Name: Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Öğrenin, Danio rerio'da F0 CRISPR enjekte edilmiş sperm kullanarak germline düzenlemelerini hızlı ve maliyet etkin bir şekilde nasıl tarayacağınızı. PCR, restriksiyon enzimleri ve jel elektroforezi teknikleriyle bu yöntem, dizileme tabanlı yaklaşımlara erişilebilir bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Anna Hindes'e, sıcak atış yöntemini kullanarak kaliteli sperm genomik DNA'sı elde etme konusundaki ilk çabaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından Ödül kapsamında finanse edilmiştir (R01AR072009 to R.S.G.).

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda yer alan kılavuzlar doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Protokol, Austin Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ndeki Teksas Üniversitesi (AUP-2021-00254) tarafından onaylandı.
1. CRISPR mutagenezi için sgRNA'nın tasarlanması
<ol><li>Hedeflenen lokusları içeren ekzon dizisini elde edin.</li>
	<li>Cas endonükleazına özgü bir protospacer bitişik motif (PAM) bölgesi ile sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) tasarlayın.<ol><li>Bir donör yapısını birlikte enjekte ediyorsanız, sgRNA'yı istenen düzenlemelere mümkün olduğunca yakın tahmin edilen bir kesim bölgesine sahip olacak şekilde tasarlayın. NOT: APE, Cas9 sgRNA siteleri11'i bulmak için bir araca sahip ücretsiz bir yazılımdır. Alternatif olarak, Cas9 ve diğer Cas endonükleazları12'nin farklı PAM bölgelerini dikkate alan sgRNA'ları tasarlamak için çevrimiçi bir arayüz sunan CHOPCHOP gibi araçlar kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Tasarlanan CRISPR/Cas kesim bölgesini çevreleyen bölgeyi büyütmek için ileri ve geri astarlar tasarlayın. PCR ürünü, protokolün ilerleyen kısımlarında bir jel üzerindeki küçük indelleri çözebilmek için yaklaşık 200-400 baz çifti (bp) uzunluğunda olmalıdır. NOT: CHOPCHOP11 , çıkardığı her sgRNA için otomatik olarak primerler tasarlar.</li>
	<li>İsteğe bağlı: İstenilen düzenleme(ler)le bir DNA donör yapısı tasarlayın.<ol><li>İstenilen mutasyonun lokuslarını içeren ekzonun genomik dizisini elde edin. NOT: İntronik sekanslar bireyler arasında değişebilir, bu nedenle intronik sekansların donör yapısına dahil edilmesinden kaçınmak en iyisidir, çünkü bu homolojiye bağlı onarım yoluna müdahale edebilir.</li>
		<li>Belirli bir amino asit değişikliği isteniyorsa, spesifik kodonu buna göre değiştirin. NOT: Bu değişiklikleri yaparken, kodon frekansının farkında olun. Mümkünse, yüksek kullanımlı bir kodon seçin.</li>
		<li>Donör yapının CRISPR / Cas sindirimini önlemek için, (i) PAM'ı bozan ve / veya (ii) sgRNA dizisini bozan, PAM bölgesine daha yakın eşanlamlı olmayan değişiklikler yapmaya daha fazla tercih edilen ek eşanlamlı mutasyonlar yapın.</li>
		<li>Vahşi tip dizinin tahmin edilen PCR ürününde benzersiz kısıtlama sitelerini (yalnızca bir kez meydana gelenler) bulmak için bir kısıtlama sitesi bulucu kullanın (APE11 de bu özelliğe sahiptir).<ol><li>Donör yapısının başarılı entegrasyonunu yansıtan tahmin edilen PCR ürünü için bu işlemi tekrarlayın.</li>
			<li>Yalnızca düzenlenen dizide bulunan bir kısıtlama sitesi bulmak için vahşi tür ve bağışçı ile tümleşik diziler arasındaki kısıtlama sitelerinin listesini karşılaştırın.</li>
			<li>Benzersiz bir kısıtlama bölgesi bulunmazsa, bu sağlanana kadar donör yapısında eşanlamlı değişiklikler yapmaya devam edin. NOT: Mümkünse, donör yapısına sgRNA bağlanmasını bozacak eşanlamlı mutasyonlar yapmaya devam edin.</li>
		</ol></li>
		<li>Donör dizisini, tahmin edilen CRISPR / Cas kesim bölgesini çevreleyen en az 20 bp homoloji ile yönetilebilir bir boyuta (50-100 bp) kırpın ve mümkünse düzenleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tasarlanan sgRNA ve / veya DNA donör oligonükleotidlerinin yanı sıra genotipleme için gerekli primerleri elde edin. NOT: DNA donör oligonükleotidlerinin nükleazlar tarafından sindirimini önlemek için, DNA oligonükleotidlerinin 5' ve 3' uçlarındaki ilk üç fosfat bağının fosforothioat ile değiştirilmesi önerilir.</li>
	<li>Enjeksiyon karışımının 1 nL'sini tek hücreli aşama embriyolarına enjekte edin. Tipik olarak, standart bir enjeksiyon karışımı aşağıdakileri içerir: 1 μL 25 μM lokusa özgü sgRNA 1 μL 25 μM Cas9 endonükleaz İsteğe bağlı: 1 μL 3 μM DNA donör yapısı<ol><li>0,1 M RNaz içermeyen KCl ile toplam hacmi 5 μL'ye getirin.</li>
	</ol></li>
	<li>F0 enjekte edilen bireylerin cinsel olarak olgun yetişkinlere dönüşmesine izin verin. Kalan protokol, F0 enjekte edilen erkeklerin germline düzenlemeleri için taranmasına odaklanmaktadır.</li>
</ol>2. Islah tanklarının kurulması
<ol><li>F0 erkekleri ve dişileri arasında bölücüler ile üreme tankları kurarak çiftleşme için Asal F0 erkekleri.<ol><li>Gerekli üreme tanklarının sayısını en aza indirmek için, her tankta iki dişinin karşısında üç erkek ayarlayın.<ol><li>Sperm toplanmasından sonra etkili bir şekilde taranabilecek ve birey olarak barındırılabilecek kadar F0 erkeği ayarlayın. Bu işlem sırasında gametleri toplanmayacağından dişilerin genotipi önemli değildir.</li>
		</ol></li>
		<li>Dişilerin karşısında vahşi tip erkeklerden oluşan bir üreme tankı kurun. Vahşi tip sperm, prosedürün ilerleyen aşamalarında sonuçların yorumlanması için bir kontrol görevi görecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hazırlanan üreme tanklarını gece boyunca inkübe edin.</li>
</ol>3. Sperm toplama işlemi için materyallerin hazırlanması
<ol><li>Küçük bir cam kabı doldurmak için yeterli anestezi çözeltisi (balık suyunda% 0.016 trikain-HCl) hazırlayın.</li>
	<li>40 μL 50 mM NaOH'yi 0,2 mL PCR tüplerine dağıtın. Toplanacak her sperm örneği için bir tüp hazırlayın. Buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>İşlem sırasında örneklenecek her balık için ayrı ayrı 0.8 L tankları hazırlayın. Bu tanklar, genotipleme tamamlanana kadar örneklenen balıkları barındıracaktır. NOT: Bu, bu protokolde etkili bir şekilde taranabilecek balık sayısını sınırlayan birincil faktördür. Genotipleme tamamlanana kadar örneklenen bireyleri barındırmak için yeterli alan sağlayın.</li>
