Name: Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Keşfedin, periferik kandan insan karaciğer sferoidleri üretme yöntemini; toksikoloji, kanser ve ilaç keşfi araştırmaları için otolog hücre kaynakları kullanılarak geliştirilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar özellikle Oksana ve John Greenacre tarafından sağlanan teknik yardım için minnettarlar. Bu çalışma ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Almanya tarafından desteklenmiştir.

Bu deneylerin yapılması için etik onay (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) alınmış ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak kan alınmadan önce tüm donörler tarafından bilgilendirilmiş onam imzalanmıştır.
1. İnsan periferik kanından (PB) mononükleer hücrelerin (ÇUŞ'lar) hazırlanması
<ol><li>Standart protokole göre eğitimli tıbbi personelin yardımıyla sağlıklı donörlerden 30 mL kan alın.</li>
	<li>PBMNC'leri yoğunluk gradyanı ortamını kullanarak Becker-Kojić ve ark.13 tarafından yayınlanan protokole göre izole edin. Pipetleme yoluyla, plazma ve yoğunluk gradyanı ortamı arasındaki fazlar arası tabakayı izole edin ve izole edilmiş hücreleri yıkamak için steril fosfat tampon salin (PBS) kullanın.</li>
	<li>Bir sayım odası kullanın ve standart yöntemleri kullanarak hücre sayısını sayın.</li>
</ol>2. İnsan GPI'sına bağlı glikoprotein ile aktivasyon üzerine ÇUŞ'ların farklılaşması
<ol><li>Bir polistiren tüpünde (15 mL) PBS / % 1 sığır serum albüminine (BSA) 6 x 106 mononükleer hücre yerleştirin ve Becker-Kojić ve ark.13'e göre 37 ° C'de 30 dakika boyunca spesifik antikor ile inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g'da santrifüj edin ve PBS / BSA'yı, Iscove'un% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş modifiye edilmiş Dulbecco ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>Becker-Kojić ve ark.13'te açıklandığı gibi, 15 mL polistiren tüplerdeki hücreleri, 37 ° C'de 37 ° C'de% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 8-10 gün boyunca büyütün. 5. günde (D5), her 15 mL tüpe %10 FBS ile desteklenmiş 1-2 mL Iscove ortamı ekleyin.</li>
</ol>3. Yeni oluşturulan farklılaşmış hücrelerin sıralanması
<ol><li>Oda sıcaklığında kültürlü hücre süspansiyonunu 300 x g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve Becker-Kojić ve ark.13'e göre elde edilen süpernatantı steril bir pipetle aspire edin.</li>
	<li>90 μL soğuk PBS tamponunda (PBS pH 7.2, % 0.5 BSA ve 2 mM EDTA) santrifüjleme ile elde edilen peleti yeniden askıya alın ve 10 μL CD45 pozitif nano boyutlu manyetik boncuk ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 2 mL PBS tamponu ile yıkayın, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve hücrelere 500 μL PBS tamponu ekleyin ve iyice askıya alın.</li>
	<li>Pipet 500 μL önceden soğutulmuş PBS tamponunu kolona yıkayıp manyetik bir stand kullanarak manyetik alana yerleştirin.</li>
	<li>Kolon üzerine yerleştirilen hücreleri, 500 μL PBS tamponu ile iki kez yıkayın ve% 10 FBS ile desteklenmiş Iscove'un ortamında CD45 negatif hücreleri içeren akış toplayın.</li>
	<li>Yeniden programlanmış hücrelerin sayısını belirlemek için bir sayım odası kullanın.</li>
</ol>4. İnsan hepatositlerinin üretimi için cam kapakların hazırlanması
<ol><li>Cam kapakları ayırın (14 mm) ve 10 dakika boyunca iyonik olmayan deterjanda inkübe edin. Cam kapakları deiyonize suda kabarcık kalmayana kadar yıkayın ve 30 dakika boyunca 1M HCl'de inkübe edin (Marchenko ve ark.14'ten uyarlanmıştır).</li>
	<li>Cam kapakları deiyonize suyla en az 3 kat yıkayın ve gece boyunca oda sıcaklığında kurutun. Otoklav kurutulmuş cam kapaklar uygun bir kapta kayar.</li>
</ol>5. BD-PSC'lerin 2D hepatik farklılaşması için hücre kültürü plakalarının biyolaminin ile kaplanması
<ol><li>Steril bir çift cımbızla otoklavlanmış cam kapakları 4 kuyucuk plakasına yerleştirin ve steril koşullar sağlamak için UV ışıklarını 30 dakika boyunca açın.</li>
	<li>Biyolaminin alikotlarını çözün ve her cam kapak kaymasına 120 μL 5 μg / mL biyolaminin ekleyin. Kaplamalı cam kapakları gece boyunca 4 °C'de bırakın.</li>
	<li>Biyolaminin fazlalığını çıkarın ve aşağıda açıklandığı gibi 200 μL hepatosit farklılaşma ortamı ekleyin.</li>
</ol>6. Hepatosit farklılaşma ortamının hazırlanması
<ol><li>% 76.4 nakavt DMEM (ko-dmem),% 20 KSR,% 0.5 L-glutamin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 0.1 β-merkaptoetanol,% 1 DMSO ve% 1 penisilin-streptomisin (Pen / Strep) içeren 500 mL hepatoblast nakavt serum replasmanı (KSR) / dimetil sülfoksit (DMSO) ortamı yapın.</li>
