Name: IL-33 ile Uyarılmış Makrofajların, İdiyopatik Pulmoner Fibroz Üzerindeki Etkilerini In Vivo Olarak İncelemek için Bleomisin Kaynaklı Fare Modellerine Evlat Edinilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Öğrenin, IL-33 ile uyarılmış akciğer interstisyel makrofajlarının izolasyonunu ve evlat edinilmesini fare modelinde. Bu yöntem, idiyopatik pulmoner fibrozun in vivo incelenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Jiangnan Üniversitesi Laboratuvar Yönetimi Özel Konusunu kabul etmektedir: Patolojik Örneklere Dayalı Dijital Dilim Kütüphanesinin Yapımı (JDSYS202223) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81800065).

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan deneyleri Jiangnan Üniversitesi Deneysel Hayvan Refahı Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (JN No. 20211130m1720615[501]).
NOT: Bu çalışmada 6-8 haftalık ve 20-25 g ağırlığında toplam 10 erkek C57BL/6 fare kullanılmıştır. Çalışmadaki üç deney grubu, her biri üç alıcı fareyi içeriyordu ve IM izolasyonu için bir konakçı fare kullanıldı.
1. Fare pulmoner makrofajlarının tükenmesi
<ol><li>Klodronat lipozomların şişesini ( Malzeme Tablosuna bakınız) buzdolabından 30 dakika önceden çıkarın, oda sıcaklığına ısıtın ve düzgün bir karıştırma sağlamak için birkaç kez ters çevirin. NOT: Klodronat lipozomlar hidrofilik diklorometilen bifosfonat moleküllerini kapsüller. Bu lipozomlar makrofajlar tarafından tüketildiğinde, klodronat lizozom fosfatazın etkisiyle yavaş yavaş salınır ve bunun sonucunda birikimi hücre apoptozunu ve makrofajların tükenmesini tetikler7.</li>
	<li>Fareleri % 3 izofluran ile uyuşturun. Bilinci kontrol etmek için bir ayağınızı sıkıştırarak anestezinin derinliğini kontrol edin. Anestezi altında kuruluğu önlemek için her iki göze veteriner merhem uygulayın.</li>
	<li>Steril emme ucuna sahip bir pipet kullanarak 60 μL klodronatlı lipozomları aspire edin. İlacı, anestezi uygulanan farenin burun boşluğuna damla damla uygulayın, böylece fare nefes aldığında, ilaç trakeaya solunur. Her damladan sonra, farenin ilacı tamamen soluduğundan ve eşit şekilde nefes aldığından emin olun. PBS içeren lipozomları tek başına kontrol8 olarak uygulayın (Şekil 2).</li>
	<li>İyileşmelerini hızlandırmak için fareleri yeniden ısınmak üzere 38 ° C sabit sıcaklık tablosuna yerleştirin. Uyanana kadar fareleri izleyin. Fareler iyi iyileştikten ve sternal yatışmayı başardıktan sonra, onları kafese aktarın.</li>
	<li>Transfer deneyi için alıcı fareler olarak klodronat lipozomlarla tedaviden 2 gün sonra tükenmiş alveoler makrofajlı fareleri kullanın. NOT: Bu çalışmada, alveoler makrofajların tükenmesi, klodronatlı lipozomların inhalasyon yoluyla uygulanmasınıtakiben daha önce tarif edildiği gibi makrofaj belirteçlerinin ekspresyonu kontrol edilerek doğrulanmıştır (bakınız Ek Şekil 1).</li>
</ol>2. IM'lerin izolasyonu ve kültürü
<ol><li>Konakçı fareyi intraperitoneal Ketamin (120 mg / kg) ve Xylazine (16 mg / kg) enjeksiyonu ile uyuşturun. Ayak parmağı sıkışma refleksinin kaybıyla anestezinin derinliğini onaylayın. Anestezi altında kuruluğu önlemek için her iki göze veteriner merhem uygulayın. Ardından, anestezi uygulanan farenin cildini% 75 alkol ve iyotla dezenfekte edin. Cildi kesmek ve kardiyopulmoner dokuyu açığa çıkarmak için makas kullanın</li>
	<li>20 G iğne ile bir şırıngada 10 mL 1x PBS aspire edin ve iğnenin ucunu farenin sağ atriyumuna yerleştirin (Şekil 3A). Farenin inferior vena kavasını cerrahi makasla kesin ve ardından akciğer dokusu beyaza dönene kadar fareyi PBS ile sabit bir hızda (10-20 mL / dak) manuel olarak perfüze edin. Akciğer dokusunu eksize edin ve bir kültür kabında buz gibi soğuk PBS'ye aktarın (Şekil 3B).</li>
