Name: Isı şoku proteini 90 inhibitörlerinin keşfi için malakit yeşil testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Keşfedin malakit yeşil testi ile Hsp90 inhibitörlerinin keşfi için yüksek verimli tarama yöntemini. Bu basit ve hassas teknik, kanser araştırmalarında ATPaz aktivitesini ölçerek yeni tedavi adaylarını hızla belirlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) doktora sonrası araştırmacısı olan Kore Araştırma Bursu (KRF) programı tarafından desteklenmiştir ve bilim ve BİT Bakanlığı (NRF-2019H1D3A1A01102952) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bu projeye mali yardım sağladıkları için KIST intramural hibesine ve Okyanuslar ve Balıkçılık Bakanlığı hibe numarası 2MRB130'a müteşekkirdir.

1. Laboratuvar ölçeğinde malakit yeşil tahlili
<ol><li>Tahlil tamponunun hazırlanması<ol><li>Tahlil tamponunu, Tablo 1'de sunulan bileşim ve preparasyona göre hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Fosfat standartlarının hazırlanması<ol><li>Malakit yeşil tahlil fosfat tahlil kitinde (4 °C'de depolanan) sağlanan 1 mM fosfat standardını kullanın.</li>
		<li>40 μM fosfat çözeltisi (ön karışım çözeltisi) elde etmek için 960 μL ultra saf suda 40 μL 1 mM fosfat standardı pipet. Fosfatın 0 ila 40 μM arasında seri seyreltilmesini sağlamak için üreticinin talimatlarına göre ultra saf su ile ön karışım çözeltisini ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Maya Hsp90 hazırlanması<ol><li>Maya Hsp90'ı 0.66 mg / mL'lik bir gliserol stok konsantrasyonu ile kullanın. Kullanmadan hemen önce buz üzerinde çözün.</li>
		<li>Ölçülebilir ATPaz aktivitesi için 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) maya Hsp90 kullanın. Malakit yeşil reaktifin eklenmesinden sonra boş ve pozitif kontrol arasındaki optik yoğunluk farkının en az 0,5 ve 1,0'dan az olduğunu kontrol edin. Burada boşluk (Hsp90 olmadan) ve pozitif kontrol (Hsp90 ile) arasındaki absorbans farkı 0.510 olarak bulunmuştur.</li>
	</ol></li>
	<li>ATP'nin hazırlanması<ol><li>4 mM stok çözeltisi elde etmek için 1 mg ATP'yi 453.39 μL ultra saf su içeren bir şişeye aktarın. Susuz ATP'ye dayalı ağırlık hesaplamaları yapın (moleküler ağırlık [m.w.] = 551.14). ATP'yi taze olarak hazırlayın, çünkü zamanla kendiliğinden hidrolize olabilir.</li>
		<li>0,2 mM'lik bir nihai kuyu konsantrasyonu (nihai toplam tahlil kuyusu hacmi 80 μL) vermek için her bir kuyucuğa 4 μL ATP stok çözeltisi ekleyin. Tüm reaksiyonların aynı anda başlaması için çok kanallı bir pipet kullanarak reaksiyonun son bileşeni olarak ATP'yi ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Geldanamisin (GA) hazırlanması<ol><li>1 mg'ı 178.37 μL DMSO'da (m.w. = 560.64) çözerek 10 mM'lik bir GA stoğu hazırlayın. Stok çözeltisini kullanarak, seri seyreltme ile DMSO'da 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM ve 0,00128 mM çözelti hazırlayın.</li>
		<li>Sırasıyla 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM ve 0,000032 mM'lik bir nihai kuyu konsantrasyonu elde etmek için her bir kuyucuğa bu stok çözeltilerinden 2 μL ekleyin.</li>
		<li>Kuyuları Tablo 2 ve Tablo 3'te açıklandığı gibi, boşluk (tampon + su + DMSO) ve negatif kontrol (tampon + su + DMSO'da Hsp90) içeren kuyularla hazırlayın. GA içeren kuyular (tampon + su + GA'da Hsp90) pozitif kontrol görevi görür.</li>
	</ol></li>
	<li>Kuyu plakalarının hazırlanması ve ekleme sırası<ol><li>Tablo 2'de sunulan düzen ile 96 delikli plakalar hazırlayın. 620 nm'de absorbans gösteren bileşikler için, bu dalga boyunda absorbansı kaydetmek için ayrı bir kuyu hazırlayın. GA için ayrı bir kuyu hazırlamayın, çünkü GA, tahlilde kullanılan konsantrasyon için 620 nm'de absorbans göstermez.</li>
