Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

Sıvı akışı kesme gerilmesinin, osteositlerin mekanik bir stimülatörü olduğu varsayılmaktadır. Doğrudan ölçüm bir seçenek olmadığından, osteositlerin konfokal görüntüden türetilmiş modelleri, osteosit dendritik membranlar üzerindeki sıvı akışı katıksız streslerini değerlendirmek için hesaplamalı akışkanlar dinamiği analizi yapmak için değerli bir araçtır. Laboratuvarımızda yapılan çalışmaların bir kısmı, dendritlerin kıvrımlılığı ve yoğunluğu da dahil olmak üzere gerçek osteosit lakuna morfolojisinin, sıvı akış kesme gerilmesini ve stresin yüksek olduğu osteosit dendritik yapısındaki konumlarını sayısal olarak belirlemek için kemik ve lakünar-kanaliküler ağ ile birlikte kullanıldığı alandaki son gelişmelere karşılık gelmektedir.

Mevcut teknolojiler, nihai eleman analizi, hesaplamalı akışkanlar dinamiği, akışkan yapısı etkileşimi, doğru 3D modeller için X-Işını veya konfokal mikroskop dahil olmak üzere görüntü tabanlı modelleme gibi çeşitli hesaplamalı modellemeleri ve kontrol yükleme koşulları altında suşlar gibi kemik tepkilerini ölçerek modelleri doğrulamak için mekanik test sistemlerini içerir. Bulgularımız, yaşlanma veya kemik hastalığına bağlı dendrit kaybının, kemiklerin fiziksel aktiviteye daha az duyarlı hale gelmesinde bir faktör olduğunu göstermektedir. Osteositlerin, dendritler olan yüksek sıvı akışlı kesme gerilmesi bölgeleri aracılığıyla mekanik yükleri tespit ettiğini tahmin ettik.

Ve akışkan akışı kesme gerilmesi, özellikle yüzey alanı olmak üzere laküner morfoloji ile ilişkilidir. Bu protokolün oluşturulmasıyla birlikte, şu anda iki farklı yaş ve cinsiyetteki fare kemiklerinin osteosit dendritlerindeki sıvı akışı kesme stresini incelemek için bir NIH projesi üzerinde çalışıyoruz. Bu çalışma, yaşlanma ve cinsiyet farklılıklarının yüklenmeye bağlı kemikteki mekanik iletimi nasıl etkilediğini belirlemeye yardımcı olacaktır.

Başlamak için, fareden toplanan uyluk kemiğini soğuk% 4 paraformaldehit içinde fosfat tamponlu tuzlu su içinde 24 saat boyunca dört santigrat derecede hafifçe sallayarak sabitleyin. Ertesi gün, kemiği ve fosfat tamponlu salini durulayın ve hızlı bir şekilde polimerize olan bir akrilik içine gömün. Üçüncü trokanterin üzerinde kalın 300 mikrometre enine dilimler kesin.

Zımpara kağıdı kullanarak, kemik bölümlerini 90 ila 100 mikrometre arasında bir nihai kalınlığa kadar cilalayın. Daha sonra cilalı bölümleri %70 %95 ve %100 etanol ile her biri beş dakika durulayın. Bölümleri karanlıkta dört saat boyunca orta derecede çalkalanarak %100 etanol içinde %1 fit C'de boyayın.

Ardından, bölümleri %100 etanol içinde iyice yıkayın. Ve bunları bir cam slayt üzerindeki bir damla montaj ortamına yerleştirmeden önce gece boyunca havayla kurutun. Numunenin üzerine bir kapak fişi monte edin.

Konfokal bir mikroskopta, uyarma için 488 nanometrelik bir lazer ve 496 ila 596 nanometrelik bir emisyon toplama penceresi ayarlayın. İlk olarak, 5x objektifi kullanarak tüm kemik bölümünün düşük güçte bir görüntüsünü yakalayın. Ardından, 20x objektifi kullanarak ilgilendiğiniz üç bölgenin görüntülerini yakalayın.

1024 x 1024 piksel ve 0,089 mikrometre piksel çözünürlükte 400 Z düzleminin ayrıntılı Z yığınlarını toplamak için 1,7 dijital yakınlaştırma ve 0,126 mikrometre adım boyutuna sahip 100x 1,44 sayısal açıklıklı yağ objektifi kullanın. Fare osteositlerinin bilgisayar modellemesi için, fare uyluk kemiğinin toplanan Z yığını görüntülerini TIFF formatında içe aktardıktan sonra ImageJ yazılımını açın, bir maskeye dahil edilmek üzere piksel yoğunluğu sınırlarını değiştirmek için bölüm menüsündeki eşiği ayarlayın. Kırpma maskesi işlemini kullanarak, ilgilenilen bölge olarak kanalikülleri ile bir lacuna'yı kırpın.

