Drosophila melanogaster'de Endojen Gen Etiketleme için Tek Adımlı CRISPR Tabanlı Strateji
26 Ocak 2024
Burada, başarılı genetik modifikasyonların işaretsiz tanımlanması için PCR tabanlı bir teknik kullanan ve stabil knock-in hatlarının geliştirilmesini kolaylaştıran Drosophila için basitleştirilmiş bir endojen gen etiketleme protokolü sunuyoruz.
Bu protokolün amacı, endojen düzenlenmiş bir sinek hattı oluşturmaktır. Örnek olarak bir floresan protein knock-in'i gösteriyoruz, ancak diğer knock-in, knockout ve mutasyon oluşumuna da uygulanabilir. Protokolümüz CRISPR homolog rekombinasyon tabanlı bir yöntemdir, bu nedenle mutasyon bölgelerinde neredeyse hiçbir kısıtlama yoktur.
Ayrıca, protokolümüz genotipleme adımlarında harcanan zamanı ve çabayı büyük ölçüde azalttı. Başlamak için, Drosophila için sgRNA'lar tasarlamak üzere fly CRISPR web sitesini açın ve istenen knock-in konumunu çevreleyen yaklaşık 100 baz çifti dizisi girin. Beş ana guanin seçeneğiyle CRISPR hedeflerini seçin.
Olası sgRNA dizilerinin bir listesini oluşturmak için CRISPR hedeflerini bul düğmesine tıklayın. Ardından her dizi için değerlendir düğmesine tıklayın ve sıfır hedefi olan iki sgRNA seçin. Doğal protein ekspresyon seviyeleri tipik olarak çok daha düşük olduğundan, parlak ve fotostabil olan ve deney düzeneğine uyan floresan etiketleri seçin.
Ardından, epitop etiketlerini biyokimyasal analiz için floresan işaretleyiciye bağlamak için bir bağlayıcı tasarlayın. Glisin ve serin gibi amino asitleri içeren iki ila 20 amino asit arasında değişen bir bağlayıcı peptit kullanın. Drosophila için donör vektörünü tasarlamak için, bağlayıcı peptitin ve floresan etiketin DNA dizisini düzenleyin ve her iki ucu çevreleyen homolog diziler sağlayın.
Elde edilen protein amino asit dizisini korumak için donör plazmidi içindeki herhangi bir PAM dizisini değiştirin. Ardından, etiket konumuna bağlı olarak başlatma ve durdurma kodonlarını konumlandırın. Dahili etiketleme için, floresan etiketin hedef genin kodlama dizisiyle çerçevede olduğundan emin olun.
N-terminal etiketleme için, floresan etiketini endojen başlangıç kodonundan sonra konumlandırın. C-terminali etiketlemesi için, floresan etiketini doğal durdurma kodonunun önüne yerleştirin. Olası çeviri sorunlarını önlemek için yalnızca tek bir başlangıç kodonunu sakladığınızdan emin olun.
sgRNA dizisini plazmid U6 Bbs1-chiRNA plazmidine eklemek için alternatif restriksiyon enzimi tabanlı klonlama yaklaşımını kullanın. SgRNA plazmidini oluşturduktan sonra, plazmiti üreticinin talimatlarına göre DH5-Alfa Escherichia coli'ye dönüştürün. Elde edilen klonları, T3 veya T7 standart dizileme primerlerini kullanarak Sanger dizilimi yoluyla doğrulayın.
Donör plazmidini oluşturmak için, istenen diziye sahip çift sarmallı DNA kullanın ve onu plazmid Bluesript 2SK negatif çoklu klonlama bölgesine entegre edin. sgRNA veya PAM dizilerinin doğru şekilde değiştirildiğinden ve plazmidde SNP bulunmadığından emin olmak için donör plazmitini sıralayın. Ardından, yapılandırılmış gRNA ve donör plazmitleri ile enjekte edilen Cas9 sineklerini alın.
Sinekleri karbondioksit ile uyuşturun ve erkek sinekleri ve bakire dişileri ayırın. Sinek çaprazları oluşturmak için, her bir G sıfır erkeği ayrı dar CT gıda şişelerinde en az iki FM7L bakire dişi ile eşleştirin. Çapraz şişeleri, F1 yaklaşana kadar 25 santigrat derece ve% 60 nemde tutulan havalandırmalı bir inkübatöre yerleştirin.
