Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu
3 Mart 2023
Sunulan protokol, 96 kuyucuklu yüksek verimli bir diyaliz plakası kullanarak protein kristalleşme koşullarını ve kristal büyümesini taramak için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır. Mikrokristallerin büyük ölçekli büyümesi için diyalizör tüplerinin kullanımı, seri kristalografi ve MicroED uygulamaları için de gösterilmiştir.
Diyaliz ile kristalizasyon az kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, yapılandırılmış belirleme için şu anda mevcut olan kristalleşme stratejilerinin aralığını artıracak olan Novo yaklaşımını sunmaktadır. Bu tekniğin temel avantajları, yüksek verim olması, özel ekipman gerektirmeden kurulumunun basit olması ve kristal büyümesinin kolayca izlenmesine izin vermesidir.
Bu tekniği uygulayan kişi, düşük hacimli pipetleme ve çok kanallı pipetler kullanma konusunda rahat olmalıdır. Damlalar, kısmi dehidrasyonu önlemek için mümkün olduğunca yeterince pipetlenmelidir. Mikrodiyaliz deneyini kurmak için, piyasada satılan 96 delikli bir mikrodiyaliz plakasını protein tarafı yukarı doğru yerleştirin ve 200 mikron basınçlı yapışkan ara parçayı soyarak yapışkan kapak bandını çıkarın.
Yapışkan kapak bandını soyduktan sonra, A1 kuyusunun konumuna dikkat edin. Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak, her bir kuyucuğa maksimum 3,2 mikrolitre uygun şekilde hazırlanmış protein numunesi yükleyin. 200 mikron UV kapak filmini, film yukarı bakacak şekilde 96 delikli plakanın üzerine düzgün bir şekilde yerleştirin. Ardından, basınç yapıştırıcısını etkinleştirmek ve kapatmak için, bir sızdırmazlık küreği kullanarak UV kapak filmine bastırın ve bütünlüğünü kontrol edin.
Şimdi, tampon tarafına yukarı doğru getirmek için plakayı ters çevirin ve A1 işaretli kuyucuğun aynalı konumunu not edin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, plakanın her bir kuyucuğuna maksimum 350 mikrolitre diyaliz çözeltisi yükleyin ve kuyucukları rezervuar kapak filmi ile dikkatlice kapatın. Ardından, kristal büyümesine izin vermek için plakayı tampon tarafına yukarı doğru 20 santigrat derecede uygun bir sıcaklık kontrollü inkübatörün içine yerleştirin. Mikroskop altında kristal oluşumunu incelemek için, koruyucu kapak filmini 200 mikronluk UV kapak filminden çıkarın ve plakayı protein tarafı yukarı bakacak şekilde göz merceğinin altına yerleştirin.
Büyük ölçekli bir kristalleşme deneyi oluşturmak için, mikrodiyaliz plakasında mikro kristal büyümesinin meydana geldiği koşulları benimseyin ve aynı koşulları büyük kaplarda çoğaltın. Diyaliz çözeltisinin hacmine bağlı olarak kap boyutunu seçin. Kırmızı plastik kapağı kullanarak tüpü kapatmadan önce diyalizör tüpüne maksimum 500 mikrolitre protein numunesi pipetleyin.
Mühürlü 500 mikrolitrelik diyalizör tüpünü, diyaliz çözeltisi ile doldurulmuş kabın içindeki yüzer rafa yerleştirin. Daha sonra, kristal büyümesini sağlamak için kabı 20 santigrat derecede uygun bir sıcaklık kontrollü inkübatörün içine rahatsız edilmeden yerleştirin. Kristallerin oluşumunu kontrol etmek için, çözeltinin bir ila iki mikrolitresini diyalizörden bir cam kapak sürgüsüne pipetin.
Çözeltiyi slaytta başka bir cam slaytla örtün ve mikroskop altında görüntüleyin. Stereo yüksek büyütmeli bir mikroskop kullanılarak yakalanan görüntüler, 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme membranlarına sahip mikrodiyaliz plakaları kullanılarak dört proteinin başarılı mikrokristal oluşumunu gösterdi. Lizozimin, uygun katkı maddeleri içeren pH 4'te 0.1 molar sodyum asetata karşı diyalize edildiğinde kristaller oluşturduğu bulunmuştur.
Domatin, uygun katkı maddeleri içeren pH 6.6'da 0.1 molar bis-tris propan ile diyaliz edildiğinde kristaller oluşturdu. Optimize edilmiş diyaliz koşulları, membran proteinleri, yani E.coli çoklu ilaç efflux pompa proteini AcrB ve E.coli laktoz taşıyıcısı LacY tarafından mikrokristal oluşumuna yol açmıştır. Mikrodiyaliz deneylerinden elde edilen optimize edilmiş diyaliz koşullarını kullanan diyalizör tüplerindeki büyük ölçekli kristalleşme, proteinlerin her biri için binlerce mikrokristalin oluşmasına yol açmıştır.
