Name: Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Öğrenin, Tol2 transgenesis sistemini kullanarak Danio rerio embriyolarına transgenik yapıların enjeksiyonu için modüler bir protokol. Bu yöntem, gelişim biyolojisi ve FASD çalışmalarında gen fonksiyonlarını incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu makalede sunulan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri / Ulusal Alkol Kötüye Kullanımı Enstitüsü (NIH / NIAAA) R00AA023560'tan C.B.L.'ye bir hibe ile desteklenmiştir.

Bu prosedürde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, belirlenmiş IACUC protokolleri12'ye uygun olarak yetiştirildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı.
NOT: Bu çalışmada vahşi tip zebra balığı suşu AB ve bmp4st72;smad5b1100 çift mutant hattı kullanılmıştır. Bu işlemde kullanılan suyun tamamı steril ters ozmoz suyuydu. Konfokal görüntüler lazer taramalı konfokal mikroskop altında alındı. Endoderm ölçümleri ImageJ'deki ölçüm aracı kullanılarak yapıldı. Tüm istatistiksel analizler istatistiksel yazılımlar kullanılarak yapıldı.
1. Çözümlerin ve medyanın oluşturulması
<ol><li>Bakteriyel ortam: LB suyunu veya agar'ı üreticinin talimatlarına göre çözün ve otoklavlayın. Ortamı 100 mm Petri kaplarına dökmeden önce, ampisilin (50 μg / mL), kanamisin (50 μg / mL) veya bir ampisilin / kloramfenikol kombinasyonu (sırasıyla 50 μg / mL ve 30 μg / mL) ekleyin.</li>
	<li>20x embriyo ortam stoğu yapmak için, aşağıdakileri 1 L suda çözün: 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl, 2.9 g CaCl 2, 0.41 g K 2 HPO 4, 0.142 g Na 2 HPO 4 ve 4.9 g MgSO4 · 7H 2O. 0.22 μm vakum filtrasyon sistemi kullanarak stok çözeltisini filtreleyin-sterilize edin, ve 4 °C'de saklayın. NOT: Oluşan beyaz çökeltiyi yok sayın; bu medyayı etkilemeyecektir.</li>
	<li>19 L suda, 1.2 g NaHCO3'ü çözün ve çalışan embriyo ortamı çözeltisini oluşturmak için 20x embriyo ortamı stoğunun 1 L'sini ekleyin ve bu çözeltiyi 28 ° C'de tutun.</li>
	<li>% 2 fenol kırmızısı çözeltisi için, 20 mg fenol kırmızı sodyum tuzunu 1 mL RNaz içermeyen suda çözün ve oda sıcaklığında saklayın.</li>
</ol>2. Embriyo enjeksiyon kalıpları
<ol><li>Agaroz enjeksiyon plakasını yapmak için, agarozu embriyo ortamında kaynatarak son konsantrasyona% 3'lük bir konsantrasyona kadar çözün.</li>
	<li>100 mm Petri kaplarına 50 mL agaroz dökün ve agaroz hala sıvı iken, kalıbın altında kabarcık oluşumunu önlemek için enjeksiyon kalıbını agarozun içine yavaşça yerleştirin.</li>
	<li>Agaroz plakalarını soğumaya bırakın. Agaroz katı hale geldiğinde, enjeksiyon kalıbını çıkarın ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>3. Enjeksiyon pipetleri
<ol><li>Filament içeren 1,0 mm (OD) kılcal damarları, solenoid değeri 2,5 ve ısıtma elemanı 14,6 olarak ayarlanmış dikey bir pipet çektirici kullanarak iğnelere çekin. NOT: Isıtılmış herhangi bir çektirme, kılcal damarları temiz ve eşit bir şekilde iki iğneye çekerse işe yarayacaktır, ancak tutarlı enjeksiyon sonuçları için enjeksiyon iğnelerinin, zebra balığı embriyolarına enjekte edildikten sonraki 1 hafta içinde çekilmesi gerekir.<ol><li>Kılcal damarı çektiriciye yerleştirin, kelepçeyi her iki ucundan sıkın ve ardından ısıtma elemanını etkinleştirin.</li>
		<li>İki enjeksiyon iğnesi oluşturmak için kılcal damarları çekin.</li>
		<li>Kılcal damarları çektirmeden çıkarın ve iğne tutucu olarak işlev gören bir modelleme kili şeridi ile boş bir Petri kabında saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Transpozaz mRNA preparatı
<ol><li>Aşağıdakileri 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek Transpozaz içeren Tol2Kit plazmidini NotI kısıtlama endonükleazı ile doğrusallaştırın: 10 μL transpozaz plazmidi (150 ng / μL), 1,5 μL kısıtlama endonükleaz reaksiyon tamponu, 0,3 μL NotI endonükleaz.</li>
	<li>20 μL'ye kadar reaksiyonu RNaz içermeyen suyla doldurun ve ardından gece boyunca 37 ° C'de karıştırın ve sindirin.</li>
	<li>Sindirim reaksiyonuna 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL 5 M NH4OAc ve 80 μL 0 EtOH ekleyerek transpozaz sindirimini durdurun ve ardından gece boyunca -20 °C'de karıştırın ve soğutun.</li>
	<li>Çözeltiyi 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14.000x g'de santrifüj edin ve daha sonra süpernatantı aspire edin ve DNA peletini RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.</li>
	<li>Bir florometre kullanarak mikrolitre başına nanogram cinsinden doğrusal plazmid konsantrasyonunu belirleyin (ng / μL), önce RNaz içermeyen bir su boşluğunun 2 μL'sini çalıştırarak ve ardından doğrusallaştırılmış plazmidin 2 μL'sini çalıştırarak. NOT: Plazmid konsantrasyonları tipik olarak 100-200 ng/μL arasında değişmektedir</li>
	<li>Aşağıdaki bileşenleri 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde sırayla birleştirerek SP6 mRNA üretimini ayarlayın: 10 μL 2x NTP / CAP, 2 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,1-1 μg doğrusal DNA şablonu ve 2 μL SP6 enzim karışımı.</li>
	<li>20 μL'ye kadar reaksiyonu RNaz içermeyen suyla doldurun ve ardından 2 saat boyunca 37 ° C'de karıştırın ve inkübe edin.</li>
	<li>2 saat boyunca inkübe ettikten sonra, 1 μL DNaz ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika daha inkübe edin.</li>
	<li>SP6 reaksiyonunu durdurmak için, reaksiyon tüpüne 30 μL LiCl çökeltme çözeltisi ekleyin ve ardından gece boyunca -20 ° C'de karıştırın ve soğutun.</li>
	<li>mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin ve daha sonra süpernatantı aspire edin ve mRNA peletini 1 mL% 80 EtOH (RNaz içermeyen su ile seyreltilmiş) ile yıkayın.</li>
	<li>mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi 14.000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından süpernatanı aspire edin. Peletin hava ile kurumasını bekleyin.</li>