	<li>1 inç x 1 inçlik bir süngeri (prosedür sırasında erkek zebra balığı ventral tarafını yukarıda tutmak için sığ, oval şekilli bir divot ile kesilmiş) balık suyunda nemlendirin ve fazla sıvıyı sıkın.<ol><li>Süngeri stereomikroskopun görüş alanına düşük büyütmede yerleştirin (Şekil 1A).</li>
		<li>Optimum görüntüleme için eğik baş üstü aydınlatmasını konumlandırın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Erkek balığın uyuşturulması ve spermin toplanması
<ol><li>Temiz bir kılcal tüp hazırlayın.<ol><li>Tek bir kılcal tüpü serbest bırakmak için tüp kabını yavaşça sallayın.</li>
		<li>Kılcal boruyu sağlanan ampulün içine yerleştirin ve bir kenara koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir erkek balığı hazırlanan anestezi çözeltisine aktarın (balık suyunda% 0.016 trikain-HCl).<ol><li>Anestezi işlemini hızlandırmak için çözeltiyi oluklu bir kaşıkla yavaşça karıştırın.</li>
		<li>Operkulum (solungaç) hareketi yavaşladığında (yaklaşık 1-2 dakika), sperm toplama işlemine devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Balıkları temiz bir kağıt havlu yığınına aktarmak için oluklu kaşığı kullanın.<ol><li>Fazla suyu gidermek için balığı yavaşça yuvarlamak için oluklu kaşığı kullanın.</li>
		<li>Kalan suyu çıkarmak için balıkları temiz, katlanmış kağıt mendille nazikçe lekeleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Balıkları hazırlanan süngere aktarmak için oluklu kaşığı kullanın (Şekil 1B).<ol><li>Balık ventral tarafını, başı prosedürü gerçekleştiren kişinin baskın eline en yakın olacak şekilde yerleştirin.</li>
		<li>Anal yüzgeçlerin etrafındaki alanı temiz, katlanmış kağıt mendille nazikçe lekeleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Spermi toplayın.<ol><li>Kılcal tüpün ucunu kullanarak, kloakı açığa çıkarmak için pelvik yüzgeçleri yavaşça orta hattan yanal olarak uzaklaştırın (Şekil 1C).</li>
		<li>Kılcal tüpün ucunu kloakın yanına yerleştirin.</li>
		<li>Forsepsleri kullanarak, solungaçların hemen altından başlayıp kloakta biten balığın kenarlarını hafifçe sıkın (Şekil 1C').</li>
		<li>Kılcal etki ile kılcal tüpe sperm toplayın. Bu işlem için yaklaşık 1 μL yeterlidir (Şekil 1D). NOT: Bazı laboratuvarlar sperm toplanması için kılcal tüpler yerine p10 pipet uçlarının kullanıldığını bildirmektedir.</li>
		<li>Sperm hafif basınçla serbest bırakılmazsa, balığı sistem suyuna geri döndürün.<ol><li>Anesteziden iyileşme için monitör.</li>
			<li>Spermleri dışarı atmak için balıkları sert bir şekilde sıkmayın, çünkü bu balığa zarar verebilir.</li>
			<li>Tekrar sperm toplamaya çalışmadan önce balıkları 2 hafta dinlendirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Toplandıktan sonra, balıkları ayrı ayrı muhafaza için sistem suyu ile temiz bir izolasyon tankına yerleştirin.<ol><li>Anesteziden kurtulmak için balıkları izleyin.</li>
			<li>Tekrar sperm toplamaya çalışmadan önce balıkları 2 hafta dinlendirin.</li>
		</ol></li>
		<li>Toplanan sperm ile kılcal tüpü hazırlanan PCR tüpüne yerleştirin (40 μL 50 mM NaOH ile).</li>
		<li>Toplanan numuneyi dışarı atmak için kauçuk ampulü sıkın.</li>
		<li>Kullanılmış kılcal boruyu onaylanmış bir cam atık kabına atın.</li>
		<li>Tüm erkekler sıkılana kadar örnekleri buz üzerinde inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Her bir erkek için 4.1-4.5 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>İzolasyon tanklarını ve sperm örneklerini etiketleyin, böylece nihai sperm genotipleme sonuçları, varsayılan mutasyonlarla ilgili bireye kadar izlenebilir.</li>
	<li>Tüm bireyleri izleyin ve tankları sisteme geri koymadan önce dik olduklarından ve tanklarını keşfettiklerinden emin olun.</li>
	<li>Astarlama için kullanılan dişileri sistemdeki kendi tanklarına geri koyun.</li>
	<li>Herhangi bir balık 10 dakika sonra anesteziden iyileşmezse, laboratuvarla ilişkili kurum tarafından onaylanan ötenazi prosedürünü izleyin.<ol><li>Örnek: Bireyi 2-4 °C balık suyu ile bir buz banyosunda hızlı bir şekilde soğutun.</li>
		<li>Ötanazi yapılan balıkları, laboratuvarla ilişkili kurum tarafından onaylanan prosedüre göre uygun bir hayvan karkası atık kabına atın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Sperm örneklerinden DNA çıkarılması
<ol><li>Tüm sperm örneklerini bir mini santrifüjde kısaca döndürün ve PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin.</li>
	<li>Termal çevrimcinin kapağını kapatın.</li>
	<li>Termal çevrimcide aşağıdaki ayarları çalıştırın:<ol><li>Numuneleri 95 °C'de 40 dakika ısıtın.</li>
		<li>Numuneleri 25 °C'ye soğutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Numuneleri termal çevrimciden çıkarın.</li>
	<li>Her numune için temiz bir pipet ucu ile 10 μL 1 M Tris-HCl (pH 8'e tamponlanmış) ekleyerek pH'ı nötralize edin.</li>
	<li>Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.</li>
	<li>Numuneleri bir mini santrifüjde kısaca döndürün.</li>
	<li>Genomik DNA örnekleri 4 ° C'de birkaç gün saklanabilir veya 6 aya kadar -20 ° C'ye yerleştirilebilir.</li>
</ol>6. İstenilen lokusun PCR amplifikasyonu (ve / veya kısıtlama özeti)
<ol><li>Standart bir PCR protokolü kullanarak istenen lokusu yükseltin.<ol><li>Termal döngüleyiciyi aşağıdaki PCR reaksiyonundaki ilk denatürasyon sıcaklığına önceden ısıtın.</li>
		<li>PCR tüplerindeki her sperm örneği için 25 μL'lik bir reaksiyon karışımı hazırlayın: 12,5 μL 2x Taq Polimeraz Ana Karışımı 1,5 μL 10 μM ileri astar 1,5 μL 10 μM ters astar 4,5 μL nükleaz içermeyen su 5 μL nötralize sperm DNA örneği</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.</li>
		<li>Numuneleri bir mini santrifüjde kısaca döndürün.</li>