	<li>Akciğer dokusunu yaklaşık 2 mm x 2 mm x 2 mm parçalara ayırın. Daha sonra, makrofajları izole etmek için akciğer dokusuna% 1 kollajenaz A içeren 15 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) ekleyin. 100 rpm'de 37 °C sallama masasında 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Akciğer dokusu süspansiyonunu mümkün olduğunca ince hale getirmek için 10 mL'lik bir şırıngadan en az 20 kat aspire edin. Bu süspansiyonu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Filtreyi 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Peletteki kırmızı kan hücrelerini, 2-3 dakika boyunca buz üzerine 3 mL RBC lizis tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek lize edin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 150 x g'de santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 10 mL DMEM (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içerir) ile yeniden askıya alın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Hücreleri 2 x 10 7 hücre/tabakta 10 cmyapışkan hücre kültürü kaplarına tohumlayın ve 37 °C'de ve %5 CO2'de 1 saat inkübe edin. Bu, akciğer IM'lerinin çanak 5'e yapışmasınısağlar. 1 saat sonra, süpernatant ve yüzen hücreleri aspire edin ve 10 mL taze tam kültür ortamı ekleyin (% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içeren DMEM). 8 saatten fazla veya bir gecede inkübe edin.</li>
	<li>Daha önceaçıklandığı gibi F4/80 ve CD11c belirteçleri için boyama ile akış sitometrisi kullanarak elde edilen IM'lerin saflığını belirleyin (bkz. Ek Şekil 1).</li>
</ol>3. IM'lerin akciğer alveollerine evlat edinilerek aktarılması
<ol><li>İzole pulmoner IM'leri içeren plakadaki kültür ortamını (adım 2.7), IM'leri uyarmak için 10 ng / mL IL-33 içeren tam bir kültür ortamı ile değiştirin. 37 ° C'de 24 saat ve % 5 CO2'de inkübe edin. Kontrol olarak IL-33 yerine 1x PBS kullanın.</li>
	<li>Pulmoner IM'leri 5 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin ile tedavi ederek ayırın. Daha sonra, 3 mL taze kültür tam ortamı ekleyerek sindirimi söndürün ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 150 x g ve 4 ° C'de santrifüj ederek pulmoner makrofajları toplayın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve PBS'deki hücreleri 5 x 105 hücre / 50 μL'lik son bir konsantrasyona kadar yeniden askıya alın.</li>
	<li>Alıcı fareleri% 3 izofluran gazı ile uyuşturun. Farenin bilinçsiz hale gelmesini bekleyin (adım 1.2'de olduğu gibi) ve ardından anestezi uygulanan farenin uzuvlarını tıbbi bantla dikey bir plakaya sabitleyin. Pamuklu çubukla farenin dilini yavaşça bir tarafa doğru çekin.</li>
	<li>Entübasyon lambasını açın ve trakeanın görülebilmesi için farenin boğazına parlatın. Trakeanın dilin tabanına yakın olduğunu, yemek borusunun boynun arkasına yakın olduğunu, ancak yemek borusunun açılmasının operasyon sırasında görünmediğini kontrol edin.</li>
	<li>Fareyi entübe etmeye yardımcı olması için entübasyon lambasını (22 G) kullanın. Yerleşik iğne kanülünü trakeaya bir kılavuz tel (0,4 mm çapında) ile yönlendirin. Entübasyonu tamamlamak için kılavuz teli çıkarın ve kanülü fare trakeasına itin.</li>
	<li>Kanülün trakeaya girdiği gözlendikten sonra, trakea yoluyla alıcı fareye 50 μL hücre süspansiyonu (5 x 105 IM içeren) enjekte edin.</li>
	<li>İyileşmeyi hızlandırmak için fareleri yeniden ısınmak üzere 38 ° C sabit bir ısıtma yastığına yerleştirin. Uyanana kadar fareleri izleyin. İyileştikten ve sternal yatışmayı başardıktan sonra, onları kafese aktarın.</li>
	<li>24 saat sonra, İPF'yi indüklemek için trakea yoluyla (3.3-3.5. adımlardaki prosedürü kullanarak) 1.4 U / kg vücut ağırlığı dozunda bleomisin (BLM) uygulayın. Kontrol grubuna eşit miktarda salin uygulayın.</li>
	<li>21 gün sonra, fibroz için belirteçlerin ekspresyonunu ve Ashcroft skorları10'u değerlendirerek, PBS veya IL-33 ile uyarılmış IM süspansiyonu ile evlat edinilen farklı fare grupları için pulmoner fibrozun ciddiyet derecesini belirleyin.<ol><li>Bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanarak akciğer dokusundan toplam RNA'yı çıkarın (bakınız Malzeme Tablosu). NOT: Kantitatif analiz mikroplaka okuyucu ile gerçekleştirilmiştir. OD260/OD280 oranı 1.8-2.0 ise RNA saflığı yüksektir. Tüm örnekler −80 ° C'de saklandı.</li>
		<li>Spesifik primerler kullanarak α-düz kas aktini (SMA) ve fibronektinin ekspresyonunu değerlendirmek için floresan kantitatif PCR uygulayın. NOT: α-SMA için kullanılan primerler ileri 5'- GACGCTGAAGTATCCGATAGAACACG-3' ve ters 5'-CACCATCTCCAGAGTCCAGCACAAT-3' idi ve fibronektin için kullanılan primerler ileri 5'-TCTGGGAAATGGAAAAGGGGAATGG-3' ve ters 5'-CACTGAAGCAGGTTTCCTCGGTTGT-3' idi.</li>