	<li>% 1 L-glutamin, 10 μM hidrokortizon 21-hemissüksinat sodyum tuzu (HCC) ve% 1 Pen / Strep içeren 500 mL hepatosit olgunlaşma ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Stoktan alınan alikot besiyeri ve her ortam değişimi için 10 ng / mL ve / veya 20 ng / mL'lik son konsantrasyonlarda taze hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve onkostatin M (OSM) ekleyin. NOT: Onkostatin M, hematopoez ve karaciğer gelişimi için önemli olan interlökin 6 sitokin grubuna ait bir sitokindir.</li>
</ol>7. BD-PSC'lerden farklılaşmış hepatik hücrelerin kültürlenmesi
<ol><li>3 x 105 BD-PSCS hücresini, biyolaminin ile kaplanmış 4 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna koyun.</li>
	<li>4 delikli plakaları inkübatöre 37 °C ve% 5 CO2'ye yerleştirin. Endodermal farklılaşmayı destekleyen KSR / DMSO hepatoblast ortamında hücreleri 5 gün boyunca kültürleyin ve ortamı her iki günde bir değiştirin.</li>
	<li>5. günde hepatosit olgunlaşma ortamına geçin ve hücreleri inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO2'de 7-10 gün daha kültürleyin. Ortamı her 48 saatte bir değiştirin.</li>
</ol>8.3D küresel hepatik farklılaşma
<ol><li>Bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj BD-farklılaştırılmış hücre süspansiyonu. Süpernatantı çıkarın ve BD-farklılaştırılmış hücreleri KSR / DMSO ortamında 2 x 106 hücre / mL'de yeniden askıya alın.</li>
	<li>Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak ve ek kalıntıları gidermek için hücreleri 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.</li>
	<li>Bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın ve kuyucuk başına gerekli hacmi dağıtmak için her hücre tohumlama yoğunluğu için yeterli bir hacim hazırlayın. 4000 hücrelik düşük bir tohumlama yoğunluğuna 1 x 106 hücreli üst tohumlama ile bir gradyan hazırlayın.</li>
	<li>96 iyi düşük bağlantı plakasına 100 μL KSR / DMSO ortamı dağıtın ve 100 μL hücre tohumlama seyreltmesi ekleyin.</li>
	<li>Düşük bağlantı plakasını inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2'ye yerleştirin ve 5 gün boyunca kültürleyin.</li>
	<li>Sferoidler yeterince kompakt olduğunda, tohumlamadan sonra ortamın% 50'sini 3-4 gün arasında değiştirin.</li>
	<li>5. günde, ortamı hepatosit olgunlaşma ortamına değiştirin ve daha fazla olgunlaşma için hücreleri 7-10 gün daha kültürleyin. Ortamı her iki günde bir değiştirin.</li>
</ol>9. Yeni üretilen 2D karaciğer hücre kültürlerinin immünofloresan analizi
<ol><li>Hücreleri yukarıda açıklanan farklılaşma yöntemine göre 4, 8, 15 ve 24 gün boyunca kültürleyin ve ortamları çıkarın.</li>
	<li>PBS'de 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit içeren önceden ısıtılmış fiksatif ile hücreleri inkübe edin. Fiksatifi atın ve hücreleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile 2 kat yıkayın. Hemen% 0.1 triton X-100 çözeltisi ekleyin ve hücreleri 5 dakika geçirgenleştirin. PBS ile 2 kat yıkayın.</li>
	<li>PBS ve% 5 BSA'dan yapılmış blokaj çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca rocker plakasına yerleştirin.</li>
	<li>Seyreltme tamponundaki primer antikorları %1 BSA/PBS olarak aşağıdaki gibi seyreltin: albümin (ALB) 1:50, alfa-1 fetoprotein (AFP) 1:250, sitokeratin 18 (CK18) 1:50, hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) 1:1000 ve transtiretin (TTR) 1:50. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra antikor çözeltisini atın, hücreleri 5 dakika yıkayın ve yıkama adımını 3x tekrarlayın.</li>
	<li>Seyreltme tamponunda aşağıdaki ikincil antikorları hazırlayın: tavşan anti-tavuk IgG (Teksas kırmızısı) 1:1000, keçi anti-fare IgG (488) 1:1000 ve keçi anti-tavşan (488) 1:500. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltmesi kullanın ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın ve mikroskobik analiz için kapak kapaklarını DAPI içeren montaj ortamıyla monte edin.</li>
</ol>10. Yeni oluşan karaciğer sferoidlerinin canlı boyanması
<ol><li>Sferoidlere dokunmadan kültür ortamını dikkatlice atın,% 0.1 triton X-100 çözeltisi ile taze yapılmış PBS ekleyin ve hücreleri geçirgenleştirmek için 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Sferoidleri 5 dakika boyunca yavaşça pipetleyerek ortamla yıkayın, 2x tekrarlayın.</li>
