Sıçan dorsal kök ganglion eksplantları ve schwann hücrelerinin bir kokültüründe periferik aksonların in vitro miyelinasyonu

Bu model, in vitro periferik sinir sisteminin miyelinasyonunun çeşitli yönlerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır. Miyelin nicelleştirmesini ve Akson-Schwann hücre etkileşimlerinin incelenmesini sağlar. Ko-kültür, 14. günden itibaren sağlam bir miyelinasyon geliştirir.

DRG eksplant kültürleri, ayrışmış nöronal kültürlere kıyasla bozulmamış yapısal mimarinin avantajını sağlar. Bu yöntem, periferik sinir sisteminin enflamatuar ve nörodejeneratif hastalıkları için tropotik bileşikleri taramak için kullanılabilir. Başlamak için, ötenazi sıçanın gövdesindeki çalışma alanını% 70 etanol ile sterilize edin.

Sıçanın sırt sol alt ekstremitesini makasla açın ve bisepsinin femoröz kasını dikkatlice çıkarın. Siyatik siniri kavisli forsepslerle düzgün bir şekilde yükselterek gevşetin ve sinirin çürümemesini sağlayın. Forseps kullanarak, kırpılmış sinirleri buz gibi soğuk Leibovitz'in L-15 ortamı ile mililitre gentamisin başına 50 mikrogram içeren bir doku kültürü kabına aktarın.

Daha sonra, bir stereo mikroskop kullanarak, yağ, kas ve kan damarlarını sinirlerden iki çift ince forseps ile çıkarın. Siyatik sinirin proksimal ve distal uçlarını tanımlayın ve proksimal sinir ucunu ikinci çift ince forseps ile tutarken proksimal ila distal yönde bir çift ince forseps ile epinöroyumu çıkarın. Saflaştırılmış sinirleri buz gibi soğuk Leibovitz'in Gentamisinli L-15 ortamı ile başka bir doku kültürü kabına aktardıktan sonra, iki çift ince forseps kullanarak tek sinir liflerini ayırmak ve izole etmek için izole sinir fasiküllerini kızdırın.

Sinir liflerini 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve mümkün olduğunca az ortam alın. Daha sonra 50 mililitre leibovitz'in L 15 ortamını gentamisin ile birkaç kez kesilmiş sinir liflerine ekleyin. Sinir liflerini içeren tüpü 188 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet kalan Leibovitz'in L-15 ortamı ile 60 milimetrelik bir doku kültürü kabına aktarın. 50 mililitrelik tüpü 10 mililitre enzimatik sindirim çözeltisi ile durulayın ve sinir lifleri kabına ekleyin. Sinir liflerini bir pipetin ucuyla tabağa dikkatlice dağıtın.

18 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ve HBSS'de% 40 FCS'de 10 mililitre ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Sindirilen sinirleri, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 188 G'de santrifüj yapmak için 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Süpernatanı attıktan sonra, peleti% 10 FCS ve mililitre gentamisin başına 50 mikrogram içeren 10 mililitre DMEM'de yeniden askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 188 G'de santrifüj yaptıktan sonra, peleti FCS ve gentamisin içeren dört mililitre DMEM ile yeniden askıya alın.

İki polilizin ve laminin kaplı 60 milimetre doku kültürü kabının her birine iki mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin, plakaları inkübatörde iki gün boyunca el değmeden bırakın. Schwann hücre süspansiyonunu 188 G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj edin ve hücre peletini 10 ila yedinci hücrelere bir kez 90 mikrolitre manyetik hücre ayırma tamponunda yeniden askıya alın.

Daha sonra yedinci hücrelere bir kez 10 kez 10 mikrolitre ti1 mikro boncuk ekleyin. Yeniden askıya alınmış çözeltiyi karanlıkta sekiz santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, manyetik hücre ayırma tamponuna hücre süspansiyonuna iki mililitre ekleyin.

Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj yaptıktan sonra, pelet 500 mikrolitre manyetik hücre ayırma tamponunda tekrar askıya alın. Manyetik hücre ayırma kolonunu hücre ayırıcıya yerleştirin ve kolonu manyetik hücre ayırma tamponunun bir mililitresi ile nemlendirin. Ardından, santrifüjleme için akışı toplamak için hücreleri ona uygulayın.

Uterusu ötenazi yapılmış hamile bir sıçandan dikkatlice çıkarın ve buz gibi HBSS ile 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin. Uterusu kavisli forseps kullanarak tutarak, uterus duvarını ince forsepslerle açın. Bir amniyotik çuvalı çıkarın ve ince forsepsli bir delik sıkıştırarak dikkatlice açın.

Tüm embriyoları uterustan hızla çıkarın ve HBSS ile dolu bir kaba aktarın. Nazikçe bir embriyo gövdesini HBSS ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir kaba yerleştirin. stereo mikroskop altında, embriyoyu iki yarıya bölmek için gövdenin dorsal kısmını açın.

Bir yarısını yana çevirin ve embriyonun dorsal kısmındaki çizgide bulunan dorsal kök gangliyonu veya DRG ipliğini tanımlayın. DRG'yi ince forseps ve mikro makas kullanarak bir bütün olarak kesin. DRG'yi iki mililitre HBSS ile doldurulmuş taze bir kaba yerleştirdikten sonra, ince forseps ve mikro makas kullanarak tek bir DRG'yi kalan dokudan ayırın.

Her bir kuyucukta 190 mikrolitre DRG büyüme ortamı içeren 4 kuyucuklu bir plaka alın ve ince forseps ve bir spatula kullanarak tek bir DRG'yi her bir kuyucuğun merkezine dikkatlice aktarın. Daha sonra DRG eksplant kültürlerini inkübatöre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak yerleştirin. Ertesi gün, her bir kuyucuğa dikkatlice 50 mikrolitre DRG büyüme ortamı ekleyin ve günlük mikroskop kullanarak DRG eksplant aderansını ve akson büyümesini gözlemleyin.

DRG eksplant kültürünün üçüncü gününde birlikte kültürleme için, DRG büyüme ortamını, kuyu başına 30.000 schwann hücresi içeren 250 mikrolitre ortak kültür ortamı ile dikkatlice değiştirin. İmmünositokimyasal boyama yapmak için, DPBS ile yıkanmış hücreleri% 4 paraformaldehit içinde 10 dakika boyunca inkübe ederek kapak fişlerindeki hücreleri sabitleyin. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak merkezdeki DRG eksplantını çevreleyen sekiz tanımlanmış bölgede immünositokimyasal olarak boyanmış örneklerin fotoğraflarını çekin.

Uzun ve iğ şeklinde bir morfolojiye sahip schwann hücrelerinin görünümü ve bir ko-kültürdeki ince DRG aksonları burada tasvir edilmiştir. Ko-kültürdeki miyelinasyon, DRG eksplantları ve Schwann hücrelerini miyelin bazik proteini veya MBP, beta üç tübülin ve DAPI için boyayarak farklı günlerde değerlendirildi. Eş-kültürdeki aksonal ağ yoğundu ve gözlemin zaman içinde gözle görülür bir şekilde değişmedi.

Miyelinasyonun ilk belirtileri, ko-kültürün 10. ve 12. günlerinde görüldü. 14. günden itibaren MVP sinyali daha belirgindi ve miyelin ile sarılmış aksonlar tespit edildi. Miyelinasyon, ko-kültür zamanı ile 20. güne kadar artmıştır.

Miyelinasyon, MVP ve beta üç tübülin pozitif alanlarının bir oranı olarak ölçüldü. Miyelinasyonda 18. ve 20. günlerde 10. güne kıyasla anlamlı bir artış gözlendi. DRG eksplant kültürleri kırılgandır ve dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.

Örneğin, inkübatörden çıkarıldığında veya orta değişim ve sabitleme sırasında. Miyelini daha ayrıntılı olarak araştırmak için ko-kültür örneklerinin gen ekspresyon analizi oluşturulabilir. Burada, 22. günde PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 miyelin belirteçlerini tespit ettik.