		<li>Numuneleri aşağıdaki ayarlarla önceden ısıtılmış termal döngüleyiciye yerleştirin: İlk denatürasyon: 3 dakika boyunca 95 °C 35 döngü denatürasyon (30 s için 95 °C), tavlama (30 s için 55 °C) ve uzatma (30 s için 72 °C) Son uzatma: 5 dakika boyunca 72 °C NOT: Spesifik Taq polimerazına ve PCR amplifikasyon ürününün beklenen uzunluğuna bağlı olarak uzatma sıcaklığını ve/veya süresini ayarlamak gerekebilir.</li>
		<li>PCR numunelerini termal çevrimciden çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>İsteğe bağlı: Donöre özgü kısıtlama sindirimini PCR ürününün küçük bir hacminde gerçekleştirin ve jel elektroforezi için en az 5-10 μL sindirilmemiş PCR ürünü bırakın.<ol><li>0,2 mL PCR tüplerinde 30 μL'lik bir reaksiyon hazırlayın: 10 μL saflaştırılmamış PCR ürünü 15 μL nükleaz içermeyen su 3 μL 10x restriksiyon enzim tamponu 2 μL restriksiyon enzimi (BstNI, dnah10 knock-in alelini analiz etmek için temsili sonuçlarda kullanılır) NOT: Birçok restriksiyon enzimi tipik bir PCR reaksiyon tamponunda hala aktiftir; Bununla birlikte, kısıtlama özeti arabelleğinin eklenmesi sonuçların iyileştirilmesine yardımcı olabilir. Herhangi bir sorun oluşursa sorun gidermek için üreticinin özel talimatlarına bakın.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.</li>
		<li>Numuneleri bir mini santrifüjde kısaca döndürün.</li>
		<li>Numuneleri aşağıdaki ayarlara sahip bir termal döngüleyiciye yerleştirin:<ol><li>PCR amplikonu 1 saat boyunca 60 ° C'de kesin. NOT: Kesme sıcaklığının ve inkübasyon süresinin, kullanılan spesifik kısıtlama enzimi için ayarlanması gerekebilir.</li>
			<li>Üretici tarafından belirtilmişse, kısıtlama enzimini gerekli sıcaklık ve inkübasyon süresi ile devre dışı bırakın. NOT: BstNI enzimi ısı inaktivasyonu gerektirmez.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Farklı boyutlardaki PCR amplikonlarını ayırmak için jel elektroforezi yapılması
<ol><li>500 mL 0,5x TBE çalışma tamponu hazırlayın: 450 mL deiyonize suya 50 mL 10x TBE tampon konsantresi ekleyin.</li>
	<li>0.5x TBE çalışma tamponunda 100 mL% 4 agaroz jeli hazırlayın: 100 mL 0.5x TBE çalışma tamponuna 10 μL 10.000x jel lekesi ile 4 g agaroz ekleyin. Agaroz tozu tamamen çözülene kadar mikrodalgada pişirin.<ol><li>Jel çözeltisini uygun boyutta bir jel döküm çerçevesine dökün ve tarağı jelin bir tarafına yerleştirin. NOT: Daha büyük bir jel boyutu (önerilen: 15 cm x 15 cm) bu prosedür için avantajlıdır, çünkü amplikonlara jel üzerinde çözülmesi için daha fazla alan sağlar.<ol><li>Bir kısıtlama özeti ürünü analiz edilecekse, sonuçların karşılaştırılabilmesi için PCR ürünüyle aynı jel üzerinde çalıştırmak en iyisidir. Tüm numuneleri jel üzerine sığdırmak için tarak kuyusu boyutunu gerektiği gibi ayarlayın.</li>
		</ol></li>
		<li>Jeli katılaşana kadar oda sıcaklığında bırakın. Tarağı dikkatlice çıkarın. Jeli döküm çerçevesinden dikkatlice çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Jel elektroforez makinesini kurun.<ol><li>Jeli, kuyucuklar negatif elektrota en yakın olacak şekilde elektroforez teçhizatına yerleştirin. Kuyucuklar tamamen suya batırılana kadar elektroforez makinesine 0,5x TBE çalışma tamponu dökün.</li>
	</ol></li>
	<li>Jeli yükleyin.<ol><li>İlk kuyucuğa 5 μL DNA merdiveni yükleyin (PCR amplikonuna benzer boyutta DNA parçaları içeren bir DNA merdiveni seçin).</li>
		<li>Her numune için yeni bir pipet ucu kullanarak (vahşi tip kontrol numunesi dahil), PCR ürününün 5-10 μL'sini kalan kuyucuklara yükleyin.</li>
		<li>İsteğe bağlı: Bir kısıtlama özeti ürünü analiz edilecekse, bu numuneleri de jele yükleyin. NOT: PCR ve kısıtlama sindirimi ürünü arasına eşit miktarda DNA yüklemek en iyisidir. Örneğin, 30 μL kısıtlama sindirimi sindirimi reaksiyonu karışımında, 10 μL PCR ürünü eklenmiştir. Bu nedenle, 15 μL sindirim ürününün DNA konsantrasyonu, 5 μL saflaştırılmamış PCR ürünü ile karşılaştırılabilirdi.</li>
	</ol></li>
	<li>Jeli çalıştırın.<ol><li>Elektrotları jel elektroforez tertibatına bağlayın ve amplikonların yeterli şekilde ayrılmasını sağlamak için en az 1 saat boyunca 150 V uygulayın.</li>
		<li>DNA bantlarını görüntülemek için jeli görüntüleyin. NOT: Güçlü bir şekilde mutajenize edilmiş CRISPR hedefli lokuslar, vahşi tip amplikonlarla yerleştirme / silme alellerinin bir kombinasyonunu temsil eden çoklu bant boyutları olarak çalışacaktır.<ol><li>Jel bantları 1 saat sonra çözülmezse, bantlar jel üzerinde yeterince ayrılana kadar 15 dakikalık aralıklarla jele 150 V uygulayın.</li>
			<li>İsteğe bağlı: SNP, epitop etiketi veya floresan etiketi gibi hassas bir düzenlemenin eklenmesi için tarama yapılıyorsa, sperm DNA'sını istenen düzenlemeye özgü PCR yöntemleriyle tarayın. Örneğin, donöre özgü bir kısıtlama bölgesi belirlerken, sperm örneğinin PCR ürününe kıyasla kısıtlama sindirimi ürününde ek bir bant bulunacaktır.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>8. Germline stabil alellerin izole edilmesi
<ol><li>Sperm sıkma prosedüründen 2 hafta dinlendikten sonra, sperm genomik DNA'sı istenen düzenlemeleri içeren F0 bireylerini geride bırakın. NOT: Bireysel spermatogonia klonlarından sperm üretimi zebra balıklarında siklik olabilir; Bu nedenle, istenen alel, çıkış sırasında sperm üretmiyor olabilir. Bu nedenle, ilk taramanın içerdiği aleli izole etmek için bir kereden fazla ek geçiş yapılması gerekebilir.</li>
	<li>F1 çapraz balıkları cinsel olarak olgunlaştıktan sonra, sperm genomik DNA'sının taranması sırasında gerçekleştirilen aynı PCR ve jel elektroforez protokolünü kullanarak standart genotipleme yöntemleriyle (örneğin, yüzgeç klip DNA'sı) devam edin.<ol><li>Sanger, istenen aynı düzenlemeye sahip F1 bireylerini tanımlamak için PCR ürünlerini sıralar.</li>
		<li>İsteğe bağlı: İstenen düzenleme bir kısıtlama sitesi sunar veya siteyi bozarsa, uygun bir kısıtlama özeti protokolüyle ekranlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Aynı istenen düzenlemeye sahip çapraz F1 heterozigotları.</li>
	<li>F2 soyunu beklenen fenotip ve / veya genomik düzenlemeler için tarayın.</li>
</ol>