	<li>Sferoidleri, PBS'de hazırlanan birincil antikorlar ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) ve CYP3A4 (1:200) ile 37 °C'de %5 CO2 inkübatöründe 1 saat boyunca %1 BSA ile inkübe edin. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın.</li>
	<li>Fazla antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve sferoidleri orta 3x ile yıkayın.</li>
	<li>PBS'de keçi anti-tavşan (488) için karşılık gelen ikincil antikorları keçi anti-fare IgG (Cy3), keçi anti-fare IgG (488) ve tavşan anti-tavuk IgG (Teksas kırmızısı)% 1 BSA'da PBS'de keçi anti-tavşan (488) için 1:1000 ve 1:500 seyreltmede hazırlayın. Kuyucuk başına 50 μL antikor seyreltme kullanın ve inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2'de 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>3x'i orta dereceli olarak dikkatlice yıkayın ve floresan mikroskobu yapmadan önce plakayı inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 30 dakika bekletin.</li>
</ol>11. Floresan mikroskobu kullanılarak sferoidlerin incelenmesi
<ol><li>Kullanmadan 10 dakika önce floresan ışık kaynağını açın, bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını açın.</li>
	<li>4x büyütmeli bir hedef kullanın, doğru ölçek çubuğunun seçilmesi için araç çubuğundaki 4x düğmesine tıklayın, ardından 96 delikli plakayı sahne alanı orta plakasına yerleştirin.</li>
	<li>LED ışık kaynağını açın, parlak alan filtresini kullanın ve x-y ekseni sahne alanı ayarlama düğmesini kullanarak plakayı ilgilendiğiniz kuyuya yerleştirin.</li>
	<li>Kamera ışık yoluna geçin, ekrandaki görüntüyü görselleştirmek için Görüntüleme yazılımında yaşa düğmesine tıklayın ve x-y ekseni düğmeleri kullanılarak kürenin ortalandığından emin olun ve kaba/ince netleme düğmesini kullanarak netleyin. NOT: Sferoidlerin şekli, canlı boyama uygulandıktan sonra sabit kalır.</li>
	<li>Araç çubuğunda Brightfield Gözlem yöntemini seçin, pozlama ayarlarını otomatik konuma getirin ve fotoğraf çekmek için fotoğraf makinesi kontrol panelindeki Anlık Görüntü düğmesini tıklatın. Ardından, ilgilendiğiniz klasördeki uygun adı kullanarak resmi .vsi dosyası olarak kaydedin.</li>
	<li>LED ışığını kapatmak için ortam ışığı koruma plakasını yerleştirin, B-uyarımı filtresine geçin, araç çubuğunda 488 Gözlem yöntemini seçin, deklanşörü açın, Anlık Görüntü düğmesini tıklayarak fotoğraf çekin, deklanşörü kapatın, ardından dosyayı yukarıda açıklandığı gibi kaydedin.</li>
	<li>Bunu, uygun gözlem yöntemini (Teksas kırmızısı veya CY3) kullanarak G-uyarma için bir filtre ile tekrarlayın. Ardından, her bir ilgi kuyusu için tüm prosedürü tekrarlayın.</li>
	<li>Plakayı 37 °C'de% 5 CO2 inkübatöre geri koyun ve yukarıda açıklandığı gibi kültürleyin.</li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620(2019).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li>
<li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signalling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhanna%2C+S+%22Animal+Biotechnology+%28Second+Edition%29%22">Animal Biotechnology (Second Edition)</a>. , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+metabolism+and+disposition%3A+The+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+stem+cells+into+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li>
<li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964(2020).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808(2021).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634(2021).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267(2007).</li>
<li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-fetoprotein%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li>
<li>Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transthyretin+in+cell+biology%3A+impact+on+human+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+2021%22%5BJournal%5D)">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li>
<li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li>
<li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li>
<li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686(2022).</li>
<li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects%3A+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li>
<li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li>
<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+liver+diseases+in+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li>
<li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214(2021).</li>
</ol>