		<li>Her bir bileşeni, Tablo 3'te gösterildiği gibi, her bir bileşenin toplam hacmiyle hazırlayın.</li>
		<li>Her kuyuya ultra saf su ekleyerek tahlil kuyuları kurun. Bunu takiben, gerekli miktarda tahlil tamponu ve bir bileşik çözelti (örneğin, GA çözeltisi) ekleyin.</li>
		<li>Ardından, uygun kuyucuklara Hsp90 ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda 2 dakika çalkalayın.</li>
		<li>Çok kanallı pipet kullanarak 4 μL ATP çözeltisi ekleyin. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda (200 rpm) 2 dakika çalkalayın. Plakayı 3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Malakit yeşil reaktifinin hazırlanması ve eklenmesi<ol><li>Malakit yeşil reaktifi, A (3M HCl'de amonyum molibdat) ve B (malakit yeşili ve polivinil alkol) reaktiflerinden oluşur. Kullanmadan önce reaktifi oda sıcaklığına getirin. A ve B reaktiflerini 100:1 oranında (1.000 μL:10 μL) karıştırın. Bunu kullanmadan önce 3 saat içinde hazırlayın, çünkü kararsızdır ve 3 saat sonra ayrışmaya başlar.</li>
		<li>Adım 1.6.5'in 3 saatinden sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak ATP ile aynı sırada eklenen 20 μL malakit yeşil reaktifi ekleyerek reaksiyonu durdurun.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, plakanın emilimini bir plaka okuyucuda 620 nm'de ölçün.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hsp90 inhibitörlerinin malakit yeşil tahlili ile yüksek verimli taranması
NOT: Yüksek verimli tarama protokolü, laboratuvar ölçeğindeki metodolojiye benzer. Her durumda son kuyu hacmi 80 μL'dir. Bununla birlikte, reaktiflerin eklenme sırasına göre küçük bir fark vardır. Laboratuvar ölçeğinde tabanlı yöntemde, çözelti ilavesinin beş aşaması vardır (34 μL su, 32 μL tampon, DMSO'da 2 μL bileşik, 8 μL Hsp90 ve son olarak 4 μL ATP çözeltisi). Buna karşılık, HTS ile üç ekleme aşaması vardır (Hsp90 maya içeren 40 μL tampon çözeltisi, bileşikleri içeren 18 μL suda 2 μL DMSO ve son olarak suda çözünmüş 20 μL ATP). HTS kurulumunda doğru şekilde pipetlenebilen minimum çözelti miktarı 20 μL'dir. Bu nedenle, laboratuvar ve HTS ölçekleri arasında pipetlemede bir fark gözlenir.
<ol><li>Tahlil tamponunun hazırlanması (pH 7.4)<ol><li>HTS'de laboratuvar ölçeğinde malakit yeşil tahlili ile aynı tamponu kullanın (Tablo 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Maya Hsp90 hazırlanması<ol><li>Gliserol stok konsantrasyonu 0.66 mg / mL olan protein kullanın. Kullanmadan hemen önce buz üzerinde çözün.</li>
		<li>Her bir kuyucukta 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) maya Hsp90 kullanın, bu da ölçülebilir ATPaz aktivitesi sağlar.</li>
		<li>Her bir kuyucuk için proteini (8 μL) tamponda (32 μL) seyreltin. Her bir kuyu için nihai toplam çalışma hacmi, toplam 80 μL'lik bir tahlil hacminde 40 μL'dir.</li>
	</ol></li>
	<li>0,8 mM ATP'nin hazırlanması<ol><li>0,8 mM'lik bir çözelti elde etmek için 1 mg ATP'yi 2.267 μL damıtılmış suda çözün. Her bir kuyu için toplam çalışma hacmi, 80 μL'lik toplam tahlil hacminde 20 μL'dir.</li>
	</ol></li>
	<li>Geldanamisin (GA)/test bileşiklerinin hazırlanması<ol><li>DMSO'da adım 1.5'te olduğu gibi 0,8 mM'lik bir GA stoğu hazırlayın. 80 μM'lik nihai konsantrasyon vermek için GA stokunun 10 μL'sini 90 μL su ile seyreltin.</li>
		<li>Uygun tahlil kuyularında 80 μM GA çözeltisinin 20 μL'sini kullanın (nihai toplam tahlil kuyusu hacmi = 80 μL), 20 μM'lik bir nihai kuyu konsantrasyonu verir. Bu olumlu bir kontrol görevi görür.</li>
		<li>Test bileşikleri için, DMSO'da değerlendirme için istenen konsantrasyonlarına göre çözeltiler hazırlayın.</li>