<ol><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).</li>
<li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li>
<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Troutwine, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reissner+fiber+is+highly+dynamic+in+vivo+and+controls+morphogenesis+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine.</a> Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).</li>
<li>Xu, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems%3A+Overview%2C+innovations+and+applications+in+human+disease+research+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).</li>
<li>Creaser, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technic+of+handling+the+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29+for+the+production+of+eggs+which+are+favorable+for+embryological+research+and+are+available+at+any+specified+time+throughout+the+year%5BTitle%5D)+AND+%22Copeia%22%5BJournal%5D)">The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year.</a> Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).</li>
<li>Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservatin+and+in+vitro+fertilization+at+the+zebrafish+international+resource+center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axonemal+dynein+heavy+chain+10+gene+is+essential+for+monocilia+motility+and+spine+alignment+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish.</a> Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).</li>
<li>Gray, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+screen+for+mutations+affecting+spine+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).</li>
<li>Brocal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+identification+of+CRISPR%2FCas9-induced+insertions%2Fdeletions+by+direct+germline+screening+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish.</a> BMC Genomics. 17, 259(2016).</li>
<li>Davis, M. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApE%2C+A+Plasmid+Editor%3A+A+freely+available+DNA+manipulation+and+visualization+program%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program.</a> Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619(2022).</li>
<li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+Peak+Parser%3A+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li>
<li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-TOM%3A+A+platform+for+high-throughput+tracking+of+mutations+induced+by+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China.+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems.</a> Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).</li>
<li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
</ol>