	<li>mRNA peletini 20 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın, adım 4.5'te açıklandığı gibi bir florometre kullanarak mikrolitre başına nanogram (ng / μL) cinsinden mRNA konsantrasyonunu belirleyin (en az 100 ng / μL olmalıdır), tek kullanım için tüp başına 100 ng mRNA aliquot ve -80 ° C'de saklayın. NOT: mRNA'nın bozulmadığından emin olmak için, 1.950 bps'de tek bir bandı doğrulamak için bir DNA elektroforez jeli üzerinde 2 μL mRNA hızlı bir şekilde çalıştırılabilir.</li>
</ol>5. Transgenez için giriş vektörleri oluşturmak için Multisite Gateway klonlama
NOT: Bu protokol Kwan ve ark.10'dan modifiye edilmiştir, LR reaksiyonu yarı-LR reaksiyonu olarak yazılmıştır ve toplam hacim 5 μL'dir. Yeni giriş elemanları üretmek için, 5', orta ve 3' donör vektörleri kullanan BP reaksiyonlarının10,13 kullanılması gerekir.
<ol><li>Reaksiyonu gerçekleştirmek için, p5E, pME ve p3E'nin her biri 10 fmol ve hedef vektörün (pDest) 20 fmol'ünü toplayın. NOT: Çok bölgeli LR rekombinasyonu dört farklı plazmid vektörü kullanır: zebra balığı embriyolarına enjekte edilmeye hazır Tol2 tekrarları ile çevrili benzersiz bir transgenik yapı oluşturmak için bir 5' giriş vektörü (p5E), bir orta giriş vektörü (pME), bir 3' giriş vektörü (p3E) ve bir hedef vektör (pDest).<ol><li>Plazmid kaynağından baz çiftlerindeki dört vektörün tümünün boyutunu tanımlayın (Tablo 1, Tol2Kit Wiki sayfa14 veya Addgene11; Malzeme Tablosuna bakın). NOT: Yeni vektörler için, ticari dizileme şirketleri aracılığıyla tam plazmid dizileme, bps cinsinden tam plazmid boyutunu sağlayabilir.</li>
		<li>Adım 4.5'te açıklandığı gibi bir florometre kullanarak mikrolitre (ng / μL) başına nanogram cinsinden dört vektörün konsantrasyonunu belirleyin.</li>
		<li>DNA'nın ağırlığını 660 g / mol ve plazmid boyutunu (bps cinsinden) kullanarak, 10 fmol (giriş vektörleri) veya 20 fmol'e (hedef vektör) ulaşmak için gereken toplam plazmid nanogramını (ng) hesaplayın. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOT: Colorado Üniversitesi, Anschutz Tıp Kampüsü'ndeki Mosimann laboratuvarı, LR reaksiyonu15'te ihtiyaç duyulan vektörlerin ihtiyaç duyulan plazmid miktarını (ng cinsinden) ve hacmini (μL cinsinden) hesaplamak için serbestçe kullanılabilen bir elektronik tablo oluşturmuştur.</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıda açıklanan sox17 :EGFPCAAX yapısını oluşturmak için aşağıdaki vektörleri kullanın: zebra balığı sox17 promotörünü içeren ve16 boyutunda 6.918 bp olan bir p5E vektörü; 10 boyutunda 3.345 bp olan prenylated EGFP'yi içeren bir pME vektörü; SV40 geç poli A sinyal dizisini içeren bir p3E vektörü,boyut 10'da 2.838 bp'dir; ve10 boyutunda 5.883 bp olan pDest.</li>
	<li>Adım 5.1.2'de belirlenen plazmid konsantrasyonunu ve her vektör için nanogram (ng) cinsinden miktarı (adım 5.1.3) kullanarak, 10 fmol (giriş vektörleri) veya 20 fmol'e (hedef vektör) ulaşmak için gereken her plazmidin toplam mikrolitresini (μL) hesaplayın ve ardından bunu 5 μL yarı LR reaksiyonlarında kullanılmak üzere ikiye bölün (aşağıda listelenen tüm değerler Tablo 2'de listelenmiştir). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>10 fmol p5E-sox17 üretmek için 45.66 ng (140.3 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.65 μL elde etmek için steril suyla 4 faktörü ile seyreltin.</li>
		<li>10 fmol pME-EGFPCAAX üretmek için 22.08 ng (213.5 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.52 μL elde etmek için steril suyla 10 faktörü ile seyreltin.</li>
		<li>10 fmol p3E-poli A üretmek için, 15.73 ng (276.1 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.57 μL elde etmek için steril suyla 20 kat seyreltin.</li>
		<li>Hedef vektörün 20 fmol'ü için, 77.66 ng pDest (307.3 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 1.63 μL elde etmek için steril suyla 5 faktörü ile seyreltin.</li>
	</ol></li>
	<li>5 μL yarı-LR reaksiyonu kurmak için, adım 5.3'te belirlenen p5E, pME, p3E ve pDest hacimlerini 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin ve ardından toplam 4 μL reaksiyon hacmine ulaşmak için steril su ekleyin.</li>
	<li>Doğru karıştırmayı sağlamak için LR enzim karışımını her biri 1 dakika boyunca 2 kez kuvvetlice vorteksleyin ve ardından reaksiyona 1 μL ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Gece boyunca 25 ° C'de inkübe edin (16+ saat).</li>
	<li>LR reaksiyonunu 0,5 μL proteinaz K (2 μg/μL) ekleyerek durdurun, 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından oda sıcaklığına soğutun.</li>
	<li>3-4 μL plazmidi, plazmidi ekleyerek ve hücrelerin 25-30 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin vererek çözülmüş, kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün.</li>
	<li>Hücreler buz üzerinde otururken, iki LB-ampisilin agar plakasını oda sıcaklığına ısıtın.</li>
	<li>42°C'lik bir su banyosundaki hücreleri tam olarak 30 sn boyunca ısıl şokla geçirin.</li>
	<li>Isı şokundan sonra, hücrelere 250 μL antibiyotiksiz, zengin sıvı ortam ekleyin ve 1.5 saat boyunca 37 ° C'de çalkalayarak inkübe edin.</li>
	<li>Bir ampisilin plakasına 300 μL bakteri yayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi sabah, kolonileri berrak ve opak iki fenotipin varlığı açısından tarayın, berrak kolonileri (Kwan ve ark.10'da açıklandığı gibi) birer birer seçin, sıvı kültürü aşılayın ve ardından gece boyunca 37 ° C'de sallayın. NOT: Berrak koloniler neredeyse her zaman doğru LR kolonisini içerir (zamanın %&gt;85'i).</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir kit kullanarak, her sıvı kültüründe bir plazmid hazırlığı yapın ve LR ağ geçidi reaksiyonunun düzgün çalıştığını gösteren transgenik yapının uygun boyutunu doğrulamak için her plazmidi tanısal olarak sindirin.</li>