		<li>Boş (tampon + su + DMSO) ve negatif kontrol kuyularına (tampon + su + DMSO'da Hsp90) ek olarak 90 μL suya 10 μL DMSO hazırlayın. Test bileşiklerini benzer şekilde 100 μM nihai kuyu konsantrasyonunda hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Tahlil plakalarının tasarımı ve ekleme sırası<ol><li>Tahlili kurmak için dört ana plaka, bir bileşik plaka ve reaktif stokları içeren dört ek plaka kullanın (Şekil 2 ve Tablo 4).</li>
		<li>Ek olarak, plaka A, her bir kuyucuğa 90 μL tahlil tamponu ekleyin; ek olarak B plakası, her bir kuyucuğa Hsp90 ile 90 μL tampon ekleyin; C ve D plakalarına ek olarak, her bir kuyucuğa sırasıyla 90 μL ATP ve 90 μL malakit yeşil reaktifi ekleyin (Tablo 5 ve Tablo 6).</li>
		<li>Ek plaka A ve plaka B'den, otomatik bir çok kanallı dağıtım sistemi kullanarak, her bir kuyucuktan sırasıyla ana plaka 1 ve 2 ve 3 ve 4'e 40 μL çözelti aktarın. Burada Biomek(R) FXP laboratuvar otomasyon iş istasyonu kullanılmıştır (Şekil 2 ve Tablo 6).</li>
		<li>Bileşik plakanın her bir kuyucuğundan, çözeltinin 20 μL'sini 1, 2, 3 ve 4 numaralı ana plakalara aktarın (Şekil 2). Plakaları bir çalkalayıcıda (200 rpm) 1 dakika çalkalayın.</li>
		<li>C (ATP) ek plakasının her bir kuyucuğundan, 20 μL çözeltiyi 1, 2, 3 ve 4 numaralı ana plakalara aktarın (Şekil 2). Plakaları bir çalkalayıcıda (200 rpm) 1 dakika çalkalayın.</li>
		<li>Plakaları 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Malakit yeşil reaktifini adım 1.7'ye göre hazırlayın. 3 saat sonra, 20 μL malakit yeşil reaktifini D ek plakasından 1, 2, 3 ve 4 numaralı ana plakaların kuyucuklarına aktarın (Şekil 2).</li>
		<li>Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, plakanın emiliminin bir plaka okuyucuda 620 nm'de olduğunu ölçün.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422(2017).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li>
<li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li>
<li>Park, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90%2C+Grp94%2C+and+TRAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li>
<li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimitespib%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li>
<li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins%3A+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90%3A+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+and+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90%CE%B1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90%CE%B1+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90%CE%B1+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Modeling%22%5BJournal%5D)">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li>
<li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors%3A+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate%3A+mechanism+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li>
<li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking+study%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li>
<li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li>
<li>Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahapatra%2C+DK+%22Advanced+Studies+in+Experimental+and+Clinical%22">Advanced Studies in Experimental and Clinical</a>. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).</li>
<li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90%3A+enabler+of+cancer+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li>
<li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis%2C+metabolism+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).</li>
<li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Hsp90%CE%B2-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li>
<li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425(2018).</li>
<li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