	</ol></li>
	<li>İmmünohistokimyayı aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.<ol><li>Sol akciğeri dehidrate edin, gömün ve bir parafin dilimleyici ile 4 μm kalınlığa kadar dilimleyin.</li>
		<li>Doku bölümlerini slaytların üzerine yerleştirin ve slaytları 65-70 ° C'de bir fırında 30 dakika ila 1 saat pişirin. Slaytları 5 dakika boyunca azalan alkol yüzdesiyle (yani% 100,% 95,% 90,% 80 ve% 70 alkol) balmumundan arındırın.</li>
		<li>Slaytları hematoksilin boya çözeltisinde (analitik olarak saf) 5 dakika boyunca lekeleyin. Ardından, slaytları musluk suyuyla yıkayın. Slaytları 3 sn boyunca% 1 hidroklorik asit alkolüne batırın, yüzen rengi yıkayın ve 5 dakika boyunca akan suya batırın. Bölümler maviye döner.</li>
		<li>Eosin çözeltisine 10 s ila 1 dakika daldırın (renge göre boyama süresini belirleyin), musluk suyuyla yıkayın ve her biri 5 dakika boyunca sırasıyla% 70,% 80,% 95,% 100 ve% 100 alkol koyun. Ardından, slaytları 3 dakika boyunca ksilen I ve ksilen II çözeltilerine yerleştirin. Kuruduktan sonra, nötr yapışkan sızdırmazlık filmi ile dikey mikroskop altında gözlemleyin ve fotoğraf çekin.</li>
		<li>Pulmoner fibrozis10'un şiddetini göstermek için kesitlerde Ashcroft skorlaması yapın. İki bağımsız numunenin t-testini kullanarak verilerin istatistiksel analizini yapın.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+immunity+in+IPF+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment.</a> Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+circular+RNA+expression+patterns+in+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).</li>
<li>Lee, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophages+in+the+development+of+acute+and+chronic+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases.</a> Cells. 10 (4), 897(2021).</li>
<li>Luzina, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-33+potentiates+bleomycin-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).</li>
<li>Nie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKT2+regulates+pulmonary+inflammation+and+fibrosis+via+modulating+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).</li>
<li>Qian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+PU.1+promotes+alternative+macrophage+polarization+and+asthmatic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation.</a> Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).</li>
<li>Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes%3A+Advancements+and+innovation+in+the+manufacturing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).</li>
<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+critical+for+broadly-reactive+antibody-mediated+protection+against+influenza+A+virus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice.</a> Nature Communications. 8 (1), 846(2017).</li>
<li>Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+alveolar+macrophages+attenuates+acute+ventilator+induced+lung+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats.</a> Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).</li>
<li>Hübner, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quantification+of+pulmonary+fibrosis+in+histological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples.</a> Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).</li>
<li>Tacke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+monocytes+acquire+antigens+from+other+cells+in+the+bone+marrow+and+present+them+to+T+cells+after+maturing+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).</li>
<li>Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophages%3A+A+new+therapeutic+pathway+in+fibrosing+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).</li>
<li>Wendisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+triggers+profibrotic+macrophage+responses+and+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis.</a> Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+Friend+or+foe+in+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Respiratory Research. 19 (1), 170(2018).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları yoktur.