	<li>Plazmidin 0.5-1 μL'sini kullanarak 5.4-5.12 adımlarında açıklandığı gibi standart bakteriyel transformasyon protokolünü kullanarak doğru transgenik yapıları yeniden dönüştürün ve sadece 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Kolonileri yeniden çizin ve her birinin adım 5.14'teki gibi LR transgenik yapısına sahip olduğunu onaylayın.</li>
	<li>Adım 4.5'te açıklandığı gibi plazmid konsantrasyonunu belirleyin (embriyo enjeksiyonu için en az 150 ng / μL gereklidir).</li>
</ol>6. Transgenin embriyolara enjeksiyonu
<ol><li>Tek kullanımlık bir transpozaz mRNA örneğini ve Tol2 transgenik yapısını buz üzerinde çözün ve bir agaroz enjeksiyon plakasını oda sıcaklığına önceden uyarın.</li>
	<li>Aşağıdakileri buz üzerinde birleştirin: 150 ng plazmid, 100 ng transpozaz mRNA ve% 2 fenol kırmızısı (0.3 μL). Ardından, hacmi 3 μL'ye çıkarmak için RNA'sız su ekleyin.</li>
	<li>Transfer pipetleri kullanarak bir hücre aşaması embriyolarını, agar'ı tamamen kaplayan EM ile doldurulmuş enjeksiyon plakasına (adım 2'de tarif edilmiştir) aktarın ve ardından enjeksiyon plakasının yuvası başına yaklaşık 50-75 embriyoyu hafifçe bastırın.</li>
	<li>mRNA/plazmid/fenol kırmızı karışımını kılcal enjeksiyon iğnesinin açık ucuna ekleyin, kılcal iğneyi enjeksiyon teçhizatı armatürüne yerleştirin ve enjeksiyon teçhizatını açın. NOT: Enjeksiyon teçhizatı, aktive edildiğinde mRNA/plazmid/fenol kırmızı karışımının istenen hacmini (adım 6.5'te açıklanmıştır) embriyoya atmak için hava gibi sıkıştırılmış gaz kullanır.</li>
	<li>Kılcal iğneyi enjeksiyon plakasının EM'sine indirin ve enjeksiyon teçhizatı tarafından sadece az miktarda mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımının pompalanmasına izin vermek için forseps kullanarak ucu kırın.</li>
	<li>Embriyoları, mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımının küçük bir 3 nL bolusu ile embriyonun hücre gövdesine enjekte edin. NOT: 3 nL'lik bir bolus, yedi bolusun teorik olarak embriyonun orta çizgisi boyunca eşit olarak sığabileceği bir mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımı hacmidir.</li>
	<li>Embriyoları enjekte etmeyi bitirdiğinizde, yavaşça yuvadan dışarı atarak enjeksiyon plakasından çıkarın ve taze EM (yaklaşık 40 mL) ile 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın ve daha sonra embriyoların gelişmesine izin vermek için 28.5 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>7. Transgenik yerleştirme için embriyoların taranması
<ol><li>Floresan proteinlerinin ekspresyonu için, floresan transgeninin eksprese edilmesi gereken uygun gelişim aşamasını seçin ve floresan diseksiyon mikroskobu altında floresan varlığını tarayın. NOT: Bu embriyolar ifadelerinde mozaik olacak ve transgenik yapının genomik bir yerleşimini gösterecektir.</li>
	<li>Floresan olmayan transgenleri tarayarak, cmlc2 geni için kardiyak spesifik promotör tarafından tahrik edilen GFP veya farklı hedef vektörlerde bulunan αcyrstallin'in lense özgü promotörü tarafından tahrik edilen mCherry gibi floresan olmayan transgenleri (adım 7.1'de açıklandığı gibi) tarayarak tarayın.</li>
	<li>Transgenik yerleştirme için pozitif embriyoların yetişkin zebra balığı aşamalarına tamamen gelişmesine izin verin.</li>
	<li>Potansiyel transgenik balıklar üreme çağına ulaştığında, vahşi tip zebra balıklarına yetiştirerek hem germline iletimi hem de transgen ekspresyonu için ayrı ayrı tarayın.</li>
	<li>Embriyoları normal olarak gelişen ve en güçlü ve en uygun transgen ekspresyonunu veren yetişkinler, gelecekteki çalışmalar ve analizler için benzersiz transgenik zebra balığı çizgileri olarak tutulur. NOT: Transgenik yapıların genomik yerleştirilmesi için taramaya alternatif bir yaklaşım olarak, vahşi tip DNA'yı değil, sadece transgenik yapıyı güçlendiren PCR primerleri tasarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li>
<li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li>
<li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders%3A+Characteristics%2C+complications%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Mental+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li>
<li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation%2C+diagnosis%2C+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gene-alcohol+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li>
<li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460(2021).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).</li>
<li>Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017).</li>
<li>The Tol2Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page">http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</a> (2007).</li>
<li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+gateway+calculations%3A+Excel+spreadsheet%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li>
<li>Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+%CE%B2+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li>
<li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharyngeal+pouches+and+clefts%3A+Development%2C+evolution%2C+structure+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li>
<li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li>
<li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology%3A+Historical+review%2C+recent+advances%2C+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).</li>
<li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model%3A+Transgenic+and+omics+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Zebra balığı, etanol maruziyetinin gelişim ve hastalık durumları üzerindeki etkisini incelemek için idealdir 7,8. Zebra balığı, çok sayıda yarı saydam, harici olarak döllenmiş, genetik olarak izlenebilir embriyolar üretir, bu da birden fazla çevresel bağlamda aynı anda birkaç transgen etiketli doku ve hücre tipinin canlı görüntülenmesine izin verir 19,20. Bu güçlü yönler, insanlarla güçlü gelişimsel genet...