Sorumlu yazar, Yeni insan GPI'ya bağlı protein ile ilgili bir patent sahibi olduğunu beyan eder. ACA CELL Biotech GmbH'nin kurucu ortağı ve çalışanıdır. Diğer yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Karaciğer, insan vücudunda, metabolitlerin detoksifikasyonu gibi birçok temel biyolojik fonksiyona sahip önemli bir organdır. Siroz ve / veya viral hepatit gibi ciddi karaciğer yetmezliği nedeniyle, dünya çapında yılda yaklaşık 2 milyon ölüm vardır. Karaciğer nakilleri tüm dünyada solid organ nakillerinde ikinci sırada yer almakla birlikte mevcut ihtiyacın sadece %10'u karşılanmaktadır22.
Birincil insan hepatositleri (PHH) genellikle karaciğer toksisitesini incelemek iç...

Son yıllarda üç boyutlu (3D) küresel kültür sistemleri, kanser araştırmalarının, ilaç keşfinin ve toksikolojinin çeşitli alanlarını incelemek için önemli bir araç haline gelmiştir. Bu tür kültürler büyük ilgi uyandırıyor çünkü iki boyutlu (2B) hücre kültürü monokatmanları ile karmaşık organlar arasındaki boşluğu dolduruyorlar1.
Yapışkan bir yüzeyin yokluğunda, 2D hücre kültürüne kıyasla, sferoidlerin oluşumu, bu hücrelerin 3D formda kümelenmeye olan doğal afinitesine dayanır. Bu hücreler kendilerini bir veya daha fazla olgun hücre tipinden oluşan gruplar halinde düzenlerler. Yabancı maddeler içermeyen bu hücreler, orijinal mikro ortamlarında olduğu gibi birbirleriyle etkileşime girerler. 3B kültürdeki hücreler çok daha yakındır ve birbirlerine doğru doğru bir yönelime sahiptir, 2B kültürlerden daha yüksek hücre dışı matriks üretimi vardır ve doğal ortama yakın bir ortam oluştururlar 2.
Hayvan modelleri, insan biyolojisini ve hastalıklarını incelemek için uzun zamandır kullanılmaktadır3. Bu bağlamda, insanlar ve hayvanlar arasında içsel farklılıklar vardır, bu da bu modelleri ekstrapolatif çalışmalar için tamamen uygun kılmaz. 3D kültür sferoidleri ve organoidleri, in vivo olarak ortaya çıkan ve hayvan modellerinin azaltılmasına veya hatta değiştirilmesine katkıda bulunabilecek farklı hücre tipleri arasındaki doku benzeri mimariyi, etkileşimi ve çapraz konuşmayı incelemek için umut verici bir araçtır. Karaciğer hastalıklarının patogenezini ve ilaç tarama platformlarını incelemek için özellikle ilgi çekicidirler4.
3D sferoid kültür, kanser araştırmaları için özellikle önemlidir, çünkü tümör hücresi monokatmanlarını 2D kültürlere hazırlamak için gereken tripsinizasyon veya kollajenaz tedavisine olan ihtiyacı azaltarak hücreler ve çevreleri arasındaki süreksizliği ortadan kaldırabilir. Tümör sferoidleri, normal ve malign hücrelerin çevrelerinden gelen sinyalleri nasıl aldıklarının ve bunlara nasıl tepki verdiklerinin incelenmesini sağlar5 ve tümör biyolojisi çalışmalarının önemli bir parçasıdır.
Tek katmanla karşılaştırıldığında, çeşitli hücre tiplerinden oluşan 3D kültürler, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinde tümör dokularına benzemektedir ve bu nedenle metastazı ve tümör hücrelerinin invazyonunu incelemek için uygundur. Bu nedenle bu tür küresel modeller kanser araştırmalarının hızlandırılmasına katkıdabulunuyor 6.
Sferoidler ayrıca insan organoidleri yaratma teknolojisinin geliştirilmesine yardımcı oluyor, çünkü doku ve organ biyolojisinin incelenmesi, özellikle insanlarda çok zor. Kök hücre kültüründeki ilerlemeler, kök hücrelerden ve doku progenitörlerinden oluşan organoidler gibi 3D kültürlerin yanı sıra, organ gelişimini, hastalıkları modellemek için kullanılabilecek gerçek bir organ gibi bazı fonksiyonel özelliklere sahip bir organdan farklı olgun (doku) hücre tiplerinin geliştirilmesini mümkün kılmaktadır, ancak rejeneratif tıpta da yararlı sayılabilir7.
Birincil insan hepatositleri genellikle insan hepatositlerinin, karaciğer fonksiyonunun ve ilaca bağlı toksisitenin in vitro biyolojisini incelemek için kullanılır. İnsan hepatositlerinin kültürlerinin iki ana dezavantajı vardır, birincisi, insan hepatositleri gibi birincil dokunun sınırlı mevcudiyeti ve ikincisi, hepatositlerin 2D kültürde hızla farklılaşma eğilimi ve böylece spesifik hepatosit fonksiyonlarını kaybetme eğilimi8. 3D hepatik kültürler bu konuda üstündür ve son zamanlarda farklılaşmış insan embriyonik kök hücrelerinden (hESC'ler) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler)9 yapılmıştır. Biyomühendislik hepatik 3D sferoidler, karaciğerin gelişimini, toksisitesini, genetik ve bulaşıcı hastalıklarını incelemek ve ayrıca karaciğer hastalıklarının tedavisi için ilaç keşfinde özellikle ilgi çekicidir10. Son olarak, akut karaciğer hastalıklarının yaklaşık% 80'lik bir mortalite oranına sahip olduğunu bilerek, biyo-yapay karaciğer ve / veya hepatik sferoidlerin, uygun bir donör bulunana kadar kısmi karaciğer fonksiyonu sağlayarak bu hastaları potansiyel olarak kurtarabileceğini bilerek, klinik olarak kullanılma potansiyeline sahiptirler11.
4000 ila 1 x 106 hücre içeren farklı büyüklükteki sferoidleri hazırlamak için kan kaynaklı pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) kullanarak insan hepatik sferoidlerinin üretimi için bir protokol oluşturduk ve bunları ışık mikroskobu ve immünofloresan yoluyla analiz ettik. Ayrıca, detoksifikasyon süreci boyunca hücresel ve ilaç metabolizmasında önemli rollere sahip sitokrom P450 ailesine ait sitokrom P450 3A4 (CYP3A4) ve 2E1 (CYP2E1) enzimlerinin ekspresyonunu değerlendirerek hepatosit-spesifik fonksiyonun kapasitesini test ettik12.

