Kapalı Yarı Otomatik İş Akışı Kullanarak Klinik Uygulamalar için İnsan Mezenkimal Kök Hücre İşleme

Masaüstü santrifüjleme, ölçeklendirilmesi zor olan açık ve manuel bir prosestir. Protokolümüz, mezenkimal kök hücrelerin veya MSC'lerin ayrışmasını, yıkanmasını ve toplanmasını tek bir seferde nasıl kapatacağımızı ve otomatikleştireceğinizi gösterir. Kurulum basittir.

Tüm süreç, biyogüvenlik kabininin dışında, cGMP sınıfı bir tesiste gerçekleştirilebilir. Kapalı otomatik hücre işleme, riske açık olabilecek manuel taşıma adımlarını azaltır ve cGMP uyumluluğunu sağlar. Bu yöntem, çok katmanlı kültür sistemlerinde genişlemiş diğer hücre tiplerine uygulanabilir.

Karşı Akış Santrifüjleme Sistemi, farklı uygulamalar için herhangi bir protokol adımının değiştirilmesine izin verir. Bu prosedürü gösteren, Singapur'daki bir yıldız olan Biyoişleme Teknolojisi Enstitüsü'ndeki kök hücre biyoişleme grubundan personel bilim adamı Dr. Alan Lam olacaktır. Tek kullanımlık karşı akışlı santrifüj kiti montajına başlamak için, tek kullanımlık kiti resimde belirtildiği gibi boru kaynağı yoluyla tek kullanımlık PVC transfer torbalarına bağlayın.

Daha sonra, bir biyogüvenlik kabininin içine, özel boru tertibatına confluent, Wharton'un Jelly türevi insan mezenkimal kök hücreleri veya Wharton'un Jelly HMSC'lerini içeren 10 katmanlı çok katmanlı bir şişe takın. Ekli 10 katmanlı kültür kabını özel boru tertibatı ile bir tezgaha aktarın ve tek kullanımlık kitin E hattına kaynak yapın. De. yüksek akışlı tek kullanımlık kitin G hattına steril bir numune portu kaynaklayın.

Daha sonra, hasat hattı H'yi 50 mililitrelik bir şırınga ile donatılmış steril bir cazibeye bağlayın. Cihazın çalışmasını ayarlamak için, cihazın arkasındaki geçiş düğmesini kullanarak cihazı açın ve sağlanan USBC kablosunu kullanarak dizüstü bilgisayarı cihazdaki USBC bağlantı noktasına bağlayın. Counterflow Santrifüj Grafik Kullanıcı Arabirimi'ni veya GUI yazılımını masaüstünden veya başlat menüsünden çalıştırın ve oturum açın.

Ardından, ana karşılama sayfasındaki Bir protokol seçin düğmesini tıklatarak protokolü yükleyin. Ardından, cihazdaki mavi kilit açma düğmesine basın ve monte edilmiş tek kullanımlık kiti Karşı Akış Santrifüj Sistemine yüklemek için cam kapıyı açın. Torbaları, bir açıyla yerleştirilmiş 10 katmanlı çok katmanlı şişe ile kabarcık sensörü şeritlerindeki tüp bağlantı noktalarıyla en iyi şekilde hizalayacak şekilde askı kancalarına asarak başlayın.

Kiti iki kit konum düğmesiyle hizalayın. Pompa borusunu peristaltik pompanın etrafına gerin ve beyaz ampul şeklindeki konektörü yerine bastırın. Santrifüj odasını, ters akışlı santrifüj odası taşıyıcısının gümüş kolunu kaldırarak ve kolu dik konumuna getirerek sabitleyerek takın.

Kit üzerindeki her bir bağlantı noktasından boruyu kabarcık sensörü şeritleri boyunca uzanan izlere bastırın. Kapı mandalına bastırarak kapıyı kapatın. GUI'deki Başlat düğmesine basın.

Bir kontrol listesi görünecektir. İlk dört öğe cihaz kontrolleri, son ikisi ise kullanıcı kontrolleridir. Bu noktada, çantaların ve bağlantıların kit görüntüsüyle eşleştiğinden ve manuel kelepçelerin açık olduğundan emin olun.

Protokol girişleri ekranını göstermek için Onayla'ya basın. Veri girişi veya hasat hacmi iletişim kutusu değerini 45 mililitre olarak ayarlayın ve Onayla'ya basın. Protokol çalışmasını başlatmak için cihazdaki yeşil başlat düğmesine basın.