Prenatal etanol maruziyeti, fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD) olarak adlandırılan yapısal eksikliklerin ve bilişsel bozuklukların sürekliliğine yol açar1,2,3,4. Birden fazla faktör arasındaki karmaşık ilişkiler, insanlarda FASD'nin etiyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırmaktadır. Bu zorluğu çözmek için çok çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır. Bu modellerde bulunan biyolojik ve deneysel araçlar, etanol teratojenitesinin mekanik temeli hakkındaki anlayışımızı geliştirmede çok önemli olduğunu kanıtlamıştır ve bu model sistemlerinden elde edilen sonuçlar, insan etanol çalışmalarında bulunanlarla oldukça tutarlıdır 5,6. Bunlar arasında, zebra balığı, kısmen dış döllenmeleri, yüksek doğurganlıkları, genetik izlenebilirlikleri ve yarı saydam embriyoları nedeniyle etanol teratogenezi 7,8'i incelemek için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bu güçlü yönler, zebra balığını, transgenik zebra balığı hatlarını kullanarak FASD'nin gerçek zamanlı canlı görüntüleme çalışmaları için ideal hale getirmek için bir araya gelir.
Transgenik zebra balığı, embriyonik gelişimin birçok yönünü incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır9. Bununla birlikte, transgenik yapılar ve müteakip transgenik çizgiler oluşturmak son derece zor olabilir. Standart bir transgen, transgeni ve bir poli A sinyalini veya "kuyruğunu" sürmek için aktif bir promotör eleman gerektirir, bunların hepsi genel vektör bakımı için kararlı bir bakteriyel vektördedir. Çok bileşenli bir transgenik yapının geleneksel üretimi, çok zaman alıcı alt klonlama adımları gerektirir10. Gibson montajı gibi PCR tabanlı yaklaşımlar, alt klonlama ile ilgili bazı sorunları atlatabilir. Bununla birlikte, her benzersiz transgenik yapı10'un üretimi için benzersiz astarlar tasarlanmalı ve test edilmelidir. Transgen yapımının ötesinde, genomik entegrasyon, germline iletimi ve uygun transgen entegrasyonu için tarama da zor olmuştur. Burada, transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini (Tol2Kit) kullanmak için bir protokol açıklıyoruz10,11. Bu modüler sistem, sürekli genişleyen "giriş" ve "hedef" vektörleri kütüphanesinden hızlı bir şekilde çoklu transgenik yapılar oluşturmak için çok bölgeli Ağ Geçidi klonlamasını kullanır. Entegre Tol2 transpoze edilebilir elementler, transgenez oranını büyük ölçüde artırarak, çoklu transgenlerin hızlı bir şekilde oluşturulmasına ve genomik entegrasyonuna izin verir. Bu sistemi kullanarak, bir endoderm transgenik zebra balığı hattının oluşturulmasının, FASD'nin altında yatan dokuya özgü yapısal kusurları incelemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Nihayetinde, bu protokolde, modüler kurulumun ve transgenik yapıların inşasının zebra balığı tabanlı FASD araştırmalarına büyük ölçüde yardımcı olacağını gösteriyoruz.