Bu çalışma, farelerde pulmoner fibroz mekanizmalarını incelemede yardımcı olabilecek makrofajları tüketmek, izole etmek, kültürlemek ve aktarmak için etkili bir yöntem sunmaktadır. Fare makrofaj tükenmesi için trakea uygulaması, kuyruk damarı enjeksiyonu ve burun inhalasyonu gibi birçok yöntem vardır11. Bu çalışma, kullanımı kolay olan ve pulmoner makrofajları etkili bir şekilde tüketebilen nazal inhalasyon yöntemini optimize etmiştir 8,9....

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.
Step 2.1 of the Protocol was updated from:
Anesthetize the host mouse with 3% isoflurane, and then euthanize it by cervical dislocation. Disinfect the skin of the euthanized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue
to:
Anesthetize the host mouse&#160;with an intraperitoneal injection of Ketamine (120 mg/kg) and Xylazine (16 mg/kg). Confirm the depth of anesthesia via loss of the toe pinch reflex. Apply veterinary ointment to both eyes to prevent dryness under anesthesia. Then, disinfect the skin of the anesthetized mouse with 75% alcohol and iodine. Use scissors to cut through the skin and expose the cardiopulmonary tissue

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64742">Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

İdiyopatik pulmoner fibrozis (İPF), birçok faktörün neden olduğu yaygın pulmoner inflamatuar bir hastalıktır1. Th1 ve Th2 immün yanıtının sitokin mikroortamında, makrofajlar klasik olarak aktive edilmiş makrofajlara (M1) ve alternatif olarak aktive edilmiş makrofajlara (M2) polarize edilebilir. Lipopolisakkaritler (LPS) veya sitokin IFN-γ, M1 makrofajlarını polarize etmeye ve iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α ve IL-12 dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinler üretmeye indükler. Buna karşılık, tip II sitokinler IL-4 ve IL-13, pulmoner fibroz2'yi destekleyen TGF-β ve PDGF gibi farklı fibroblast büyümesini teşvik eden faktörler üretebilen M2 makrofajlarının polarizasyonunu yönlendirir. İPF'nin patolojik sürecine makrofaj aktivasyonu ve infiltrasyonu eşlik eder. İPF, sitokinlerin salınımı yoluyla yaralanma onarımı, inflamasyon ve fibrozise aracılık eder3. Sadece sınırlı tedavi seçenekleri mevcut olduğundan, İPF'nin moleküler patolojik mekanizmalarının araştırılması, İPF'nin önlenmesi ve tedavisi için yeni stratejilerin geliştirilmesinde büyük önem taşımaktadır. Grubumuz ve diğer araştırmacılar tarafından yapılan önceki çalışmalar 4,5, İPF hastalarında ve bleomisin (BLM) ile indüklenen İPF'li fare modellerinde IL-33'ün salınımının arttığını doğrulamıştır. IL-33, fibroz sırasında epitel ve endotel hücreleri tarafından salınır ve makrofaj aktivasyonunda rol oynar, bu da fibroblastların anormal proliferasyonu, lökosit infiltrasyonu ve nihayetinde akciğer fonksiyon kaybına neden olur5. Mevcut protokol, IL-33 ile uyarılmış interstisyel makrofajların (IM'ler) fare modellerinde İPF gelişimini incelemek için bir araç olarak alveollere evlat edinilmesini tanımlamaktadır. Burada, IM'ler konakçı farelerin akciğer dokusundan izole edildi, in vitro kültüre alındı, 24 saat boyunca IL-33 ile uyarıldı ve daha sonra trakeal enjeksiyon yoluyla alıcı farelerin alveollerine evlat edinildi. Uyarılmış fare makrofajlarının doğrudan toplanması ve alıcı alveollere evlat edinilerek aktarılmasının pulmoner fibrozis derecesini ağırlaştırdığı ve uyarıcı faktörlerin fibroz üzerindeki etkisini önceki çalışmalara kıyasla daha net bir şekilde gösterebildiği bulunmuştur6. Bu makalede açıklanan teknik, araştırmacıların İPF'nin gelişiminde potansiyel sitokinler tarafından uyarılan makrofajların işlevini keşfetmelerini sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; DMEM</td><td>Yaşam teknolojileri Biyoteknoloji, ABD</td><td>1508012</td><td></td></tr><tr><td>Arteriyel kalıcı iğne</td><td>B Braun Melsingen AG, Almanya</td><td>21G15G8393</td><td></td></tr><tr><td>BD & nbsp; Doğruluk&nbsp; C6 Plus</td><td>Becton