Daha sonra anestezi uygulayın ve hem G sıfır erkek hem de dişi melezlerden en az 10 bakire dişi yavru toplayın. Her F1 sineğinin ebeveyninin ayrıntılarıyla etiketlendiğinden ve ayrı olarak saklandığından emin olun. Sinekleri PCR için taramak için, hedef genin düzenleme bölgesini kapsayan yaklaşık 55 santigrat derece erime sıcaklığına sahip primerler tasarlayın.
Her sinek numunesi için lizis tamponu hazırlayın ve 96 oyuklu bir PCR plakasının her bir oyuğuna 10 mikrolitre dağıtın. Bacak diseksiyon işlemi sırasında tamponu soğuk bir sıcaklıkta tutun. Daha sonra, bir ucunu sakaroz agar yemi ile doldurarak cam kılcal tüpler hazırlayın.
Bu tüpleri, sinek oteli olarak adlandırılan 96 kuyu derinliğinde bir kuyu plakasına yerleştirin. Bacak diseksiyonu için, karbondioksit anestezi pedini stereo mikroskop altında konumlandırın. Aday bir sineği uyuşturun ve orta bacaklarından birini kesin.
Bundan sonra, bacağı lizis tamponuna daldırın. Sinek kanadını bir çift ince metal forseps ile tutun. Sineği sinek oteline taşıyın ve tüpü hemen iplikle kapatın.
Sinek otelini 25 santigrat derece ve% 60 nemde tutulan havalandırmalı bir inkübatörde barındırın. Kopan bacakları bir termal döngüleyicide lizis tampon çözeltisine daldırın. DNA kaynağı olarak 1.5 mikrolitre sinek bacağı lizatı kullanarak PCR reaksiyonunu üretici tarafından talimat verildiği şekilde düzenleyin.
PCR ürünlerini agaroz jel elektroforezine tabi tutun ve sonuçları bant boyutuna göre yorumlayın. Jel sonuçlarına dayanarak, uçuş otelinden pozitif sinekleri seçin ve F2 neslini üretmek için bunları dengeleyici sineklerle ayrı ayrı çaprazlayın. Doğruluğu sağlamak için düzenleme sitesinin Sanger sıralaması için homozigot stokları kullanın.
Arka plan mutasyonlarını ortadan kaldırmak için vahşi tip sineklerle geri çapraz doğrulanmış sinek çizgileri. Tek bacaklı PCR protokolünü kullanarak her nesli tarayın. Yetişkin Drosophila beyinlerinin konfokal mikroskop görüntüleri, gece geç saatlerde ve sabahın erken saatlerinde gizli nükleer odaklar halinde organize edilmiş dönem proteini gösterdi.
Genel olarak, genotipleme PCR primerleriniz spesifikse bu protokol sağlamdır.
Genel Bakış
Bu çalışma, başarılı genetik modifikasyonların işaretleyici kullanmadan tanımlanması için PCR tabanlı bir teknik kullanan, Drosophila için basitleştirilmiş bir endojen gen etiketleme protokolü sunmaktadır. Floresan protein örneği ile gösterilen bu yaklaşım, stabil knock-in hatlarının geliştirilmesini kolaylaştırmakta olup ek genetik modifikasyonlar için uyarlanabilmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Genetik
- Drosophila araştırmaları
Arka Plan
- CRISPR gibi gen düzenleme teknolojileri, model organizmalardaki genetik modifikasyonları hızlandırmıştır.
- Endojen etiketleme, protein davranışlarının ve etkileşimlerinin gözlemlenmesine olanak tanır.
- Başarılı modifikasyonların doğrulanması için etkili genotipleme yöntemleri esastır.
Çalışmanın Amacı
- Genetik olarak modifiye edilmiş Drosophila hatlarının oluşturulması ve doğrulanması sürecini kolaylaştırmak.
- Genotipleme prosedürlerinde harcanan süreyi minimize eden bir protokol sağlamak.
- CRISPR homolog rekombinasyon tekniklerinin uygulanabilirliğini genişletmek.
Kullanılan Yöntemler
- Gen düzenleme için Drosophila'da CRISPR homolog rekombinasyonu kullanıldı.
- Temel müdahaleler arasında sgRNA'ların tasarlanması ve donör plazmitlerin oluşturulması yer aldı.
- Başarılı düzenlemeleri doğrulamak için modifiye edilmiş hatların PCR taraması gerçekleştirildi.