<table><tbody><tr><td>Addgene Tol2 araç kutusu</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hava</td><td></td><td></td><td>Doğrudan üniversite tarafından sağlanır</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borozil 1,0 mm Dış Çap x 0,75 mm İç Çap Kılcal</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab Donör Plazmid Hazırlık</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Düşük EEO/Çok Amaçlı/Moleküler Biyoloji Sınıfı Agaroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Klonaz II Plus Enzim</td><td>Fisher Scientific</td><td>12538200</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat (Heptahidrat)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Pipet tutucu</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü 0.5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpü 1.5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet uçları 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet uçları 1000 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet uçları 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon Kiti</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2 Hesaplama Çalışma Sayfası</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektrofotometre</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları 100 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Kırmızı sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Mikropipet</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Mikropipet</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Mikropipet</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat (Dibazik)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Basınç Enjektörü</td><td>Uygulamalı Bilimsel Enstrümantasyon</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat (Dibazik)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup .22 & mikro; M Vakum Filtrasyon Sistemi&nbsp;</td><td>Millipore SCGPU11RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tol2 Wiki Sayfası</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Dikey Pipetleyici Çektirmesi</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Zebra balığı mikroenjeksiyon kalıbı</td><td>Uyarlanabilir Bilim Araçları</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