Dickinson, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleomisin</td><td>Biotang, ABD</td><td>Ab9465</td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit inkübatörü</td><td>Thermo Forma, ABD</td><td>Thermo Forma370</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>R& D Sistemleri, ABD</td><td>1124F</td><td></td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Ar-Ge D Systems, ABD</td><td>N418</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü kabı</td><td>Thermo Forma, ABD</td><td>174926</td><td></td></tr><tr><td>Klrodronat lipozomları&nbsp;</td><td>Klononat lipozomlar, Hollanda</td><td>CI-150-150</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz A</td><td>Sigma-Aldrich, ABD</td><td>10103578001</td><td></td></tr><tr><td>F4 / 80</td><td>R& D Systems, ABD</td><td>521204</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeci</td><td>Becton, Dickinson ve Şirketi, ABD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td> <td>Yaşam teknolojileri, ABD</td><td>1047571</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksilen Eozin ve nbsp;</td><td>Nanjing Jiancheng Teknolojisi, Çin</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 PCR tespit sistemi</td><td>Roche, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murin rekombinant faktörü IL-33</td><td>Peprotech, ABD</td><td>210-33</td><td></td></tr><tr><td>Nikon mikroskobu</td><td>Nikon Corporation, Japonya</td><td>941185</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin, streptomisin</td><td>Yaşam teknolojileri, ABD</td><td>877113</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tampon (PBS)</td> <td>Guangdong Huankai Mikrobiyal Teknolojisi, Çin</td><td>1535882</td><td></td></tr><tr><td>RBC lizis tamponu</td><td>Beyotime Biyoteknoloji Şirketi, Çin</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>RNA İzolater</td><td>Vazyme şirketi, Çin</td><td>R401-01-AA</td><td>Toplam RNA ekstraksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>RWD İnhalasyon Anestezi Makinesi</td><td>Shenzhen Rayward Yaşam Teknolojisi, Çin</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>Yarı otomatik parafin dilimleyici</td><td>Leica, Almanya</td><td>LeicaRM2245</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara, Japonya</td><td>410800</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin 0.25%</td><td>Life Technologies, ABD</td><td>1627172</td><td></td></tr></tbody></table>

il-33 ile uyarılmış makrofajların, İdiyopatik pulmoner fibroz Üzerindeki etkilerini in vivo olarak İncelemek için bleomisin kaynaklı fare modellerine evlat edinilmesi

Adoptive Transfer of IL-33-Stimulated Macrophages into Bleomycin-Induced Mouse Models to Study Their Effect on Idiopathic Pulmonary Fibrosis In Vivo

Erken akciğer hasarının neden olduğu enflamatuar yanıt, makrofajlar ve nötrofiller gibi enflamatuar hücrelerin aktivasyonunun yanı sıra TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi enflamatuar faktörlerin salınımının eşlik ettiği idiyopatik pulmoner fibroz (İPF) gelişiminin önemli nedenlerinden biridir. IL-33 stimülasyonuna yanıt olarak aktive pulmoner interstisyel makrofajların (IM) neden olduğu erken inflamasyonun İPF'nin patolojik sürecinde hayati bir rol oynadığı bilinmektedir. Bu protokol, IL-33 tarafından uyarılan IM'lerin İPF gelişimini incelemek için farelerin akciğerlerine evlat edinilmesini açıklamaktadır. Birincil IM'lerin konakçı fare akciğerlerinden izolasyonunu ve kültürünü, ardından uyarılmış IM'lerin bleomisin (BLM) ile indüklenen IPF alıcı farelerin (daha önce klodronat lipozomlarla tedavi edilerek alveoler makrofajların tükenmiş olan) alveollerine evlat edinilmesini ve bu farelerin patolojik değerlendirmesini içerir. Temsili sonuçlar, IL-33 ile uyarılmış makrofajların evlat edinilerek transferinin farelerde pulmoner fibrozisi şiddetlendirdiğini ve makrofaj evlat edinme transfer deneyinin kurulmasının İPF patolojisini incelemek için iyi bir teknik araç olduğunu göstermektedir.