Rakip finansal çıkarlar yoktur.

Hsp90, yeni antikanser ilaç moleküllerinin keşfi için önemli bir hedeftir. Uyuşturulabilirliğinin kurulduğu 1994 yılından bu yana10, 18 molekül klinik çalışmalara ulaşmıştır. Şu anda, yedi molekül tek başına veya kombinasyon halinde22 klinik çalışmaların çeşitli aşamalarındadır. Tüm bu küçük moleküller N-terminal ATP bağlanma inhibitörleridir. Şaperonu inhibe etmenin diğer yolları (C-terminal inhibitörleri, orta alan inhibitörleri) N-terminal inhibitörleri kadar hızlı ilerl...

Isı şoku proteini 90 (Hsp90), kanserin gelişmesinden ve ilerlemesinden sorumlu proteinlerin stabilitesini koruyan moleküler bir şaperondur. Ek olarak, antineoplastik ajanlara karşı direnç gelişmesinden sorumlu proteinler de Hsp901'in müşterileridir. Hsp90, toplam proteinlerin% 2'sinden azını oluşturabileceği normal hücrelere kıyasla, tüm kanser hücresi tiplerinde (hücresel proteinlerin% >90'ı) her yerde aşırı eksprese edilir. Dahası, kanser hücrelerinin Hsp90'ı eş-şaperonlarla birlikte bir komplekste bulunurken, normal bir hücrede ağırlıklı olarak serbest, kompleks olmayan bir durumda bulunur 2,3. Son yıllarda, birkaç Hsp90 inhibitörünün in vitro ve in vivo çalışmalarda senolitik etkilere sahip olduğu gösterilmiştir ve burada farelerin ömrünü önemli ölçüde iyileştirmiştir 4,5,6. Yukarıda belirtilen tüm bulgular, Hsp90 inhibitörlerinin birden fazla kanser türünde, daha az yan etki ve daha az direnç geliştirme şansı ile etkili olabileceğini doğrulamaktadır. Hsp90'ın chaperoning fonksiyonu, ATP'yi Hsp90'ın N-terminal alanına bağlayarak ve ADP ve serbest fosfat7'ye hidrolize ederek gerçekleştirilir. Hsp90'ın ATP bağlanma cebine rekabetçi bir şekilde bağlanan küçük moleküllerin, proteinin chaperoning etkisini başarıyla bastırdığı bulundu. Bugüne kadar, bu, bu tür inhibitörlerin klinik çalışmalara ulaştığı gerçeğiyle desteklenen Hsp90 inhibisyonu için en iyi strateji olmaya devam etmektedir8. Bunlardan biri olan Pimitespib, Haziran 2022'de gastrointestinal stromal tümörün (GIST) tedavisi için Japonya'da onaylandı9. Bu, şaperonun uyuşturulabilirliğinin 1994 yılında kurulmasından bu yana onaylanan ilk Hsp90 inhibitörüdür10.
Malakit yeşil tahlili, inorganik fosfatın tespiti için basit, hassas, hızlı ve ucuz bir prosedürdür, istenen hedef11'e karşı bileşiklerin otomasyonu ve yüksek verimli taraması (HTS) için uygundur. Tahlil, küçük laboratuvar ölçekli kurulumlarda ve HTS 12,13,14,15,16,17'de Hsp90 inhibitörlerinin taranması için başarıyla kullanılmıştır. Tahlil, Hsp90'ın ATPaz aktivitesi nedeniyle oluşan serbest inorganik fosfatı belirleyen kolorimetrik bir yöntem kullanır. Bu nicelemenin temeli, serbest fosfat ve molibden arasında bir fosfomolibdat kompleksinin oluşmasıdır ve daha sonra yeşil bir renk oluşturmak için malakit yeşili ile reaksiyona girer (Şekil 1). Bu hızlı renk oluşumu bir spektrofotometrede veya bir plaka okuyucuda 600-660 nm18,19 arasında ölçülür.
Bu protokolde, maya Hsp90 ile malakit yeşil bir tahlil yapılması ve daha sonra şaperona karşı inhibitörlerin tanımlanması prosedürü açıklanmaktadır. Hsp90'ın uyuşturulabilirliğinin ilk kez kurulduğu doğal ürün molekülü geldanamisin (GA), otantik bir inhibitör10 olarak alınmıştır. HTS, test için çok sayıda molekülün mevcudiyeti nedeniyle mevcut ilaç keşif programının ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Bu teknik, Covid-19 enfeksiyonunun tedavisi için ilaçların yeniden kullanılmasına acil ihtiyaç duyulması nedeniyle son 2 yılda daha fazla önem kazanmıştır20,21. Bu nedenle, moleküllerin HTS için maya Hsp90 proteinine karşı malakit yeşil tahlil yöntemi benimsenerek ayrıntılı bir taslak sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>Suda 1M Magnezyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Suda 1M Potasyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>SPL Yaşam Bilimleri</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5&prime;-trifosfat disodyum tuzu hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX laboratuvarı otomasyon iş istasyonu</td><td>Beckman Coulter</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Bileşikler 3-96</td><td>Uygulanamaz Uygulanamaz</td><td></td><td>Histidin etiketli maya Hsp90, Birleşik Krallık, Sussex Üniversitesi, Yaşam Bilimleri Okulu'ndan Dr. Chrisostomos Prodromou'dan elde edildi ve protein KIST Gangneung Doğal Ürünler Enstitüsü'nde ifade edildi. Patent ihlali sorunları nedeniyle ayrıntılar açıklanamaz.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Jeldanamisin, %99 (HPLC), toz</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNase/RNase İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Malakit Yeşil Fosfat Testi&nbsp; Test kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Çok Algılamalı Mikroplaka Okuyucu Sinerjisi HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT çoklu plaka okuyucu</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Uygulanamaz</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hidroklorür tampon çözeltisi, pH7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Maya Hsp90</td><td>Uygulanamaz</td><td>Uygulanamaz</td><td>Sussex Üniversitesi Yaşam Bilimleri Okulu, Birleşik Krallık ve protein KIST Gangneung Doğal Ürünler Enstitüsü'nde ifade edildi. Birincil Erişim numarası: P02829</td></tr></tbody></table>