zebra balığı tol2 sistemi: modüler ve esnek ağ geçidi tabanlı transgenez yaklaşımı

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD), prenatal etanol maruziyetine bağlı olarak ortaya çıkan oldukça değişken yapısal bozukluklar ve bilişsel bozukluklar ile karakterizedir. FASD'nin karmaşık patolojisi nedeniyle, hayvan modellerinin etanol kaynaklı gelişimsel kusurlar hakkındaki mevcut anlayışımız için kritik olduğu kanıtlanmıştır. Zebra balığının, zebra balığı ve insanlar arasındaki hem genetiğin hem de gelişimin yüksek derecede korunması nedeniyle etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için güçlü bir model olduğu kanıtlanmıştır. Model bir sistem olarak, zebra balığı, genetik olarak izlenebilir ve yarı saydam olan çok sayıda harici olarak döllenmiş embriyo da dahil olmak üzere, onları gelişimsel çalışmalar için ideal kılan birçok özelliğe sahiptir. Bu, araştırmacıların çoklu genetik bağlamlarda etanol maruziyetinin zamanlamasını ve dozajını hassas bir şekilde kontrol etmelerini sağlar. Zebra balığında bulunan önemli bir genetik araç transgenezdir. Bununla birlikte, transgenik yapılar oluşturmak ve transgenik çizgiler oluşturmak karmaşık ve zor olabilir. Bu sorunu ele almak için, zebra balığı araştırmacıları transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini kurdular. Bu modüler sistem, eksiksiz Tol2 transpozon tabanlı transgenik yapıların hızlı montajı için çok bölgeli bir Ağ Geçidi klonlama yaklaşımı kullanır. Burada, esnek Tol2 sistem araç kutusunu ve zebra balığı transgenezi için hazır transgenik yapılar oluşturmak için bir protokolü ve bunların etanol çalışmalarında kullanımını açıklıyoruz.

Transgenik yapıları oluşturmak için Tol2 transgenez sistemini kullandık. Gen promotör/arttırıcı elementleri tutan p5E, promotör/arttırıcı elementler tarafından ifade edilecek geni tutan pME ve en azından poliA kuyruğunu tutan p3E dahil olmak üzere üç giriş vektörü, çok bölgeli ağ geçidi LR klonlaması yoluyla transgenik yapıyı oluşturmak için kullanıldı. Hedef vektör pDest, zebra balığı embriyolarında transgenik yapının genomik yerleştirilmesi için Tol2 tekrarlarını sağlar ve bakteri büyümesi için gerekli tüm gen...