- Kritik adımlar arasında örnek toplama için bacak diseksiyonu ve spesifik primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu yer aldı.
Temel Sonuçlar
- Çalışma, Drosophila'da floresan protein knock-in'leri oluşturmak için etkili bir yöntemi başarıyla göstermiştir.
- Genotipleme süresindeki azalma ve genetik düzenlemelerin doğrulanmasındaki artan doğruluk vurgulanmıştır.
- Elde edilen sinek hatları, ileri biyolojik çalışmalar için gerekli olan istenen protein lokalizasyon modelleri sergilemiştir.
Sonuçlar
- Bu protokol, genetik olarak modifiye edilmiş Drosophila hatlarının oluşturulmasını ve doğrulanmasını önemli ölçüde kolaylaştırır.
- Araştırmacıların çeşitli genetik çalışmalar için Drosophila modellerinden yararlanma kapasitesini artırır.
- Yöntemin verimliliği ve esnekliği, in vivo protein fonksiyonu ve gen etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
Drosophila melanogaster'da verimli endojen gen etiketleme, protein fonksiyonu ve lokalizasyonunun doğrulanmasını hızlandırarak biyofarma Ar-Ge'sindeki erken keşifleri ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. PCR tabanlı tarama içeren tek adımlı CRISPR tabanlı protokol, görünür işaretçilere olan bağımlılığı ortadan kaldırarak stabil, genetik olarak mühendisliği yapılmış hatların oluşturulmasını kolaylaştırır. Bu yaklaşım, hastalıkla ilgili model sistemlerde genetik modifikasyonların hızlı ve işaretçisiz onaylanmasını sağlayarak öngörü güvenini ve portföy önceliklendirmesini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hedef doğrulaması için protein lokalizasyonu ve fonksiyonunun in vivo olarak doğrudan sorgulanmasını sağlar.
- Eksojen belirteçler olmadan hassas, endojen etiketlemeye olanak tanıyarak mekanistik risk azaltmayı destekler.
- Hipotez odaklı çalışmalar için genetik olarak tanımlanmış hatların hızlı bir şekilde oluşturulmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt fenomenik taramalar için valide edilmiş, markör içermeyen biyolojik sistemler sağlar.
- PCR tabanlı genotipleme yoluyla deney tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonu artırır.
- Güçlü bileşik değerlendirmesi için mühendislik ürünü hatların ölçeklenebilir üretimini sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Protein dinamiklerinin in vivo çalışmalarını destekleyerek hastalıkla ilgili model geliştirme süreçleriyle uyum sağlar.
- Stabil ve genetik olarak karakterize edilmiş stoklar aracılığıyla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Hassas genetik düzenlemeleri onaylayarak translasyonel araştırmalardaki biyolojik belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu tek adımlı CRISPR etiketleme protokolü, erken keşif ve öncü bileşik tanımlama sürekliliğine entegre olarak, sonraki taramalar ve preklinik çalışmalar için bir temel sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Protein davranışının gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Kantitatif fenotipik analizler için uygun, tekrarlanabilir ve markersiz hatlar sunar.
- Analizler: Genetik modifikasyonların güçlü bir şekilde doğrulanması için PCR tabanlı genotipleme ve Sanger dizileme yöntemlerini kullanır.
- Translasyonel Araştırma: In vivo protein takibini mümkün kılarak hastalık modelleriyle uyumu kolaylaştırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Drosophila üzerinde çeşitli gen düzenleme ve etiketleme uygulamaları için yeniden kullanılabilir bir iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Genotiplemeyi optimize eder, tekrarlanabilirliği artırır ve ölçeklenebilir hat üretimini destekler.
- Stratejik Değer: Model doğrulamasını hızlandırarak devam/dur karar verme süreçlerini ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Genetik olarak mühendisliği yapılmış modellerin risk ayarlı önceliklendirilmesini ve geliştirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- CRISPR tasarımı, plazmit konstrüksiyonu ve Drosophila genetiği konularında uzmanlık gerektirir.
- PCR, Sanger sekanslama ve konfokal mikroskopi altyapısına erişim gereklidir.
- Genotipleme ve tarama protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Drosophila modellerindeki çeşitli gen hedeflerine ve etiketleme stratejilerine uyarlanabilir.
- Güvenilir sonuçlar için sgRNA tasarımının ve PCR primeri seçiminin özgüllüğüne bağlıdır.