Lacuna'yı, kenar uzunlukları 21, 14 ve 19 mikrometre olan hayali daha büyük bir küpün içine koyun. Tekdüzen bir lakunar-kanaliküler ağ veya LCN oluşturmak üzere bağlı piksel bölgelerini seçmek için bir bölge büyütme işlemi gerçekleştirin. Daha sonra, hesaplanan parça işlemini kullanarak, lakünar-kanaliküler maskeyi bir nesneye dönüştürün.

Osteosit ve dendritik zarları oluşturmak için yumuşatma işlemini kullanarak LCN hacmini azaltın. Ardından nesneleri dışa aktarın. LCN ve osteosit dendritik membranların iki yüzeyini tek bir yüzeyde birleştirin.

Şimdi, lakunar kanal boşluğunun hacimsel bir modelini oluşturmak için yeniden ağ oluşturma işlemini kullanın. Modeli bir STL dosyası olarak dışa aktarın ve nesne ölçeğini mikrometre olarak ayarlayın. Üç boyutlu görüntü tabanlı bir işleme yazılımında, farklı osteosit modelleri oluşturmak için temel model olarak fare lakünar-kanaliküler boşluğunun hacimsel modelini seçin.

Görüntünün ışık yoğunluğunu azaltmak ve daha az kanaliküllü bir lakuna elde etmek için daha düşük bir eşik seçin. Daha sonra, farklı lakünar-kanaliküler boşluk kalınlıklarına veya dendrit kanal çaplarına sahip osteosit modelleri geliştirin. Sırasıyla sarma veya düzleştirme işlemlerini kullanarak daha büyük veya daha küçük osteosit modelleri oluşturun.

Simülasyon yazılımında bir akışkan akışı oluşturmak için, geliştirilen konfokal görüntü tabanlı geometrileri CFX yazılımına aktarın. Birim boyutlarını nanometre olarak ayarlayın. Ardından, tek bir lakunar kaniküler boşluk gövdesi elde etmek için çıkar'a tıklayın.

Oluşturulan fasete sağ tıklayın ve fasetleri birleştirmeden fasetlerden düz bir etki alanına dönüştürün. Ağa tıklayın ve eleman boyutu 0.06 mikrometre olan doğrusal tetrahedral elemanları seçin. Bir ağ yakınsama etüdü ile ağı iyileştirin.

Şimdi yüzeyi seçin ve hayali küpün üst tarafındaki kanalcıkları sıvı girişleri olarak seçin. Kutuyu kullanarak, diğer beş yüzdeki kanalikülleri sıvı çıkışları olarak seçin. Ardından ağı dışa aktarın.

Başka bir akışkan akışı oluşturduktan sonra, akıcı ağı CFX'in kurulum bölümüne aktarın. Sınır ekle seçeneğini kullanarak, yüzler için giriş ve çıkışların iki sınır koşulunu tanımlayın. Giriş ve çıkışlarda sırasıyla 300 ve sıfır paskal sıvı giriş basıncı uygulayın.

Kalan yüzeyleri kaymaz durumdaki duvarlar olarak değerlendirin. Malzeme kitaplığından, interstisyel laminer sıvıyı su olarak arıtın. Isı transferi, yanma ve termal radyasyon bölümlerini yok olarak ayarlayın.

LCN'de akışkan karakteristiği olarak türbülansı seçin. Ardından, gönderim türü olarak çift duyarlık ve doğrudan başlatma kullanarak yazılımı çalıştırın. CFD yazılımının sonuçlar bölümüne yeni bir kontur ekleyin.

Etki alanındaki değişken olarak osteosit dendritik membranlar üzerindeki duvar kesmeyi seçerek bir sıvı akış kesme gerilimi veya FFSS konturu oluşturun. Ardından, girişlerden başlayarak lakunar-kanaliküler alanın içine bir hız akış çizgileri konturu yerleştirin. Genç osteosit modelinde osteosit ve dendritik membranlar üzerindeki ortalama FFSS 0.42 Pascal idi, bu da yaşlı osteosit modelindeki 0.13 Pascal'dan anlamlı derecede yüksekti.

FFSS, model yedide görüldüğü gibi daha büyük laküner kanaliküler boşluğa sahip osteositlerde artmıştır ve model sekizde model sekizde en yüksek FFSS'yi göstermiştir. En düşük FFSS değerleri olan 0.19 Pascal ve 0.13 Pascal, en düşük kanaliküler yoğunluğa sahip model ikinci ve model dördüncü modellerde sırasıyla gözlendi. Beşinci ve altıncı modellerde görüldüğü gibi artan dendrit çapı ile FFSS'de önemli bir değişiklik gözlenmedi.