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Transgenik zebra balığı, embriyo gelişimini anlamamız için kritik öneme sahip olduğunu kanıtlamıştır. Tol2 sistemi, araştırmacıların FASD çalışmaları için hızlı ve sistematik olarak birden fazla transgenik zebra balığı üretmelerini sağlayan çok yönlü bir araçtır. Modüler tasarım ve yeni kit bileşenleri üretme kolaylığı, Tol2 sistemini, kitin herhangi bir bileşenini yeniden tasarlamak zorunda kalmadan yeni transgenikler üretmek için çok yönlü bir araç haline getirir.Bu tekniği ilk kez uygulayan araştırmacılara tavsiyem, transgenik yapıların üretilmesi ve enjekte edilmesinin hassasiyeti konusunda eğitim almak için birkaç deneme çalışması yapmalarıdır. Başlamak için, transpozaz içeren Tol2 kiti plazmidini, 10 mikrolitre transpozaz plazmidi, 1.5 mikrolitre kısıtlama endonükleaz reaksiyon tamponu ve 0.3 mikrolitre sıfır bir endonükleazı 500 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek bir sıfır kısıtlama endonükleazı ile doğrusallaştırın. 20 mikrolitreye kadar reaksiyonu RNAse içermeyen suyla doldurun.Gece boyunca 37 santigrat derecede karıştırın ve sindirin. Ertesi gün, reaksiyon karışımına bir mikrolitre 0.5 molar EDTA, iki mikrolitre beş molar amonyum asetat ve 80 mikrolitre% 100 etanol ekleyerek sindirimi durdurun. Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede karıştırın ve soğutun.Ertesi gün, DNA peletini RNAse içermeyen suda yeniden askıya almadan önce süpernatantı santrifüj edin ve aspire edin. Daha sonra, numunenin iki mikrolitresini çalıştırarak bir florometre üzerinde mikrolitre başına nanogram cinsinden doğrusal plazmid konsantrasyonunu belirleyin. SP6 mRNA üretimini, 10 mikrolitre 2X NTP / CAP, iki mikrolitre 10X reaksiyon tamponu, 0.1 ila bir mikrogram doğrusal DNA şablonunu iki mikrolitre SP6 enzim karışımında 500 mikrolitrelik bir tüpte birleştirerek ayarlayın.20 mikrolitreye kadar reaksiyonu RNAse içermeyen suyla doldurun ve 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce karıştırın. İki saat sonra, bir mikrolitre DNAse ekleyin, iyice karıştırın ve 15 dakika daha inkübe edin. 30 mikrolitre lityum klorür çökeltme çözeltisi ekleyerek reaksiyonu durdurun.Gece boyunca eksi 20 santigrat derecede karıştırın ve soğutun. Ertesi gün, mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi santrifüj edin ve peleti bir mililitre% 80 etanol ile yıkamadan önce süpernatantı aspire edin. Peletin havayla kurutulması ve 20 mikrolitre RNAse içermeyen suda tekrar askıya alınması.Bir florometre kullanarak mRNA konsantrasyonunu belirleyin, ardından tek kullanım için tüp başına 100 nanogram mRNA'yı aliquot edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Reaksiyonu gerçekleştirmek için, P5E, PME ve P3E'nin her biri 10 femtomol ve hedef vektör PDEST'in 20 femtomolünü toplayın. Plazmid kaynağından dört vektörün ve baz çiftinin boyutunu tanımlayın.Dört vektörün konsantrasyonunu belirledikten sonra, DNA'nın ağırlığını mol başına 660 gram ve plazmid boyutu ve baz çiftleri olarak kullanarak, giriş vektörleri için 10 femtomol'e veya hedef vektör için 20 femtomol'e ulaşmak için gereken toplam plazmid nanogramlarını hesaplayın. Ardından, makalede açıklanan bileşenleri kullanarak sox17:EGFP-CAAX yapısını oluşturun. Plazmid konsantrasyonunu kullanarak, 10 femtomol veya 20 femtoole ulaşmak için gereken her plazmidin toplam mikrolitresini hesaplayın ve ardından beş mikrolitre yarım LR reaksiyonunda kullanılmak üzere bunu ikiye bölün.10 femtomol P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) ve 20 femtomol hedef vektör üretin. P5E, PME, P3E ve PDEST hacimlerini 500 mikrolitrelik bir tüpte birleştirerek beş mikrolitre yarım LR reaksiyonu ayarlayın. Daha sonra hacmi dört mikrolitre yapmak için steril su ekleyin.LR enzimini vorteks, reaksiyona bir mikrolitre eklemeden önce her biri bir dakika boyunca iki kez karıştırın ve 25 santigrat derecede inkübe etmeden önce iyice karıştırın. Ertesi gün, 0.5 mikrolitre proteinaz K.Incubate'de 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca inkübe ederek LR reaksiyonunu durdurun ve ardından oda sıcaklığına soğutun. Daha sonra, plazmidin üç ila dört mikrolitresini, plazmidi ekleyerek ve hücrelerin 25 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin vererek çözülmüş kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün.Daha sonra ısı, hücreleri 42 santigrat derecelik bir su banyosunda 30 saniye boyunca şoklar. Isı şokundan sonra, hücrelere 250 mikrolitre antibiyotiksiz zengin sıvı ortam ekleyin ve 1,5 saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Bir ampisilin Luria-Bertani plakasına 300 mikrolitre bakteri süspansiyonu yayın ve gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, kolonileri iki fenotipin varlığı açısından tarayın: açık ve opak. Berrak kolonileri birer birer seçin, sıvı kültürü aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede sallayın. 150 nanogram plazmid, 100 nanogram transpozaz mRNA ve% 2 fenol kırmızısını buz üzerinde birleştirin.Daha sonra hacmi üç mikrolitre yapmak için RNA'sız su ekleyin. Transfer pipetleri kullanarak bir hücre aşaması embriyosunu, agar'ı tamamen kaplayan EM ile doldurulmuş enjeksiyon plakasına aktarın ve ardından enjeksiyon plakasının yuvası başına yaklaşık 50 ila 75 embriyoyu hafifçe bastırın. mRNA plazmid fenol kırmızı karışımını kılcal enjeksiyon iğnesinin açık ucuna ekleyin.Kılcal iğneyi enjeksiyon teçhizatı armatürüne yerleştirin ve enjeksiyon makinesini açın. İğneyi enjeksiyon plakasına indirin ve enjeksiyon teçhizatı tarafından sadece az miktarda karışımın pompalanmasına izin vermek için forseps kullanarak ucu kırın. Embriyolara, mRNA plazmid fenol kırmızı karışımının üç nanolitrelik bir bolusu ile embriyonun hücre gövdesine enjekte edin.İşiniz bittiğinde, embriyoları yavaşça yuvadan dışarı atarak enjeksiyon plakasından çıkarın ve pipetleyerek taze EM ile 100 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. 28.5 santigrat derecede inkübe edin. Floresan transgen ekspresyonu için uygun gelişim aşamasını seçin ve floresan diseksiyon mikroskobu altında tarayın. Cmlc2 geni için kardiyak spesifik promotör tarafından tahrik edilen GFP gibi floresan transgenik belirteçleri tarayarak floresan olmayan transgenleri tarayın.Transgenik yerleştirme için pozitif embriyolar yetişkinlere geliştiğinde ve üreme yaşına ulaştığında, onları vahşi tip zebra balıklarına yetiştirerek germline iletimi ve transgen ekspresyonu için ayrı ayrı tarayın. LR rekombinasyonunun dönüşümünden elde edilen örnek bakteri kolonileri gösterilmiştir. Berrak koloniler zamanın %85'inden fazlasında doğru bir LR rekombinasyon ürünü içerirken, opak koloniler hiçbir zaman doğru bir rekombinasyon ürünü içermemiştir.LR rekombinasyon ürünlerinin dönüşümünden üç koloninin tanısal sindirimi, tek opak koloninin herhangi bir plazmid içermediğini, iki berrak koloninin ise 9.544 baz çiftinde tek bir bant içerdiğini gösterdi. Transpozaz mRNA 1.950 baz çiftinde burada gösterilmiştir. Enjekte edilen embriyoların %75'inde mozaik endoderm EGFP-CAAX ekspresyonu gözlendi.Gelişmekte olan kalpte Cmlc2 EGFP'nin transgenik belirteç ekspresyonu döllenmeden 24 saat sonra gözlendi. Yetişkin zebra balığı, endoderm EGFP-CAAX ile tamamen etiketlenmiş sox17: EGFP-CAAX tarafından üretilen floresan embriyoların germline iletimine sahipti. Kontrol ve etanol ile tedavi edilen vahşi tip BMP mutant embriyolarında endodermin hem anterior-posterior uzunluğu hem de her bir poşetin bir ila beş poşetten dorsal-ventral uzunluğu ölçüldü.Endodermin toplam uzunluğu genotip veya tedaviden etkilenmedi. Bununla birlikte, bir ve üçüncü torbalar, tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip embriyolar arasındaki kese uzunluğunda önemli artışlar gösterdi, ancak tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş BMP mutantları arasındaki uzunlukta önemli azalmalar gösterdi. Poşet iki, sırasıyla işlenmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip ve BMP mutant grupları arasında kese boyutunda önemli artışlar gösterdi.Bu prosedürü denerken, Tol2 sisteminin pipetlenmesi ve seyreltilmesinde ve embriyo enjeksiyonu sırasında hücre gövdesine vurulmasında hassas olmak çok önemlidir.