Fomitinin kristalleşmesi için, diyaliz çözeltisinin 50 mililitresine karşı 250 mikrolitre protein diyalize edildi. AcrB için, 250 mikrolitre protein, 25 mikrolitre diyaliz çözeltisine karşı diyalize edildi. LacY kristalizasyonu da aynı oranda, 100 mikrolitre protein ila 10 mililitre diyaliz çözeltisi ile kuruldu.
Plakayı tampon tarafına doğru çevirirken, A1'in konumunu not etmek önemlidir, böylece kristalizasyon eleğinden gelen çözeltiler buna göre dağıtılabilir. Bu yöntemden elde edilen kristaller, seri kristalografi ve mikro ED gibi aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, 96 kuyuluklardan oluşan bir mikrodiyaliz plakası kullanarak protein kristalizasyon koşullarının taranması için yüksek verimli bir yöntemi tasvir etmektedir. Sıralı kristalografi ve MikroED uygulamalarında mikrokristalin büyümesini gösterir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Protein kristalizasyonu
- Yapısal biyoloji
- Kristalografya teknikleri
Arka Plan
- Kristalizasyon, protein kristalizasyonunda daha az yaygın bir yöntemdir.
- Bu yaklaşım, mevcut kristalizasyon stratejilerinin kapsamını artırır.
- Basitliği ve yüksek verimlilik kabiliyeti nedeniyle avantajlıdır.
- Kristal büyümenin izlenmesi bu yöntemle basittir.
Çalışmanın Amacı
- Protein kristalizasyonu için yeni bir yaklaşım sunmak.
- Mikrokristalin büyük ölçekli büyümesini kolaylaştırmak.
- Sıralı kristalografi ve MikroED uygulamaları için koşulları optimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Kristalizasyon için 96 kuyuluklardan oluşan bir mikrodiyaliz plakasının kullanılması.
- Protein numuneleri ve diyaliz çözeltilerinin kuyulara yüklenmesi.
- Kristal büyümesi için sıcaklık kontrollü inkübasyon.
- Kristal oluşumunun mikroskop ile incelenmesi.
Ana Sonuçlar
- Birden fazla protein için mikrokristal başarılı bir şekilde oluşturulmuştur.
- Optimize edilmiş koşullar binlerce mikrokristalin oluşumuna yol açmıştır.
- Lizozim, domatin, AcrB ve LacY için özel koşullar belirlenmiştir.
- Oluşturulan kristaller, sonraki uygulamalarda kullanılabilir.
Sonuçlar
- Yöntem, kristalizasyon koşullarını taramakta güvenilir bir yol sunar.
- Kristalizasyon deneylerinin kolayca ölçeklenmesini sağlar.
- Bu yaklaşım, proteinlerin yapısal belirlenimi için faydalıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-throughput protein crystallization via microdialysis enables rapid screening of crystallization conditions, supporting structural biology and drug discovery pipelines. This workflow increases predictive confidence in structure-based target validation and accelerates the transition from discovery to preclinical research. The approach is scalable, robust, and compatible with downstream applications such as serial crystallography and MicroED.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates rapid interrogation of protein structure-function relationships for target validation.
- Enables mechanistic de-risking by providing atomic-resolution structural data.
- Supports portfolio triage by identifying tractable targets through structural insights.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein crystals for downstream screening and biophysical assays.
- Standardizes crystallization conditions using SBS-compatible 96-well plates for reproducibility.
- Enables scalable production of microcrystals for high-throughput screening platforms.
- Supports reliable evaluation of protein-ligand interactions in structure-based drug design.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data with disease-relevant protein targets for translational biomarker development.
- Ensures continuity from discovery-stage structural elucidation to preclinical validation studies.
- Reduces risk in advancing candidates by providing robust structural evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This microdialysis-based crystallization method integrates seamlessly from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting iterative structure-guided optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through high-throughput structural analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers high-quality crystals suitable for X-ray and electron diffraction measurements.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting biomarker and target validation.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable platform for repeated use across diverse protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable crystallization workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust structural insights early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling and low-volume pipetting techniques.
- Needs access to standard crystallization laboratory infrastructure and microscopy for monitoring.
- Demands cross-team standardization for plate setup and data interpretation.
- Adaptable to a wide range of protein classes, including membrane proteins, as demonstrated.
- Limited by protein solubility and stability under dialysis conditions as noted in the protocol.