<table><tbody><tr><td>Tavukta üretilen albümin antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-1 Fetoprotein</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>tavşan poliklonal IgG</td></tr><tr><td>Biolaminin 111 LN</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN111-02</td><td>insan rekombinant</td></tr><tr><td>CD45 Mikro Boncuklar</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>nano boyutlu manyetik boncuklar</td></tr><tr><td>Hücre Süzgeci</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens ve nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>görüntüleme yazılımı</td></tr><tr><td>Santrifüj tüpleri 50 mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96 kuyulu</td><td>OLS OMNI Yaşam Bilimleri</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piyasada satılan deterjan</td><td>Procter & Gamble</td><td></td><td>noniyonik deterjan</td></tr><tr><td>CYP2E1'e özgü antikor</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>tavşan poliklonal antikoru IgG</td></tr><tr><td>CYP3A4&nbsp;</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>67110-1-lg</td><td>fare monoklonal antikoru IgG1</td></tr><tr><td>Cytokeratin 18</td><td>DakoCytomation</td><td>M7010</td><td>fare monoklonal antikoru IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>durduruldu. Şunun altında mevcuttur: TMS-013-B</td></tr><tr><td>Cam kapak kızakları 14 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-glutamin</td></tr><tr><td>Gluteraldehit %25</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG Cy3</td><td>Antikorları çevrimiçi</td><td>ABIN1673767</td><td>poliklonal</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare IgG DyLight 488</td><td>Poliklonal</td><td>ABIN1889284</td><td></td></tr> <tr><td>çevrimiçi antikorlar Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 488</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17705021</td><td>hepatosit olgunlaşma ortamı</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>insan rekombinant</td></tr><tr><td>HNF4 ve alfa; antikor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL</td><td>klonu 4C19 ZooMAb Rbmono</td></tr><tr><td>Hidrokortizon 21-hemisüksinat (sodyum tuzu)</td> <td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>Knock out Serum Replasmanı - Çok Türlü Gibco</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>durduruldu. Katalog No. 10-828-010</td></tr><tr><td>altında mevcuttur MACS Tampon</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>manyetik stand</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50mM</td></tr><tr><td>MiniMACS sütunları</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>4 kuyulu plakalar</td></tr><tr><td>Oncostatin M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td><td>insan rekombinant</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS steril</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U/ml</td></tr><tr><td>PS 15ml tüpler steril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-tavuk IgG Texas kırmızı</td><td>Antikorlar çevrimiçi</td><td>ABIN637943</td><td></td></tr><tr><td>Roti Hücre Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Dağı FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Eylül 1077 insan</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>Transtiretin antikoru&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500378</td> tavuk <td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>%1'de</td></tr> üretilmiştir</tbody></table>.

karaciğer hastalığı Çalışmaları için periferik kandan İnsan karaciğer sferoidleri

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

İnsan karaciğer hücreleri, fonksiyonel kapasitelerini koruyarak birkaç hafta boyunca kültürde büyüyebilen üç boyutlu (3D) bir yapı oluşturabilir. Düşük yapışkan özelliklere sahip veya hiç yapışkan olmayan kültür yemeklerinde kümelenme doğaları nedeniyle, insan karaciğer sferoidleri olarak adlandırılan çoklu karaciğer hücrelerinin agregalarını oluştururlar. 3D karaciğer sferoidlerinin oluşumu, hepatik hücrelerin yapışkan bir substratın yokluğunda toplanma doğal eğilimine dayanır. Bu 3D yapılar, in vivo bir ortama daha yakın olan hücrelerden daha iyi fizyolojik tepkilere sahiptir. 3D hepatosit kültürlerinin kullanılması, klasik iki boyutlu (2D) kültürlerle karşılaştırıldığında, biyolojik olarak daha alakalı bir mikro çevre, doğal organları yeniden bir araya getiren mimari morfolojinin yanı sıra hastalık durumu ve ilaçlara in vivo benzeri yanıtlar hakkında daha iyi bir tahmin de dahil olmak üzere sayısız avantaja sahiptir. Birincil karaciğer dokusu veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatları gibi sferoidler üretmek için çeşitli kaynaklar kullanılabilir. 3D karaciğer dokusu, hepatositleri türetmek için insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) veya indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler) kullanılarak da tasarlanabilir. İnsan zarına bağlı GPI'ye bağlı proteinin aktivasyonu ile manipüle edilmemiş periferik kandan üretilen ve insan hepatositlerine farklılaşan kan kaynaklı pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) kullanarak insan karaciğer sferoidleri elde ettik. BD-PSC'lerden türetilen insan karaciğer hücreleri ve insan karaciğer sferoidleri, insan hepatosit belirteçleri kullanılarak ışık mikroskobu ve immünofenotipleme ile analiz edildi.