Bu protokol, F0 erkek sperm genomlarına odaklanmış analiz yoluyla CRISPR-Cas teknolojisini kullanarak varsayılan genom düzenlemelerini veya hedeflenen mutasyonları hızlı bir şekilde karakterize etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Bu protokol, spermin ötenazi olmadan örnekleme için hazır olduğu diğer hayvan modellerine uygun olmalıdır. Bu yöntem, istenen düzenlemeler için tarama verimini artırır ve özellikle nadir HDR aracılı zincirleme olayları tanımlamak için kullanışlıdır. Bu yaklaşım aynı zamanda, varsayılan bir F0 ...

CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas sistemi, Danio rerio (zebra balığı) model sistemi 1,2,3,4'te lokuslara özgü mutajenez ve hassas genom düzenlemesi gerçekleştirmek için güçlü bir araçtır. Cas-ribonükleoprotein (RNP) iki ana bileşenden oluşur: bir Cas endonükleaz (genellikle Cas9 veya Cas12a) ve bir lokusa özgü sentetik kılavuz RNA (sgRNA)5. Birlikte, Cas-RNP, istenen lokusta, iki içsel onarım mekanizmasından biri tarafından onarılabilen çift sarmallı bir kırılma (DSB) üretir. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) onarım mekanizması hataya eğilimlidir ve genellikle DSB çevresinde çeşitli eklemeler veya silmeler (indel) ile sonuçlanır. Bu indeller, ortaya çıkan protein dizisinde bir çerçeve kayması mutasyonu veya erken durma meydana getirirlerse zararlı olabilirler. Alternatif olarak, homolojiye yönelik onarım (HDR) mekanizması, hasarı onarmak için DSB bölgesini çevreleyen homoloji bölgelerini içeren bir donör şablonu kullanır. Araştırmacılar, hassas genomik düzenlemeler oluşturmak için HDR sisteminden yararlanabilirler. Spesifik olarak, istenen düzenlemeleri ve genomdaki DSB bölgesini çevreleyen homoloji bölgelerini içeren çift sarmallı bir DNA donör yapısını birlikte enjekte edebilirler. Ticari olarak üretilen bu CRISPR bileşenleri için artan ölçek ekonomisi, çoklu lokusların taranmasının ve hassas genom düzenlemesi için daha büyük ölçekli çabaların oluşturulmasının önündeki engelleri büyük ölçüde azaltmıştır. Bununla birlikte, cinsel olarak üreyen hayvan modellerinde, büyük bir darboğaz, germline stabil mutant hayvanların tanımlanması ve izolasyonudur.
Zebra balığı model sistemi, ters genetik çalışmalarda kullanımını artıran birkaç temel nitelik sergilemektedir. Temel su barınağı ekipmanı ile çok sayıda arkaya çekilmeleri kolaydır ve dişiler tüm yıl boyunca6 boyunca yüksek doğurganlık sergilerler. Dahası, dış yumurtlama ve döllenme onları CRISPR / Cas bileşenlerinin mikroenjeksiyonuna uygun hale getirir. Cas-RNP, teoride tüm yavru hücreler tarafından miras alınan DSB'ler / onarımlar üretmek için genellikle tek hücreli aşamalı zebra balığı embriyolarına enjekte edilir. Bununla birlikte, diploid genomlar, her iki homolog kromozomu da mutajenize etmek için iki DSB / onarım olayı gerektirir. Ayrıca, Cas-RNP tek hücreli aşamada enjekte edilmesine rağmen, DSB / onarım, gelişimin sonraki noktalarına kadar gerçekleşmeyebilir. Birlikte, bu faktörler F0 enjekte edilen balıkların mozaik doğasına katkıda bulunur. Yaygın bir uygulama, F0 enjekte edilen balıkları geçmek ve F1 soyunu indeller / spesifik düzenlemeler için taramaktır. Bununla birlikte, F0 enjekte edilen tüm balıklar germline mutasyonlarına sahip olmadığından, bu uygulama istenen düzenlemeyi üretmeyen birçok verimsiz haçla sonuçlanır. F1 somatik doku yerine F0 germline taraması, istenen germline düzenlemesini izole etme olasılığını arttırır ve bu süreçte gerekli olan hayvan sayısını azaltır.
F0 enjekte edilen zebra balıklarından ötenaziye gerek kalmadan kolayca sperm toplanabilir. Bu özellik, dondurulmuş sperm stoklarının kriyoprezervasyonuna ve yeniden türetilmesine izin verir7, ancak istenen genomik mutasyonların germline taşıyıcılarını hızlı bir şekilde taramak, tanımlamak ve izole etmek için de kullanılabilir 8,9. Brocal ve ark. (2016) daha önce F0 enjekte edilen erkek zebra balığı10'da germline düzenlemelerini taramak için dizileme tabanlı bir yöntem tanımlamıştır. Germ hattında bulunan mutasyona uğramış alelleri tanımlamak için yararlı olsa da, bu yaklaşım yüksek verimde maliyetli olabilir ve tüm laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir. Buna karşılık, mevcut protokol, germline düzenlemelerini tanımlamak için ulaşılabilir ve uygun maliyetli bir elektroforez tabanlı strateji sunmaktadır. Spesifik olarak, bu protokol, yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi kullanarak spesifik lokuslarda germline mutasyonlarını taramak ve izole etmek için sağlam bir yöntemi özetlemektedir. Ek olarak, bu protokol, belirli düzenlemeleri içeren bir bağışçı yapısının başarılı entegrasyonunu tanımlamak için benzer bir stratejiyi açıklamaktadır. Her zaman olduğu gibi, belirli düzenlemeler isteniyorsa, sıralama tabanlı stratejiler aşağıda açıklanan protokolle birlikte gerçekleştirilebilir. Bu protokol zebra balığı model sistemine özgü olsa da, bu ilkeler sperm toplanmasının rutin bir prosedür olduğu herhangi bir modele uyarlanabilir olmalıdır. Birlikte, bu stratejiler, F0 enjekte edilen erkeklerin, standart polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve / veya kısıtlama sindiriminden sonra bir jel üzerinde çözülebilen germline indelleri / düzenlemeleri ile tanımlanmasına izin verecektir.