isı şoku proteini 90 inhibitörlerinin keşfi için malakit yeşil testi

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

Isı şoku proteini 90 (Hsp90), çoklu onkojenik proteinler üzerindeki chaperoning etkisi nedeniyle umut verici bir antikanser hedefidir. Hsp90'ın aktivitesi, adenozin trifosfatı (ATP) adenozin difosfata (ADP) ve serbest fosfata hidrolize etme kabiliyetine bağlıdır. Hsp90'ın ATPaz aktivitesi chaperoning fonksiyonu ile bağlantılıdır; ATP, Hsp90'ın N-terminal alanına bağlanır ve bağlanmasını bozmanın Hsp90 fonksiyonunu bastırmada en başarılı strateji olduğu bulunmuştur. ATPaz aktivitesi, ATP hidrolizi tarafından oluşturulan serbest fosfat miktarını belirleyen kolorimetrik malakit yeşil testi ile ölçülebilir. Burada, malakit yeşil fosfat tahlil kiti kullanılarak maya Hsp90'ın ATPaz aktivitesini belirlemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Ayrıca, gerçek bir inhibitör olarak geldanamisin alarak Hsp90 inhibitörlerinin keşfi için ayrıntılı talimatlar verilmiştir. Son olarak, bu tahlil protokolünün inhibitör moleküllerinin maya Hsp90'a karşı yüksek verimli taraması (HTS) yoluyla uygulanması tartışılmıştır.

Tahlil sonuçları, serbest fosfat iyon konsantrasyonuna bağlı absorbans açısından yorumlanır. 620 nm'de Hsp90 mayası tarafından ATP hidrolizine bağlı serbest fosfat ile emilimi,% 100 ATPaz aktivitesi veya sıfır yüzde protein inhibisyonu olarak kabul edilir. Proteinin inhibisyonu, ATP hidrolizinin (daha az serbest fosfat) kesilmesine yol açar. bu da 620 nm'de azalan absorbans açısından yansır.
Laboratuvar ölçeğinde malakit yeşil tahlilinin sonuçları Fosfat standardı için stan...

Malakit yeşil tahlil protokolü, ısı şoku proteini 90 (Hsp90) baskılayıcılarını ve ATP'ye bağımlı enzimlere karşı diğer inhibitör bileşikleri keşfetmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir.