İki aşamalı bir protokol uygulayarak insan BD-PSC'lerini endoderm/hepatik progenitör hücrelere ve hepatositlere başarıyla ayırdık. Hepatik farklılaşma sürecindeki morfolojik değişiklikler Şekil 1'de gösterilmiştir. BD-PSC'ler üç farklı aşamadan geçen hepatositlere farklılaşır. İlk aşama, tipik bir poligonal morfoloji sergileyen hepatik progenitör hücrelere (hepatoblast) L8'e farklılaşmayı ve üçüncüsü, hepatositler L15-L24'e olgunlaşmayı temsil eder.
<strong class=...

Burada, kararlı durumdaki periferik kandan izole edilen mononükleer hücreleri kullanarak insan otolog karaciğer sferoidleri üretmek için genetik olmayan bir yöntem sunuyoruz.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Otolog kaynaklar kullanılarak insan karaciğer sferoidlerinin üretilmesi, toksikoloji, kanser ve ilaç keşfi gibi çeşitli araştırma alanlarına katkıda bulunabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birincil insan hepatositlerinin veya PHH'nin eksikliğini gidererek, insan karaciğer sferoidlerini mühendislik yapmak için BDPC türevi insan hepatositlerini kullanmaktır. Otolog insan sferoidleri, özellikle akut karaciğer yetmezliği olan hastalarda rejeneratif tıp ve tedaviye genişletilebilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdaki proje lideri Dr. Anne-Katherin Schott olacak. 500 mililitre hepatoblast KnockOut serum replasman dimetil sülfoksit veya KSR DMSO ortamı ve hepatosit olgunlaşma ortamı hazırlayarak başlayın. Ortamı stoktan alın ve her ortam değişimi için mililitre başına 10 veya 20 nanogramlık son konsantrasyonlarda taze hepatosit büyüme faktörü veya HGF ve onkostatin M veya OCM ekleyin.Beşinci kandan türetilmiş pluripotent kök hücrelere veya BD-PSC hücrelerine üç kez 10 ila biyolaminin kaplı dört kuyucuklu bir plakaya aktarın ve plakayı beş gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatörde inkübe edin. Endodermal farklılaşmayı desteklemek için, hücreleri KSR DMSO hepatoblast ortamında beş gün boyunca kültüre alın ve ortamı her 48 saatte bir değiştirin. Beşinci günde, hepatosit olgunlaşma ortamı ekleyin ve hücreleri inkübatörde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte yedi ila 10 gün daha kültüre alarak ortamın her 48 saatte bir değişmesini sağlayın.Bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de BD farklılaştırılmış hücre süspansiyonunu santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, KSR DMSO ortamındaki BD farklılaştırılmış hücreleri, mililitre konsantrasyon başına altı hücrenin iki katı 10'unda yeniden askıya alın. Tek hücreli süspansiyonu sağladıktan sonra, hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek ek kalıntıları temizleyin.Yine, bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın ve kuyucuk başına gerekli hacmi dağıtmak için her hücre tohumlama yoğunluğunun yeterli bir hacmini hazırlayın. 4.000 hücrelik düşük bir tohumlama yoğunluğuna bir milyon hücrenin üst tohumlanmasıyla bir gradyan hazırlayın. Daha sonra, 96 delikli düşük bağlantı plakalarına 100 mikrolitre KSR DMSO ortamı dağıtın ve 100 mikrolitre hücre tohumlama seyreltmesi ekleyin.Düşük bağlantı plakasını beş gün boyunca inkübe edin. Sferoidler yeterince kompakt olduğunda, tohumlamadan sonraki üçüncü veya dördüncü günde ortamın% 50'sini değiştirin. Beşinci günde, ortamı hepatosit olgunlaşma ortamına değiştirin ve içindeki hücreleri yedi ila 10 gün daha kültüre alın ve ortamı her 48 saatte bir değiştirin.Daha önce açıklanan farklılaştırma yöntemini kullanarak hücreleri 4, 8, 15 ve 24 gün boyunca kültüre aldıktan sonra, ortamı çıkarın. PBS'de% 4 paraformaldehit içeren önceden ısıtılmış fiksatif ile hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, fiksatifi atın ve hücreleri her biri beş dakika boyunca iki kez PBS ile yıkayın.Hemen% 0.1 Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve iki PBS yıkamadan önce hücreleri beş dakika geçirgenleştirin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bir rocker plakasına yerleştirmeden önce PBS ve% 5 sığır serum albümininden veya BSA'dan yapılmış bir bloke edici çözelti ekleyin. Seyreltme tamponunda% 1 BSA PBS'de birincil antikorları seyreltin ve kuyucuk başına 50 mikrolitre antikor seyreltmesi ekleyin.Oda sıcaklığında bir saatlik bir inkübasyondan sonra antikor çözeltisini atın ve PBS kullanarak her biri beş dakikalık üç yıkama yapın. Her bir kuyucuğa seyreltme tamponunda seyreltilmiş 50 mikrolitre ikincil