<table><tbody><tr><td>Agaroz tozu&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Üreme tankları</td><td>Carolina Biological&nbsp;</td><td></td><td></td>161937</tr><tr><td>BstNI Kısıtlama Enzimi</td><td>NEB</td><td>R0168S</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 Endonükleaz</td><td>IDT</td><td>1081060</td><td></td></tr><tr><td>DNA Merdiveni, 100 bp&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td></td><td></td>FERSM0241</tr><tr><td>dnah10 donör yapısı&nbsp; &nbsp;</td><td>Tüpte Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru. Hem 5' hem de 3' uçlardaki ilk üç fosfat bağında donör üzerindeki fosforotiyoat bağı (5'-CCTCTCTCTCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 ileri astar&nbsp;</td><td>Tüpte Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 ters astar ve nbsp;</td><td>Tüpte Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 sentetik sgRNA&nbsp;</td><td>Synthego&nbsp;</td><td>Sentetik sgRNA, hedef dizi: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Elektroforez</td><td></td></tr> <tr><td>güç kaynağı</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>105ECA-115</td><td></td></tr><tr><td>Filtre forseps</td><td>Kırlangıç XX6200006P</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balık (sistem) su</td><td>Jenerik</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforez sistemi (döküm çerçevesi, tarak ve elektroforez odası dahil)&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Jel görüntüleme ışık kutusu&nbsp;</td><td>Azure Biosystems</td><td>AZI200-01</td><td></td></tr><tr><td>Jel boyası, 10000X&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Cam kase, 250 mL&nbsp;</td><td>Jenerik</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon tankları, 0.8 L&nbsp;</td><td>Aquaneering</td><td>ZT080</td><td></td></tr><tr><td>Ampullü Microcap kılcal boru, 20 & L&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>1-000-0020/CA</td><td></td></tr><tr><td>Minisantrifüj</td><td>Bio-Rad</td><td>12011919EDU</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetler, uygun uçlara sahip çeşitli</td><td>Jenerik&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga&nbsp;</td><td>Jenerik&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Promega</td><td>P119-C</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlu</td><td>Jenerik</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PCR tüpleri, 0,2 mL</td><td>Bioexpress</td><td>T-3196-1</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kaşık, delinmiş delikler/yuvalar&nbsp;</td><td>Jenerik</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl çözeltisi, 0.2 M RNAse Free</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 ileri astar&nbsp;</td><td>Tüpte Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 ters primer</td><td>Tüpte Sigma-Aldrich</td><td>DNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 sentetik sgRNA&nbsp;</td><td>Synthego&nbsp;</td><td>Sentetik sgRNA, hedef dizi: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Restriksiyon</td><td></td></tr> <tr><td>Enzimi 10X Tampon</td><td>NEB</td><td>B6003SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>NaOH çözeltisi, 50 mM&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel&nbsp;</td><td>S318; 424330010</td><td></td></tr><tr><td>Sünger, 1 inç x 1 inç kesimli, küçük oval divot ile</td><td>Genel&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimeraz ana karışımı, 2X</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TBE Tampon Konsantresi, 10X</td><td>VWR</td><td>E442</td><td></td></tr><tr><td>Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt Mendil</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Trikain-metansülfonat çözeltisi (Syncaine, MS-222), balık suyunda% 0.016 (pH 7.0&plusmn; 0.2)&nbsp;</td><td>Syndel</td><td>200-266</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base, 1M (HCl ile ph 8.0 arası tamponlu)&nbsp;</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr></tbody></table> İkinci El

zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

Hedeflenen CRISPR-Cas nükleaz teknolojilerinin ortaya çıkışı, hem yerleşik hem de gelişmekte olan model sistemlerinde hassas genom düzenlemesi gerçekleştirme yeteneğinde devrim yarattı. CRISPR-Cas genom düzenleme sistemleri, CRISPR ile ilişkili (Cas) bir endonükleazı Cas endonükleazının çift iplikli bir kırılma oluşturduğu spesifik genomik DNA lokuslarına hedeflemek için sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) kullanır. Çift iplikçik kopmalarının içsel hataya eğilimli mekanizmalarla onarılması, lokusu bozarak yerleştirmelere ve / veya silmelere yol açar. Alternatif olarak, çift sarmallı DNA donörlerinin veya tek sarmallı DNA oligonükleotidlerinin bu sürece dahil edilmesi, tek nükleotid polimorfizmlerinden küçük immünolojik etiketlere ve hatta büyük floresan protein yapılarına kadar değişen hassas genom düzenlemelerinin dahil edilmesini sağlayabilir. Bununla birlikte, bu prosedürdeki büyük bir darboğaz, germ hattında istenen düzenlemeyi bulmak ve izole etmek olabilir. Bu protokol, Danio rerio'daki (zebra balığı) spesifik lokuslarda germline mutasyonlarını taramak ve izole etmek için sağlam bir yöntem ortaya koymaktadır; Bununla birlikte, bu prensipler in vivo sperm toplanmasının mümkün olduğu herhangi bir modele uyarlanabilir.

Bu protokolde açıklanan deneysel yaklaşımlar, F0 enjekte edilen erkek spermlerinin toplanmasından elde edilen binlerce genomun analizine odaklanarak genom düzenlemelerinin veya varsayılan zararlı alellerin daha hızlı tanımlanmasına izin verir. Şekil 2 , bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçların nasıl yorumlanacağını vurgulamaktadır.
P2ry12 lokusunda mutasyon oluşturmak için, tek hücreli evre zebra balığı embriyolarına Cas9 endonükleaz ve p2ry12'...

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Bu protokol, F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini kullanarak binlerce genomu hızlı bir şekilde taramak için bir yöntem açıklamaktadır. Bu teknik erişilebilirliği açısından avantajlıdır. Pahalı, uzmanlaşmış dizileme tabanlı yaklaşımlardan ziyade, yöntemimiz F0 erkek taşıyıcılarını indeller veya spesifik genom düzenlemeleri için taramak için PCR kısıtlama enzimleri ve jel elektroforezi kullanır.Bu prosedürün en zor kısmı spermi hızlı bir şekilde elde etmektir, ancak çok sayıda dismorfik balıkla çalışırsak in vitro fertilizasyon için iyi bir teknik haline gelir ve bu nedenle bize sorun çıkaran balıkları geçmenin kolay bir yoludur. Hem vahşi tip hem de F0 balıkları için üreme tankları kurarak başlayın ve tankları gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün erkek balığı uyuşturduktan sonra, temiz bir kağıt havlu yığınına aktarmak için oluklu bir kaşık kullanın.Fazla suyu gidermek için balıkları yavaşça yuvarlayın. Herhangi bir suyu, temiz bir katlanmış doku ile kurutarak çıkarın. Oluklu kaşığı kullanarak balıkları hazırlanan süngere aktarın.Balık ventral tarafını yukarı doğru yerleştirin ve anal yüzgeçlerin etrafındaki alanı temiz bir katlanmış doku kağıdı ile hafifçe lekeleyin. Spermi toplamak için, pelvik yüzgeçleri orta hattan yavaşça uzaklaştırmak ve kloakı açığa çıkarmak için kılcal bir tüp kullanın. Kılcal tüpü kloakın yanına yerleştirin.Parmaklarınızla veya bir çift filtre forsepsle, balığın kenarlarını solungaçlardan aşağıya doğru hafifçe sıkın. Kılcal hareketi kullanarak, spermi tüpte toplayın ve 40 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi içeren bir PCR tüpüne yerleştirin, ardından numuneyi tüpe atın. Sperm örneklerini mini bir santrifüjde döndürdükten sonra, PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin.Numuneleri 95 santigrat derecede 40 dakika ısıtarak ve ardından 25 santigrat derecede soğutarak döngüleyiciyi çalıştırın. Numuneleri döngüleyiciden çıkardıktan sonra, pH sekizinin bir molar tris hidroklorüründen 10 mikrolitre ekleyerek pH'ı nötralize edin. Süspansiyonu aspire ederek karıştırın ve ardından numuneleri santrifüj edin.Ön ısıtma için termal döngüleyiciyi 95 santigrat dereceye ayarlayın. Bu arada, her sperm örneği için 25 mikrolitre PCR reaksiyon karışımı hazırlayın. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın, ardından numuneleri döndürün.Numuneleri önceden ısıtılmış termal döngüleyiciye yerleştirin ve döngüyü ayarlayın. Bir jel çözeltisi elde etmek için, agaroz tozu, jel lekesi ve TBE tamponunun karıştırılmasıyla hazırlanan% 4'lük bir agaroz jel çözeltisini mikrodalgada pişirin. Jel çözeltisini bir jel döküm çerçevesine dökün ve bir tarafa bir tarak yerleştirin.Jel katılaşmasından sonra, tarağı dikkatlice çıkarın. Jeli, kuyucuklar negatif elektrota en yakın olacak şekilde bir elektroforez teçhizatına yerleştirin. TBE çalışma arabelleğini, kuyular tamamen suya batırılana kadar makineye dökün.Beş mikrolitre DNA merdivenini ilk kuyucuğa pipetleyerek jeli yüklemeye başlayın. Kalan kuyucukları 5 ila 10 mikrolitre PCR ürünü ile yükleyin. Amplikonların yeterli şekilde ayrılmasını sağlamak için jeli 150 voltta 1 saat çalıştırın.DNA bantlarını görüntülemek için jel görüntüleyiciyi kullanın. p2ry12 lokus analizi, vahşi tip amplikonun 250 baz çifti uzunluğunda tek bir bant gösterdiğini, indels içeren F0 enjekte edilen erkek amplikonların çoklu bantlar halinde çalıştığını gösterdi. DNAH10 lokus analizi, vahşi tip amplikonun tek bir 400 baz çifti uzunluğunda bant olarak çalıştığını göstermiştir.İndel içeren F0 enjeksiyonlu erkek amplikonlar, çoklu bantlar halinde veya jel hareketliliği azalmış tek bir bant olarak çalıştı. F0 enjekte edilen bir numaralı erkek, sindirilmiş üründe, PCR ürününde bulunmayan ek bir banda sahipti ve bu da onu mutant knock-in line kurulumu için en iyi kurucu aday haline getirdi. Bir erkek balık sıkıldığında sperm üretmezse, balıkları bir hafta boyunca dinlendirmek ve çok sert sıkmak ve onlara zarar verme riski yerine tekrar denemek en iyisidir.FC veya erkek kurucu geçtikten sonra, alellerin F1 soyunda sırasının doğrulanması gerekir. F1 amplikonlarını doğrudan sıralamak ve heterozigot alel analizi yapmak bunu yapmanın kolay bir yoludur.