Burada kullanılan protokol Şekil 1'deki akış şemasında özetlenmiştir. Klodronatlı lipozomların burun yoluyla solunması (Şekil 2), yetişkin C57BL / 6 farelerinin pulmoner makrofajlarını tüketmek için kullanıldı ve bu da iyi bir alıcı fare modeli üretti. Pulmoner IM'ler tedavi edilmemiş (konakçı) başka bir fareden izole edildi (Şekil 3A,B) ve in vitro olarak kültürlendi. İzole edilen makrofajlar 24 saat boyu...

Bu protokol, pulmoner interstisyel makrofajların (IM) izolasyonunu ve bir fare modelinde akciğer alveollerinin IL-33 stimülasyonundan sonra evlat edinilen transferlerini tanımlar ve bu da idiyopatik pulmoner fibrozun (İPF) in vivo çalışmasını kolaylaştırabilir.

IL-33 ile Uyarılmış Makrofajların, İdiyopatik Pulmoner Fibroz Üzerindeki Etkilerini In Vivo Olarak İncelemek için Bleomisin Kaynaklı Fare Modellerine Evlat Edinilmesi

The inflammatory response caused by early lung injury is one of the important causes of the development of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), which is ...

Protokol, bir fare modelinde IL-33 tayininden sonra pulmoner IMS'nin izolasyonunu ve adoptif transferini açıklamaktadır ve bu da idiyopatik pulmoner fibrozisin in vivo çalışmasını kolaylaştırabilir. Bu teknik, araştırmacıların IPF gelişiminde geleneksel sitokinler tarafından simüle edilen makrofajların işlevini keşfetmelerini sağlar. Başlamak için, klodronatlı lipozomların şişesini buzdolabından çıkarın.Oda sıcaklığında 30 dakika ısınmasına izin verin ve düzgün bir karıştırma sağlamak için birkaç kez ters çevirin. Steril emme ucuna sahip bir pipet kullanarak 60 mikrolitre klodronat lipozomu aspire edin. Kontrol ve ilacı anestezi uygulanan farenin burun boşluğuna damla damla uygulayın.Her damladan sonra, farenin ilacı tamamen soluduğundan ve eşit şekilde nefes aldığından emin olun. Alıcı farede alveoler makrofajların tükenmesinden sonra, anestezi uygulanan konakçı farenin derisini% 75 alkol ve iyot ile dezenfekte ederek başlayın. Cildi kesmek ve kardiyopulmoner dokuyu açığa çıkarmak için makas kullanın.20 ayarlı bir iğne ile donatılmış bir şırıngada 10 mililitre PBS aspire edin ve iğnenin ucunu farenin sağ atriyumuna yerleştirin. Daha sonra farenin inferior vena kavasını cerrahi makasla kesin ve akciğer dokusu beyaza dönene kadar fareyi PBS ile dakikada 10 ila 20 mililitre sabit bir hızda manuel olarak perfüze edin. Ayrıca, akciğer dokusunu eksize edin ve bir kültür kabında buz gibi PBS'ye aktarın.Akciğer dokusunu parçalara ayırın ve makrofajları izole etmek için% 1 kollajenaz A içeren 15 mililitre DMEM ortamı ekleyin, ardından 37 santigrat derece sallama masasında 30 dakika boyunca 100 RPM'de inkübe edin. Akciğer dokusu süspansiyonunu, ince hale getirmek için 10 mililitrelik bir şırıngadan yaklaşık 20 kez aspire edin. Süspansiyonu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin.Filtreyi 400 G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı attıktan sonra, kırmızı kanı iki ila üç dakika boyunca buz üzerinde üç mililitre hücre lizis tamponu ile lize edin. Beş dakika boyunca 150 G'de santrifüj yapın ve hücre peletini 10 mililitre DMEM'de yeniden askıya alın.Daha sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri 10 santimetrelik yapışkan bir hücre kültürü kabına tohumlayın ve akciğer interstisyel makrofajlarını bulaşıklara yapıştırmak için 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, süpernatant ve