Isı şoku proteini 90 inhibitörlerinin keşfi için malakit yeşil testi

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Bu protokol, proteinler tarafından ATP hidrolizinden kaynaklanan serbest fosfatı ölçerek ATPaz proteinleri için aktivitenin belirlenmesine yardımcı olacaktır. Malakit yeşil tahlili, inorganik fosfat tespiti için basit, hassas, hızlı ve ucuz bir prosedürdür. Bileşiklerin hedefine karşı otomasyon ve yüksek verimli taranması için uygundur.Bu teknik, önemli bir anti-kanser hedefi olan Hsp90 proteinine karşı inhibitörlerin hızlı keşfedilmesinde önemli bir rol oynayacaktır. Başlamak için, 40 mikromolar fosfat çözeltisi elde etmek için 960 mikrolitre ultra saf suda 40 mikrolitre bir milimolar fosfat standardı pipet. Fosfatın 0-40-mikromolar arasında seri seyreltilmesini oluşturmak için üreticinin talimatlarına göre bu çözeltiyi ekleyin.Daha sonra, ölçülebilir ATPaz aktivitesi için sekiz mikrolitre maya Hsp90 kullanın. Boşluğa ve pozitif kontrole malakit yeşili reaktif ekleyin ve eklemeden sonra boş ve pozitif kontrol arasındaki optik yoğunluk farkının en az 0,5 ve 1'den az olduğunu kontrol edin. ATP'yi hazırlamak için, dört milimolar stok çözeltisi elde etmek için bir miligram ATP'yi 453.39 mikrolitre ultra saf su içeren bir şişeye aktarın.ATP'yi taze hazırlayın, çünkü zamanla kendiliğinden hidrolize olabilir. 0.2-milimolar nihai kuyu konsantrasyonu vermek için her bir kuyucuğa dört mikrolitre ATP stok çözeltisi ekleyin. Tüm reaksiyonların aynı anda başlaması için çok kanallı bir pipet kullanarak reaksiyona son bileşen olarak ATP ekleyin.Daha sonra, 178.37 mikrolitre DMSO'da bir miligramı çözerek 10 milimolar bir geldanamisin stoğu hazırlayın. Stok çözeltisini kullanarak, seri seyreltme ile DMSO'da 4-milimolar, 0.8 milimolar, 0.16-milimolar, 0.032-milimolar, 0.0064-milimolar ve 0.00128-milimolar çözelti hazırlayın. 0.1-milimolar, 0.02-milimolar, 0.04-milimolar, 0.0008-milimolar, 0.00016-milimolar ve 0.000032-milimolar nihai kuyu konsantrasyonu elde etmek için her bir kuyucuğa bu stok çözeltilerinden iki mikrolitre ekleyin.Daha sonra kuyuları, boş ve negatif kontrolü içeren kuyularla birlikte hazırlayın. Geldanamisin içeren kuyucuklar pozitif kontrol görevi görür. 96 delikli plakaları hazırlayın ve bu dalga boyundaki absorbansı kaydetmek için 620 nanometrede absorbans gösteren bileşikler için ayrı bir kuyu hazırlayın.Geldanamisin için ayrı bir kuyu göstermeyin, çünkü geldanamisin bu tahlilde kullanılan konsantrasyon için 620 nanometrede absorbans göstermez. Her kuyuya ultra saf su ekleyerek tahlil kuyuları kurun. Daha sonra, gerekli miktarda tahlil tamponu ve geldanamisin çözeltisi gibi bir bileşik çözelti ekleyin.Uygun kuyucuklara Hsp90 ekleyin ve plakaları oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda iki dakika çalkalayın. Çok kanallı pipet kullanarak dört mikrolitre ATP çözeltisi ekleyin. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve 200 rpm'de oda sıcaklığında bir plaka çalkalayıcıda iki dakika çalkalayın.Plakayı üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Çok kanallı bir pipet kullanarak ATP ile aynı sırayla 20 mikrolitre malakit yeşil reaktif ekleyerek reaksiyonu durdurun ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Son olarak, plakanın emilimini bir plaka okuyucuda 620 nanometrede ölçün.Ek olarak, plaka A, her bir kuyucuğa 90 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Ek olarak, B plakası, her bir kuyucuğa Hsp90 ile 90 mikrolitre tampon ekleyin. Ek olarak, C plakası, 90 mikrolitre ATP ekleyin ve ayrıca D plakası, her bir oyuğa 90 mikrolitre malakit yeşil reaktifi ekleyin.40 mikrolitre çözeltiyi her bir ek plaka A kuyusundan bir ve iki ana plakaya ve B plakasını üç ve dört ana plakaya aktarmak için otomatik bir çok kanallı dağıtım sistemi kullanın. Bileşik plakanın her bir kuyucuğundan çözeltinin 20 mikrolitresini ana plakalara bir, ana plakalar iki, ana plakalar üç ve ana plakalar dört olarak aktarın. Plakaları 200 rpm'de bir çalkalayıcıda bir dakika çalkalayın.C ilavesi plakalarının her bir kuyucuğundan çözeltinin 20 mikrolitresini bir, iki, üç ve dört ana plakaya aktarın. Plakaları 200 rpm'de bir çalkalayıcıda bir dakika çalkalayın. Plakaları üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve daha sonra 20 mikrolitre malakit yeşil reaktifini ek plaka D'den bir, iki, üç ve dört ana plakaların kuyucuklarına aktarın.Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, plakanın emilimini bir plaka okuyucuda 620 nanometrede ölçün. Malakit yeşilinin yapısı ve malakit yeşil reaktifi A'nın serbest fosfatla reaksiyonları ve ardından B reaktifi ile reaksiyonu burada gösterilmiştir. Standart fosfat konsantrasyonu için standart bir grafik bu şekilde temsil edilmektedir.Burada, x ekseni mikromolardaki serbest fosfat veya pi konsantrasyonunu temsil eder ve 620 nanometredeki absorbans y ekseninde tasvir edilir. Hata çubukları, iki örnek numarası arasındaki sapmayı temsil eder. ATPaz aktivitesinin yüzdesi, proteinin geldanamisin tarafından doza bağımlı inhibisyonunu ölçmek için kullanılır.Geldanamisinin proteini doza bağımlı bir şekilde IC50 değeri 0.85-mikromolar ile inhibe ettiği gözlenmiştir. Burada, her nokta iki belirlemenin ortalamasıdır. Malakit yeşili maddenin eklenmesinden bir sonra ana plakadaki renk gelişimi bu resimde gösterilmiştir.A11 kuyusundaki pembe renk, bileşik renkten kaynaklanmaktadır. Benzer şekilde, ana plaka ikideki renk gelişimi burada gösterilmiştir. A11 kuyusundaki pembe renk, bileşiğin renkli doğasından kaynaklanmaktadır.Malakit yeşil reaktifinin ana plaka üçe ve ana plaka dördüncüye eklenmesinden sonraki renk gelişimi burada gösterilmiştir. ATP ve malakit yeşil reaktifinin her kuyucuğa aynı zaman aralığında eklenmesi, bu prosedürü denerken hatırlanması gereken önemli bir şeydir.