screening-sperm-for-the-rapid-isolation-of-germline-edits-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu ultraviyole ışık inaktive sperm döllenme hemen sonra ikinci mayoz bölünme bloke ederek gynogenetic diploid zebrafish embriyolar (sadece genetik katkı anneden gelen embriyolar) üretmek için kullanılan bir yöntemdir. EP embriyolarının ilk mayoz bölünme sırasında rekombinasyon nedeniyle tamamen homozigot değildir, ancak onlar kendi sentromer ayrılmış rekombinasyon henüz tüm lokuslar homozigot.

Erken Basınç Gynogenetic Diployid Zebra balığı

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebra balığı, daha yüksek omurgalılarla genetik benzerlikleri nedeniyle gelişimsel biyoloji ve insan hastalıkları araştırmaları için güçlü bir model sistemdir. Bu protokol, erken embriyogenez için gerekli olan genlerdeki resesif mutasyonları tanımlamak için ileri tarama stratejileri için kullanılabilecek haploid zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir metodolojiyi açıklar.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

ploid manipülasyon için değiştirilmiş bir protokol, erken embriyoda sitokinez bir tek çevrim durak uyarılması için bir ısı şoku kullanır. Bu protokol zebrabalıkları gösterilmiştir, ancak diğer türlere uygulanabilir.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Zebra balığı içinde öldürücü iskelet mutant fenotipleri alellerle tarafından seçici üreme değiştirmek için bu iletişim kuralını hedefidir. Ölümcül mutantlar yetişkinliğe büyüdü ve kendilerini bred, bu nedenle bu protokolü izleme ve sınama döl tarafından birden fazla nesilden alellerle seçmek için bir yöntem açıklanır.

Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen

Zebra balığı güvenilir genetik canlılar arasında gen düzenleme teknolojileri advent ile özellikle Biyomedikal araştırma olarak kullanılmıştır. Larva fenotipleri bekleniyor, DNA ekstraksiyon ve genotip kimlik zor olabilir. Burada, biz bir verimli Genotipleme zebra balığı larva için kuyruk, 72-h sonrası döllenme gibi erken kırpma tarafından açıklayınız.

Yüksek işlem hacmi DNA ekstraksiyon ve 3dpf zebra balığı larva Fin kırpma tarafından Genotipleme

İskelet kas rejenerasyonu, kas distrofisi gibi birçok kas hastalığında bozulan doku yerleşik kas kök hücreleri tarafından yönlendirilir ve bu da kasın yenilenememesi ile sonuçlanır. Burada, kas hastalığının zebra balığı modellerinde kas yenilenmesinin incelenmesini sağlayan bir protokol açıklıyoruz.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Bu protokol, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak zebra balığı embriyolarında hassas knock-in düzenlemelerini kolaylaştırmak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Uzun QT Sendromu ile ilişkili bir gen varyantını modellemek için bu tekniklerin uygulanabilirliğini göstermek için bir fenotipleme boru hattı sunulmuştur.

Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

Bu protokol, zSpRY-ABE8e kullanarak kesin bir zebra balığı hastalığı modeli oluşturmak için PAM sınırlaması olmadan verimli adenin baz düzenlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar.

zSpRY-ABE8e ile İnsan Genetik Hastalığının Zebra Balığı Modellemesi için Verimli PAM-Less Temel Düzenleme

Burada, sgRNA ekspresyon kasetlerinin Tol2 aracılı iletimi ile kararlı bir zpc:cas9 knock-in hattını birleştiren maternal mutant üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

zpc:cas9 knock-in zebra balığı kullanılarak maternal mutantların üretilmesi

Öğrenin, Danio rerio'da F0 CRISPR enjekte edilmiş sperm kullanarak germline düzenlemelerini hızlı ve maliyet etkin bir şekilde nasıl tarayacağınızı. PCR, restriksiyon enzimleri ve jel elektroforezi teknikleriyle bu yöntem, dizileme tabanlı yaklaşımlara erişilebilir bir alternatif sunar.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

Daha fazla video keşfet