İlk astarlama tamamlandıktan sonra, harcanan ortamın tamamen atık torbasına pompalandığından emin olun. İş akışı tablosunda işaretlenen duraklatma adımlarında, çok katmanlı şişeyi yukarı kaldırın ve arabelleği tüm tepsilere eşit olarak dağıtmak için sallayın. Tamamlandığında, sonraki adımlar için 10 katmanlı çok katmanlı şişeyi orijinal çizim konumuna geri yerleştirin.

20. ve 23. adımlarda, tripsinize edilen hücrelerin tamamen ara torbaya aktarıldığından emin olun. Ara torbayı adım 25'te manuel olarak iyice karıştırın. 26. adımda, örnekleme portundan numune almak için iki mililitrelik bir yem şırıngası kullanın.

29. ve 30. adımlarda, akışkanlaştırılmış hücre yatağının kararlı oluşumunu kontrol edin. Burada gösterilen akışkanlaştırılmış hücre yatağı gibi olmalıdır. Durdurma adımını durdurmak için rampada koşu tamamlanır ve Karşı Akış Santrifüj Sistemindeki tüm sıkıştırma değerleri otomatik olarak kapanır.

Protokol çalışması tamamlandıktan sonra, cihazdaki mavi kilit açma düğmesine basın ve cam kapıyı açın. Hasat hattını elle taşınan bir tüp kapatıcı kullanarak aseptik olarak kapatın ve konsantre hücre hasadı ile doldurulmuş kapalı şırıngayı hücre sayımı ve kriyoprezervasyon için biyolojik güvenlik kabinine dikkatlice aktarın. Kolu kullanarak odayı tekrar ayırın.

Ampul konektörünü bağlantı parçasından çekin ve kiti dikkatlice kaldırın ve biyolojik tehlike torbasına atın. Cihazı etanol mendiller kullanarak temizleyin ve kapıyı kapatın. Son olarak, cihazın arkasındaki anahtarı kapatmadan önce GUI uygulamasını kapatın.

Wharton'un Jelly MSC'leri, hem serum içeren hem de serum içermeyen, kseno içermeyen ortamlarda genişletildiğinde iyi çoğaldı. Bununla birlikte, serumsuz, kseno içermeyen ortamdakiler, serum ortamındaki 15 mikrona kıyasla, 17 mikronluk daha büyük bir ortalama hücre boyutuna sahip, biraz daha uzun fibroblast benzeri iğ şeklinde morfoloji sergilediler. Üç pasajdaki her iki ortamda da, Wharton'un Jöle HMSC'leri sürekli olarak santimetre kare başına yaklaşık 23.000 hücrelik maksimum hücre yoğunluğuna ve 34 saatlik bir popülasyon ikiye katlanma süresine ulaştı.

Wharton'un Jelly HMSC'leri, gösterilen karşı akış santrifüjlemesi kullanılarak 10 katmanlı kültür kaplarında genişletildiğinde, mililitre başına 5.3 milyon hücre kadar yüksek hücre konsantrasyonları üreterek on kat hacim azalması sağlandı. Protokol, üç bağımsız çalışma için sürekli olarak yaklaşık% 98'lik yüksek bir hücre iyileşmesi ve yaklaşık% 99'luk yüksek bir hücre canlılığı elde etti. Her iki yöntem kullanılarak toplanan Wharton's Jelly HMSC'leri, CD73, CD90 ve CD105 pozitif, CD34 ve CD45 negatif olan karakteristik yüzey işaretleyici profilleri sergiledi.

Karşı akış santrifüjlemesinden toplanan hücreler, manuel santrifüjleme ile toplananlara kıyasla, benzer bir koloni oluşturan birim fibroblast testi veya CFU potansiyeli gösterdi. Her iki yöntemde de, hücreler adipositlere, osteoblastlara ve kondrositlere farklılaşma yeteneğini korudu. Karşı akış santrifüjleme sonrası hücrelerin sitokin sekresyon profilleri, karşı akış öncesi santrifüjleme ile karşılaştırılabilirdi.

Tek kullanımlık kiti yatak kurulumuna göre monte ettiğinizden emin olun, bu Counterflow Santriffusion Sistem Protokol Oluşturucu'da değiştirin. Nihai üründen kalan safsızlıkların yıkanmasına yönelik protokol, kullanıcıların lot salım kriterlerini karşılamalarını desteklemek için klinik uygulamalarda kullanılabilir. Büyük ölçekli işleme için sıvı transferi sürecini hızlandırmak amacıyla, tripnize edilmiş içerikleri doğrudan çok katmanlı şişeden hasat etmek yerine önce bir transfer torbasına aktarmak için harici pompalar kullanılabilir.