malachite-green-assay-for-discovery-heat-shock-protein-90

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol ısı şok sonra hücre içi protein refolding ölçmek için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, faaliyetlerini etkilemek için moleküler şaperonlar ve bunların eş-faktörleri veya bileşikleri gibi foldases incelemek için kullanılabilir. Firefly lusiferaz aktivitesini muhabir olarak hastabakıcı refolding aktivitesini ölçmek için kullanılır.

Hücre içi Refolding Testi

Biz doğru ve yanlış protein-protein etkileşimleri ayırmak için önce tanıtıldı HIZLI (Nakavt ile birlikte kantitatif immünopresipitasyon) yaklaşımın bir çeşitleme sunuyor. Bizim yaklaşıma...

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Bu videoda, boncuk tabanlı bir yakınlık testi olan güçlendirilmiş ışıldayan yakınlık homojen testini gösteriyoruz. Protein etkileşimlerini inhibe eden potansiyel küçük molekülleri taramak için etkileşime girme eğiliminde olan iki protein ile hareketsiz hale getirilmiş, homojen boyutta alıcı ve verici boncuklar kullanır.

Amplifiye Lüminesan Yakınlık Homojen Deneyi: Protein-Protein Etkileşimlerini İnhibe Eden Küçük Molekülleri Taramak için Boncuk Tabanlı Bir Yakınlık Testi

Organizmalar hayatları boyunca karşılaştığınız en zor stres koşulları oksidanlar birikimi içerir. Oksidatif stres sırasında hücreleri moleküler chaperones güveniyorsun. Burada, redoks düzenlenir anti-toplama etkinliği, de araştırmak için refakatçi işlev HDX-MS kullanarak yöneten yapısal değişiklikleri izlemek için kullanılan bir yöntem mevcut.