the-zebrafish-tol2-system-modular-flexible-gateway-based-transgenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz, gelişimsel olarak düzenlenir genleri potansiyel artırıcı unsurları bulma ve mozaik zebrafish transgenesis fonksiyonu değerlendirmede bizim yaklaşımımız göstermektedir.

Mozaik Zebra balığı Transgenesis Enhancer Diziler değerlendirilmesi için

Bu videoda, floresan voltaj göstergesini kodlayan transpozaz mRNA'sı ve Tol2 transpozon yapısını içeren Tol2 transpozon sisteminin birlikte enjeksiyonunu takiben bir floresan voltaj gösterge proteinini yapısal olarak ifade eden kararlı bir zebra balığı transgenik hattı oluşturmak için bir prosedür gösteriyoruz.

Tol2 Transpozon Aracılı Zebra Balığı Transgenezi: Tol2 Sisteminin Döllenmiş Zebra Balığı Embriyolarına Koenjeksiyonunu Takiben Transgenik Zebra Balığı Oluşturma Prosedürü

Bu protokol Zebrafish ikincil muhabir olarak birincil ve GFP raportör / RFP olarak Gal4-VP16 kullanılarak gen trap girmeyle mutagenez yöntemini anlatır. Yaklaşık bir yüksek ifade F0 balık verim gen trap döl GFP ve RFP co-ifade on. Tarama prosedürü kolayca sokma mutajenez ekranını performans laboratuvar boyutuna uyum ölçekli olabilir.

Zebra balığı Gal4 kullanma Gene Yakalama

Üreme ve in vivo araştırmalara uygun bir Zebra balığı tesisi kolay ve ekonomik bir şekilde inşa edilmiştir. Bakım minimumdur. Bu tesis, öğrenci katılımı ve bağımsız araştırma için idealdir.

Bir Ekonomik ve Kolay oluşturun Zebra balığı Tesisi İnşaatı

Bu çalışmanın amacı, mozaik transgenez stratejisinin, in vivo olarak tümör başlangıcı ve ilerlemesinde çoklu onkogenlerin göreceli katkılarını hızlı ve verimli bir şekilde değerlendirmek için zebra balıklarında nasıl kullanılabileceğini göstermektir.

Tümör Patogenezinde Aday Kooperatif Genlerin Fonksiyonel Genomik Analizi Mozaik Zebra balığı Transgenesis

Burada, yetişkin yenilenen zebra balığı kuyruk yüzgecinde dokuya özgü gen ekspresyonu elde etmek için TetON sistemini kullanmak için iş akışını özetliyoruz.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Evrimsel modeli sistem Astyanax mexicanusgenler manipülasyon yaklaşımları açıklar. Üç farklı teknikler açıklanmıştır: Tol2-aracılı transgenesis, CRISPR/Cas9 ve nakavt morpholinos kullanarak ifade kullanarak genom hedeflenen manipülasyon. Bu araçları doğrudan soruşturma yüzey ve mağaralarda yaşayan biçimler arasında varyasyon yatan genlerin kolaylaştıracaktır.

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Öğrenin, Tol2 transgenesis sistemini kullanarak Danio rerio embriyolarına transgenik yapıların enjeksiyonu için modüler bir protokol. Bu yöntem, gelişim biyolojisi ve FASD çalışmalarında gen fonksiyonlarını incelemeyi kolaylaştırır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Daha fazla video keşfet