yüzen hücreleri aspire edin.10 mililitre taze, eksiksiz kültür ortamı ekleyin ve sekiz saatten fazla veya bir gecede inkübe edin. İzole interstisyel makrofajları uyarmak için, harcanan kültür ortamını tam bir orta interlökinler 33 ile değiştirin. Ayrıca interlökinler 33 yerine PBS ekleyerek bir kontrol plakası hazırlayın.Plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Pulmoner interstisyel makrofajları ayrıştırmak için, beş dakika boyunca bir mililitre% 0.25 tripsin ile tedavi edin. Daha sonra sindirimi söndürmek için üç mililitre taze kültür tam ortamı ekleyin ve pulmoner makrofajları toplamak için hücre süspansiyonunu santrifüj edin.Hücreleri saydıktan sonra, PBS'deki hücreleri 50 mikrolitre başına beş kez 10 ila beşinci hücrelerin son konsantrasyonuna geri getirin. İnterstisyel makrofajların transferine başlamak için, anestezi altındaki alıcı farenin uzuvlarını tıbbi bantla dikey bir plakaya sabitleyin ve pamuklu çubukla farenin dilini yavaşça bir tarafa çekin. Entübasyon lambasını açtıktan sonra, dilin tabanına yakın olması gereken trakeayı görmek için farenin boğazına parlatın.22 gauge entübasyon lambasını ve 0,4 milimetre çapındaki kılavuz telini kullanarak yerleşik iğne kanülünü trakeaya yerleştirin. Entübasyonu bitirmek için, kılavuz teli çıkarın ve kanülü fare trakeasına itin. Şimdi hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini, kanülün trakeaya girdiği görüldüğünde trakea yoluyla alıcı fareye enjekte edin.24 saat sonra, idiyopatik pulmoner fibrozisi indüklemek için trakea yoluyla bleomisin uygulayın. Ayrıca kontrol grubuna eşit miktarda salin uygulayın. 21 gün sonra, fibroz için belirteçlerin ekspresyonunu ve Ashcroft skorlarını değerlendirerek pulmoner fibrozun ciddiyet derecesini belirleyin.HE boyaması, interlökinlerin 33 uyarılmış makrofajların evlat edinilerek transferinin, akciğer dokusu yıkımının derecesini şiddetlendirdiğini ve bleomisin ile uyarılmış farelerde fibroblast agregasyonunu arttırdığını göstermiştir. Ashcroft skorundaki artış ayrıca pulmoner fibrozun derecesini de göstermektedir. Alıcı farenin akciğer dokularında alfa SMA ve fibronektinin mRNA'sının ekspresyon seviyeleri, evlat edinilen interlökinler içeren 33 uyarılmış interstisyel makrofajlar ve bleomisin ile tedavi edildi, BLM ile tedavi edilen vahşi tip farelerinkilere kıyasla daha yüksekti.Kanüldeki hücre süspansiyonunun akciğer dokusuna tamamen girebilmesini sağlamak için bir milimetrelik bir şırınga ile akciğerlere hemen 500 mikrolitre hava girilmelidir.

adoptive-transfer-il-33-stimulated-macrophages-into-bleomycin-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz bir non-invaziv multimodal bleomycin Çift Kişilik boğaza korumak tarafından indüklenen fare akciğer fibrozis modelinin boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı yaklaşım Imaging tanımlamak.

Yaklaşım Imaging Multimodal Bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis farelerde boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı

Biz önceden airways yaralanma ile Klima tarafından fare ciğerlerine akciğer kanser hücrelerinin orthotopic engraftment önemli ölçüde geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım aynı zamanda akciğer microenvironment, metastatik yayılması, akciğer kanseri komorbiditeler içinde stromal etkileşimleri çalışmaya uygulanabilir ve daha verimli bir şekilde hasta oluşturmak için xenografts türetilmiş.

Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır

Burada, C57BL yılında bleomisin endotrakeal enjeksiyonu ile akciğer yaralanması indüksiyonu sonrasında tüm göbek kordonundan elde edilen intravenöz infeksiyon insan mezenkimal stromal hücrelerin Antifibrotik aktivitesini araştırmak için etkili bir yöntem sunuyoruz. /6 fare. Bu protokol, diğer terapinin preklinik testine kolayca uzatılabilir.

Bleomisin endotrakeal enjeksiyon tarafından fare akciğer hasarı indüksiyon

Pulmoner fibrozisin patogenezini aydınlatmak ve yeni ilaç hedefleri bulmak için bleomisin kullanılarak çeşitli hayvan pulmoner fibrozis modelleri oluşturulmuştur. Bununla birlikte, akciğer dokusunu hedef alan çoğu pulmoner fibroz modelinde eşit olmayan ilaç uygulaması vardır. Burada, nazal bleomisin nebulizasyonunun neden olduğu tek tip pulmoner fibrozis modelini öneriyoruz.

Nazal Bleomisin Nebulizasyonunun Neden Olduğu Pulmoner Fibrozisin Bir Fare Modeli

Burada, lezyon tarafında intratrakeal damlatma yoluyla tek taraflı bleomisin ile indüklenen pulmoner fibrozis modelinde ventilasyon bölgelerini ölçmek için mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) kullanan bir protokol sunuyoruz.

Preklinik Modellerde Pulmoner Fibrozisin Gelişmiş Değerlendirmesi için Mikro-BT Kullanılarak Tek Taraflı Akciğer Hacmi Analizi

Bu protokol, pulmoner fibrozisin bleomisin murin modelinde kullanılmak üzere orofaringeal aspirasyon tekniğini göstermektedir.

Pulmoner fibrozisin murin modelinde bleomisinin orofaringeal uygulaması

Hücre tedavisi, hasarlı dokuyu onarmak ve akciğer fonksiyonunu iyileştirmek için progenitör hücreleri kullanarak pulmoner fibroz için umut verici bir müdahale sunar. Görüntüleme, hücre entegrasyonunun izlenmesinde çok önemli bir rol oynadığından, burada, bir fare modelinde pulmoner fibroz için hücre tedavisinin manyetik parçacık görüntüleme kılavuzluğunda in vivo takibini açıklıyoruz.

Manyetik Parçacık Görüntüleme Kullanılarak Pulmoner Fibroz için Nakledilen Distal Akciğer Epitelyal Progenitör Hücrelerinin Görüntü Kılavuzluğunda In Vivo İzlenmesi

Bu protokol, tekrarlanan orofaringeal bleomisin uygulaması yoluyla farelerde pulmoner fibrozu indüklemek için bir yöntemi tanımlar ve idiyopatik pulmoner fibrozisunkine çok benzeyen patolojik özellikler verir.

İdiyopatik Pulmoner Fibrozisin Rafine Murin Modeli

Burada, trakea yoluyla taşınan aerosol bleomisin kullanarak farelerde pulmoner fibrozisin modeli için bir protokol sunuyoruz. Bu optimize edilmiş yöntem, cerrahi kesi olmadan tekiz, nicel ve hassas bir doğum sağlar ve bleomisin kaynaklı fibrozun tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini artırır.

Tekrarlanabilir ve minimal invaziv fare modelleri için Rafine Aerosol Tabanlı intratrakeal bleomicin teslimat yöntemi

Tümör hücrelerinin T hücre etkileşimi analizi için deneysel bir akciğer metastazı ve CTL immünoterapi fare...

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Öğrenin, IL-33 ile uyarılmış akciğer interstisyel makrofajlarının izolasyonunu ve evlat edinilmesini fare modelinde. Bu yöntem, idiyopatik pulmoner fibrozun in vivo incelenmesini sağlar.

IL-33 ile Uyarılmış Makrofajların, İdiyopatik Pulmoner Fibroz Üzerindeki Etkilerini In Vivo Olarak İncelemek için Bleomisin Kaynaklı Fare Modellerine Evlat Edinilmesi (Video) | JoVE Journal

IL-33 ile Uyarılmış Makrofajların, İdiyopatik Pulmoner Fibroz Üzerindeki Etkilerini In Vivo Olarak İncelemek için Bleomisin Kaynaklı Fare Modellerine Evlat Edinilmesi

Daha fazla video keşfet