Primer Dismenore Olan Sıçanlarda Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Ham ve İşlenmiş Siperi Rizom Örneklerinin Analizi

Metabonomik, genel ve dinamik metabolik tepkileri ölçer ve geleneksel Çin tıbbının genel etkinliğini belirlemekle tutarlıdır. Vücudun metabolik yanıtına bağlı olarak ilaç bileşenlerindeki değişiklikler metabonomiklerle belirlenebilir. TCM'nin aktif bileşenlerinin taranmasının kapsamı bu teknik kullanılarak daraltılabilir.

Tek taraflılık, bireysel bileşenleri inceleyerek önlenebilir. Bu yöntem eşzamanlı olabilir, endojen metabolitleri ve kana emilen eksojen bileşenleri belirleyebilir. Metabonomik, TCM, ilaç toksikolojisi, sağlık yönetimi, spor, gıda ve diğer alanlardaki çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Başlamak için, altı Sprague Dawley sıçanından oluşan bir grubu üç gün boyunca tedavi etmek için sirke veya CRV ile işlenmiş Cyperi rizoma veya CR için gerekli Cyperi rizoma ekstraktını belirleyin. Bu denklemi kullanarak sıçan başına uygulanacak CR veya CRV hacmini hesaplayın. CRV'yi işlemek için, 100 mililitre başına 5.5 gramdan fazla asetik asit içeren 100 gram CR ve 20 gram sirkeyi iyice karıştırın ve 12 saat boyunca inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, karışımı 110 ila 120 santigrat derecede 10 dakika boyunca bir demir tavada kızartın. Ardından, karışımı çıkarın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. CR ekstraktını hazırlamak için, CR'yi alınan CR miktarının 10 katı kadar saf suyla iki saat bekletin, tıbbi malzemelerin sıvı seviyesinin altında olduğundan emin olun.

Daha sonra, su ve ilaç karışımını yüksek ateşte kaynatın ve 20 dakika kısık ateşte kaynatın. Ardından, içeriği 100 örgülü bir filtre bezinden filtreleyin ve filtreyi toplayın. Daha sonra, toplanan filtratı döner bir buharlaştırıcı ile mililitre başına bir grama kadar bir ekstrakt içine konsantre edin.

CRV ekstraktını hazırlamak için, CR ekstraksiyonu için gösterildiği gibi ıslatma, kaynatma ve konsantre etme adımlarını gerçekleştirin. CR ve CRV ekstraktlarını test etmek için, ekstraktın 500 mikrolitresini 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 500 mikrolitre metanole pipet edin ve karıştırmak için 30 saniye boyunca girdap. Numuneleri 16.500 g'da dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüj edin.

Ardından, süpernatanı çıkarın ve test için numune şişesine aktarın. Numuneleri test ettikten sonra, ana bileşen analizini veya PCA'yı ve analiz yazılımını kullanarak modellemeyi gerçekleştirin. Metabolitlerin standartlaştırılmış verilerini yazılıma aktarın ve ardından analiz modelini oluşturmak için Otomatik Sığdır'ı kullanın.

Son olarak, PCA'nın puan dağılım grafiğini elde etmek için puanları kullanın. Ortogonal kısmi en küçük kare diskriminant analizini veya OPLS-DA'yı gerçekleştirmek için, metabolitler ve CR ve CRV grupları hakkındaki standartlaştırılmış verileri yazılıma aktarın. Ardından, CR ve CRV verilerini oluşturulan ilgili gruplara aktarın.

Ardından, analiz modelini oluşturmak için Otomatik Sığdır'ı kullanın ve OPLS-DA'nın puan dağılım grafiğini elde etmek için puanı kullanın. Son olarak, projeksiyondaki değişken önemi veya OPLS-DA'daki VIP değerini elde etmek için VIP'yi kullanın. Potansiyel olarak diferansiyel metabolitleri tanımlamak için, VIP değerleri birden büyük olan metabolitleri tarayın.

Daha sonra, taranan metabolitlerin P-değerini öğrencinin T-testi ile hesaplamak için istatistiksel yazılımı kullanın. Daha sonra, diferansiyel metabolitleri tanımlamak için, ek açıklamalı metabolitleri kullanın ve KEGG veritabanında eşleştirilecek diferansiyel metabolitleri eleyin. CR ve CRV gruplarındaki diferansiyel metabolitlerdeki değişiklikleri bir ısı haritası çizerek gösterin.

Potansiyel metabolik yolları incelemek için MetaboAnalyst veritabanına gidin. Potansiyel metabolik yolları elde etmek üzere farklı metabolitleri yüklemek için Yol Analizi'ni kullanın. Potansiyel metabolik yolları analiz etmek için farklı metabolitleri KEGG veritabanına yükleyin.

Analiz edilen dismenore modeli deneyi, prostaglandin seviyelerinde önemli farklılıklar göstermiştir. Model CR ve CRV gruplarındaki sıçanlar, oksitosin enjeksiyonunu takiben önemli kıvrımlı reaksiyonlar gösterdi. PCA analiz sonuçları, model gruplarına kıyasla CR ve CRV kümelerinin hem pozitif hem de negatif iyon modlarında anlamlı olarak ayrıldığını göstermiştir.

OPLS-DA, metabolik farklılıkları taramak için kullanıldı ve dağılım grafiği sonuçları CR ve CRV gruplarının ayrıldığını gösterdi. Metabolik varyasyonları tanımlamak için tek değişkenli istatistiksel analizler yapıldı. Her noktanın farklı bir metabolite karşılık geldiği bir volkan grafiği gösterilir.

Pozitif modda 63 metabolitte ve negatif modda 30 metabolitte anlamlı değişiklikler gözlendi. Diferansiyel metabolitler KEGG ve HDMB veritabanları kullanılarak belirlendi ve doğru şekilde eşleşen bileşikler listelendi. CR ve CRV grupları arasındaki diferansiyel metabolitlerin kantitatif değerleri hesaplandı ve kümelendi.

Renk yamaları, her metabolitin diğerlerine göre nasıl ifade edildiğini gösterir. CR grubuyla karşılaştırıldığında, CRV grubundaki dört diferansiyel metabolitin seviyeleri artarken, pozitif iyon modunda 11 metabolit azaldı. Negatif iyon modu durumunda, dört diferansiyel metabolit artmış ve yedi metabolit azalmıştır.

KEGG yol analizi sonuçları, diferansiyel metabolitlerin pozitif ve negatif modlarda dokuz yolla ilişkili olduğunu göstermiştir. Diferansiyel metabolitler ne kadar fazla olursa, sonuçlar o kadar iyi olur, bu nedenle yeterli metabolik yol bağlanabilir ve taranan anahtar metabolik yollar daha doğru olacaktır.