölçerek, florofor etiketli bir DNA molekülünün spesifik transkripsiyon faktörü ile etkileşimlerini izler.

Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Afinitesini Belirlemek için Floresan Anizotropisi

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Burada büyük ölçüde yüksek hassasiyet ile bağlama benzeşim denge ve çözüm belirlemek için yeni bir yöntem mevcut. Bu transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı kantitatif analiz artırır. Yönteminin otomatik floresans anizotropi ölçümlerde kontrollü bir iletim sistemi temel alır.

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Öğrenin, Nicotiana benthamiana hücrelerinde histon modifiye edici enzimler ile transkripsiyon faktörleri arasındaki protein-protein etkileşimlerini in vivo FRET tekniği ile nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem epigenetik düzenlemeyi anlamak için kritik öneme sahiptir.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi (Video) | JoVE Journal

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Daha fazla video keşfet