antikor ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, mikroskobik analiz için kapakları DAPI içeren montaj ortamıyla monte edin.Kültür ortamını sferoidlere dokunmadan dikkatlice atın ve% 0.1 Triton X-100 çözeltisi ile taze hazırlanmış PBS ekleyin ve hücreleri geçirgenleştirmek için beş dakika inkübe edin. Sferoidleri, ortamı yavaşça pipetleyerek ortamla iki kez yıkayın. Daha sonra, sferoidleri bir saat boyunca 50 mikrolitre birincil antikor ile inkübe edin.Tamamlandığında, fazla antikor çözeltisini dikkatlice çıkarın ve üç kez orta yıkama yapın. PBS'de keçi karşıtı fare IgG Cy3, keçi karşıtı fare IgG 488 ve tavşan anti-tavuk IgG Texas Red gibi ilgili ikincil antikorları% 1 BSA ile hazırlayın ve karbondioksit inkübatöründe 20 dakikalık inkübasyondan önce kuyu başına 50 mikrolitre antikor seyreltmesi ekleyin. Yine, inkübatörde 30 dakikalık inkübasyondan önce ortamla üç kez yıkayın.Floresan ışık kaynağını kullanmadan 10 dakika önce açın. Bilgisayarı açın ve görüntüleme yazılımını açın. Doğru ölçek çubuğunu seçmek için araç çubuğundaki 4X düğmesine tıklayarak 4X büyütme hedefini kullanın.Ardından 96 delikli plakayı sahne orta plakasına yerleştirin. LED ışık kaynağını açın, parlak alan filtresini kullanın ve XY ekseni sahne alanı ayar düğmesini kullanarak plakayı ilgilendiğiniz kuyuya yerleştirin. Kamera ışık yoluna geçin ve ekrandaki görüntüyü görselleştirmek için görüntüleme yazılımındaki canlı düğmeye tıklayın.XY eksen düğmeleri kullanılarak sferoidin ortalandığından emin olun ve kaba veya ince odaklama düğmesini kullanarak odaklanın. Ardından, araç çubuğunda parlak alan gözlem yöntemini seçin, pozlama ayarlarını otomatik konuma getirin ve fotoğraf çekmek için kamera kontrol panelindeki anlık görüntü düğmesini tıklatın. Ardından, ilgilendiğiniz klasördeki uygun adı kullanarak resmi vsi dosyası olarak kaydedin.LED ışığını kapatmak için ortam ışığı koruma plakasını yerleştirin ve filtreyi B uyarımı için değiştirin. Ardından 488 gözlem yöntemini seçin. Deklanşörü açın, anlık görüntü düğmesine tıklayarak bir resim çekin ve deklanşörü kapatın ve dosyayı vsi olarak kaydedin.İlgilenilen her kuyu için işlemi yinelemek üzere G uyarımı için bir filtreyle işlemi tekrarlayın. Hepatik farklılaşma sürecindeki morfolojik değişiklikler, BD-PSC'lerin üç aşamada hepatositlere farklılaştığını göstermiştir. İlk aşama endodermal hücrelere farklılaşmayı temsil ediyordu.Tipik bir poligonal morfoloji sergileyen hepatik progenitör hücrelere ikinci farklılaşma. Ve üçüncüsü, hepatositlere olgunlaşma. İmmünofloresan analizi, L4 ila L8 günlerinde hepatik farklılaşma sürecinin ilk aşamasında hücrelerde alfa fetoprotein veya APF ve transtiretin veya TTR gibi endoderm insan karaciğer progenitör belirteçlerinin güçlü ekspresyonunu göstermiştir.Bununla birlikte, ifadeleri L15 gününde azaldı. Albümin veya ALB ve hepatosit nükleer faktör dört alfa veya HNF4 alfanın ekspresyonu ilk olarak L4'te ortaya çıktı, L4'ten L15'e farklılaşma süresi boyunca arttı ve L15'ten L24'e olgunlaşma süresi boyunca güçlü ve kararlı bir ifadeye ulaştı. Hepatosit indüksiyonu veya matürasyon ortamı ile başlayan sferoid oluşumu içeren düşük ataşman plakalarında hücrelerin spontan agregasyonu gözlendi.Steroid sferoid ile değişken hücre sayısı arasında tutarlı bir korelasyon gözlendi. L14'te oluşan ve farklılaşan sferoidler ve antikorlarla boyanmış canlılar, BD-PSC'lerden türetilen sferoidlerin potansiyel hepatik fonksiyonel aktivitesini ortaya koymuştur. Mononükleer hücrelerin yeniden programlanması için hazırlanması bu prosedürdeki en önemli adımdır.İnsan karaciğer sferoidleri üretmek, in vivo'ya benzer mikro anatomiye sahip organoidlerin in vitro basitleştirilmiş versiyonunu 3D olarak oluşturmanın ilk adımıdır. Laboratuvarda oluşturulan organoidler, organogenez, hastalık gelişimi ve besinleri incelemek için kullanılır.

human-liver-spheroids-from-peripheral-blood-for-liver-disease-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, insan bağışıklık sistemi ve karaciğer hücreleri ile ikili insanlaştırılmış bir fare modeli oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. İnsan karaciğer hücrelerinin ve hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin intrasplenik enjeksiyon yoluyla transgenik immün yetmezliği olan bir fareye nakledilmesini içerir, bu da karaciğer hücrelerinin aşılanmasına ve insan bağışıklık hücrelerinin gelişmesine yol açar.