Hsp33'ın redoks düzenlenir refakatçi etkinlik tanımlama ve Hsp33 konformasyon değişiklikleri hidrojen-döteryum Exchange kütle spektrometresi kullanarak eşleme

Bir nikotinamid adenin dinükleotid (NADH)-birleştirilmiş ATPaz tsay küçük molekül miyozin inhibitörleri yarı yüksek iş lenme taraması için adapte edilmiştir. Bu kinetik teşbit, kuyu başına sadece 20 μL toplam reaksiyon hacmine sahip 384 kuyulu bir mikroplaka formatında çalıştırılır. Platform hemen hemen tüm ADP üreten enzimler için geçerli olmalıdır.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

Sağlam hücrelerde aday inhibitörleri tarafından hedef nişan değerlendirmek için yeteneği ilaç keşfi için çok önemlidir. Bu protokol, vahşi tip SHP2 veya onkojenik varyantlarını hedefleyen inhibitörlerin hücresel hedef etkileşimini güvenilir bir şekilde algılayan 384 iyi biçimli hücresel termal değişim testini tanımlar.

Hücresel Hedef Etkileşiminin SHP2 (PTPN11) Fosfataz Inhibitörleri ile Değerlendirilmesi

SAMHD1, insan sağlığı ve hastalığında kritik rolleri olan bir deoksinükleozit trifosfat trifosfohidrolazdır. Burada, küçük moleküllerin ve nükleotid analoglarının SAMHD1 substratları, aktivatörleri ve inhibitörleri olarak değerlendirilmesine izin veren, 384 oyuklu bir mikroplaka formatında konuşlandırılan çok yönlü bir enzime bağlı SAMHD1 aktivite testi sunuyoruz.

dNTPase SAMHD1 ile Küçük Molekül Etkileşimini Araştırmak için Yüksek Verimli Enzime Bağlı Aktivite Testi

Bu protokol, GST ile kaynaşmış TPR motifli yardımcı refakatçiler ve Hsp90 türevli peptit ile birleştirilmiş alıcı boncuklar ile glutatyon bağlantılı donör boncuklar kullanarak protein-protein etkileşimlerini yoklama tekniği sunar. Bu tekniği, Hsp90-FKBP51 veya Hsp90-FKBP52 etkileşimlerini bozmak için küçük molekülleri taramak için kullandık ve güçlü ve seçici Hsp90-FKBP51 etkileşim inhibitörlerini belirledik.

Homojen Boncuk Bazlı Test Kullanılarak Chaperone-Cochaperone Etkileşimleri Çalışmaları

Bu protokol, ısı şoku proteini 70'in (Hsp70) şaperon aktivitesini gösterir. E. coli dnaK756 hücreleri, doğal, işlevsel olarak bozulmuş bir Hsp70 barındırdıkları için test için bir model görevi görür ve bu da onları ısı stresine duyarlı hale getirir. Fonksiyonel Hsp70'in heterolog girişi, hücrelerin büyüme eksikliğini kurtarır.

Isı Şoku Proteininin Şaperon Fonksiyonunu İncelemek için Escherichia coli Bazlı Tamamlama Testi 70

Bu protokol, protein sentezinin doğal ürün/küçük molekül inhibitörlerini belirlemek için optimize edilmiş bir florometrik tarama metodolojisi tanıtmaktadır. Pratikliği, hem ilaç keşif teknikleri lisans eğitimi için hem de tıbbi kimya kampanyalarında uygulanması için uygun hale getirir.

Doğal Kaynaklardan Protein Sentezi İnhibitörlerinin Ön Taraması için Flüoresans Tabanlı Protokol

Keşfedin malakit yeşil testi ile Hsp90 inhibitörlerinin keşfi için yüksek verimli tarama yöntemini. Bu basit ve hassas teknik, kanser araştırmalarında ATPaz aktivitesini ölçerek yeni tedavi adaylarını hızla belirlemenizi sağlar.

Isı şoku proteini 90 inhibitörlerinin keşfi için malakit yeşil testi

Daha fazla video keşfet