İnsan Karaciğer Hücreleri ve Bağışıklık Hücreleri ile İnsanlaştırılmış Bir Fare Modeli Geliştirme

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerden tanımlanan kültür sistemi ve hücre kendi kendine montaj kullanarak hepatospheres üretmek için bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu protokol, hücre çizgilerinin bir dizi tekrarlanabilir, maliyet etkili ve Biyomedikal uygulama için istikrarlı insan hepatospheres üretimi sağlar.

Pluripotent kök hücrelerinden üç boyutlu ınsan Hepatokürlerin serum ücretsiz üretimi

Biz asetaminofen (APAP) bağırsak ve karaciğer organoidleri ile bir mikrofizyolojik sistem (MPS) maruz. Bu makalede, MPS'de organoid üretim yöntemleri ve APAP farmakokinetik ve toksikolojik özellik değerlendirmeleri açıklanmaktadır. Ayrıca sonuçları doğrulamak için gerekli doku işlevselliği analizleri açıklar.

İlaç Farmakokinetik ve Toksikolojik Değerlendirme için Bir Bağırsak/Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

Bu prosedür, hem akut hem de uzun süreli, tekrarlanan doz rejimleri üzerinde nanomalzeme maruziyetleri ile ilişkili genotoksik tehlikelerin fizyolojik olarak daha ilgili bir değerlendirmesini sağlayabilen ileri 3D hepatik kültürlerin in vitro geliştirilmesi için kullanılmak üzere kurulmuştur.

Uzun Süreli Nanomalzeme Maruziyetini Takiben İn vitro Genotoksisite Testi için Gelişmiş 3D Karaciğer Modelleri

İlgili insan hastalığını sadakatle nükseden kapsamlı in vitro modeller eksiktir. Mevcut çalışma, insan hepatosellüler karsinomunda tümör-stromal etkileşimi incelemek için güvenilir bir in vitro araç olan üç boyutlu (3D) tümör sferoid oluşturma ve kültürü ssunuyor.

Hepatosellüler Karsinomdaki Tümör-Stromal Etkileşimi Araştırmak İçin Üç Boyutlu Sferoid Modeli

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

İlaca bağlı karaciğer hasarı (DILI) ilaç yetmezliğinin önemli bir nedenidir. Bir karaciğer mikrofizyolojik sistemi (MPS) kullanarak bir bileşiğin DILI sorumluluğunu doğru bir şekilde tahmin etmek için bir protokol geliştirilmiştir. Karaciğer modeli, tedaviye hücresel yanıtları değerlendirmek için primer hepatik hücrelerin kokültürüne ve translasyonel olarak ilgili son noktalara sahiptir.

İlaca Bağlı Karaciğer Toksisitesini In Vitro Olarak Değerlendirmek için İnsan Karaciğer Mikrofizyolojik Sistemi

Organoidler, organ geliştirme, ilaç keşfi ve hastalık araştırmaları için kişiselleştirilmiş doku modellemesinde devrim yaratıyor. Organoid mühendisliği, karmaşık sentetik dokular oluşturmaya doğru ilerler. Amaç, doku mühendisliğini ilerletmek için morfogenez, assembloid teknolojisi ve biyomatrisleri entegre etmektir. Bu protokol, karaciğer organogenezinin modellenmesine ve sentetik doku yapımı için kılavuzların oluşturulmasına yardımcı olur.

Karaciğer Organogenezini Modellemek, Assembloidler Oluşturmak ve İnsan Hücre Hatlarını Kullanarak Sentetik Dokular Tasarlamak için İn Vitro Yetiştirme Teknikleri

Burada, fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin noninvaziv in vivo görüntülemesine izin veren bir platformu tarif ediyoruz. İş akışı, birincil karaciğer hücrelerinden sferoidlerin üretilmesinden fare gözüne transplantasyona ve konfokal mikroskopi ile hücresel çözünürlükte in vivo görüntülemeye kadar uzanır.

Fare gözünün ön kamarasına aşılanmış karaciğer sferoidlerinin in vivo görüntülenmesi

Keşfedin, periferik kandan insan karaciğer sferoidleri üretme yöntemini; toksikoloji, kanser ve ilaç keşfi araştırmaları için otolog hücre kaynakları kullanılarak geliştirilmiştir.

Karaciğer Hastalığı Çalışmaları için Periferik Kandan İnsan Karaciğer Sferoidleri

Daha fazla video keşfet