Name: Araştırma Hücre Kültürü Laboratuvarında Mantar ve Bakterilerin Kontaminasyonunu Önlemek İçin Hücre Kültürü Teknikleri ve Uygulamaları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: Öğrenin, araştırma laboratuvarlarında mantar ve bakteri kontaminasyonunu önlemek için hücre kültürü tekniklerini. Bu yöntemler, hücre canlılığını koruyarak sağlıklı kültürler elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nün (HHMI) finansmanı sayesinde mümkün olmuştur. Laboratuvar başkanımız Jue Chen'e makaleyi okuduğu ve sürekli desteği için, Donna Tallent'e yararlı düzenlemeleri ve yorumları için ve Rockefeller Üniversitesi Bilgi Teknolojisi Bölümü'nden Jeff Hennefeld'e bu makalenin video bileşenindeki yardımları için teşekkür etmek istiyoruz.

1. Hazırlıklar 
<ol><li>Genel<ol><li>Sadece hücre kültürü odasında giyilmek üzere belirlenmiş temiz bir laboratuvar önlüğü giyin ve laboratuvarın diğer bölümlerinde giyilmemelidir. NOT: Laboratuvar önlüğünün steril olması gerekmez.</li>
		<li>Başka hiçbir yüzeye dokunmamış yeni eldivenler giyin. Eldivenlerin sıkıca oturduğundan emin olun. Nitril, pudrasız eldivenler en iyisidir. NOT: Eldivenlerin steril olması gerekmez.</li>
		<li>İşe hazırlanmak için eldivenleri, laboratuvar önlüğü kollarını ve biyolojik güvenlik kabininin iç kısmına %70 EtOH püskürtün. Çalışma yüzeyini ve cam paneli tüy bırakmayan bir kağıt havluyla kurulayın. NOT: %70 EtOH kullanmak bakterileri en yüksek verimlilikle öldürür16. Kağıt havlunun steril olması gerekmez.</li>
		<li>Su banyolarını hücre kültürü odasının içinde tutun ve bunları sadece kültür ortamını ısıtmak veya hücreleri çözmek için kullanın. Su banyolarını haftada bir kez, üreticinin temizlik talimatlarını izleyerek boşaltın ve yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Biyolojik güvenlik kabininin içinde<ol><li>Kabine getirilen öğelerin sayısını sınırlayın. Ön veya arka ızgaraları bloke ederek biyolojik güvenlik kabini içindeki hava akışını kesmeyin. NOT: Havanın kabin içinde nasıl aktığına dair bir açıklama için Şekil 1'e bakınız.</li>
		<li>Dolabın içine yerleştirilen tüm eşyaları %70 EtOH ile püskürtün ve kurulayın. Medya şişesinin üst kısmını püskürterek ve aşağı doğru çalışarak başlayın. Benzer şekilde, temiz bir kağıt havluyla, kademeli olarak tabana doğru çalışarak kurulayın. Tekrar kapağa doğru gitmeyin.</li>
		<li>Kabin serolojik pipetleri barındıracak kadar büyükse, içine yerleştirilebilirler, aksi takdirde kabinin dışına monte edilmiş bir kapta saklanabilirler. Kullanmadan önce muhafazalı pipetin her iki tarafında da delik, yırtılma veya delinme olup olmadığını kontrol edin. Sargıyı sökmeyin. Bunun yerine, sargının uçlarını nazikçe soyun, serolojik pipeti bir pipet yardımcısına yerleştirin ve sargıyı tek bir akışkan hareketle çıkarın.</li>
		<li>Açık şişelerin veya şişelerin üzerine gelmeyin; Açık şişelerin veya şişelerin üzerine uzanın veya biyolojik güvenlik dolabında önceden açılmış eşyaların üst kısımlarındaki eşyaları açın. NOT: Kabin içindeki hava akımı çalışma yüzeyinde aşağı doğru itilir, bu nedenle örneğin manşonda bulunan herhangi bir kirlenme hücre kültürlerine girebilir.</li>
		<li>Sıvı dökmeyin. Bunun yerine, serolojik bir pipet kullanarak ekleyin. Medyayı tamamladıktan sonra, içeriği iyice karıştırın ve şişeyi başlatın. Ayrıca, medyanın desteklendiği şey için bir etiket eklediğinizden emin olun.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Yapışkan hücre hatları ile çalışma
<ol><li>Plastik bir şişeye ihtiyaç duyulursa, tüm torbayı püskürtün ve dolabın içine yerleştirin.</li>
	<li>Ortamı veya yıkama solüsyonlarını aspire etmek için otoklavlanmış cam pipetler veya tek kullanımlık steril plastik pipetler kullanın. Metal kapağı saklama kabından dikkatlice çıkarın. Bir cam pipeti, kabı bir açıyla hafifçe sallayarak izole edin. Kabın içine ulaşırken, diğer pipetlere dokunmaktan kaçının. NOT: Seçilen pipeti yalnızca bir uçtan tutun.</li>
	<li>Şişelerin üzerindeki kapakları mümkün olan en kısa sürede hızlı bir şekilde değiştirin. Kapakları çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin, böylece jant çalışma yüzeyine temas etmez. Kapağı üstten veya alttan tutmayın; bunun yerine, yanlardan kapaklara dokunun.</li>
	<li>Sıvıları aspire ederken, kabinin dışında bulunan bir vakum tuzağı şişesini zemindeki ikincil bir kapta kullanın. NOT: Torbalar sızacağından biyolojik tehlike altındaki atık torbalarına sıvı atık atmayın. Kabin içinde çalışırken atık oluşacaktır. Elleri kabine çok sık girip çıkarmak hava akışını keser. Herhangi bir atığı geçici olarak kabinin içinde bırakın. İşi kesintiye uğratmaması için yana doğru yerleştirin.</li>
	<li>Eldivenleri kuruduklarında cömertçe %70 EtOH ile püskürtün. Eldivenlerin ıslak damlamaması için ellerinizi birbirine sürün.</li>
	<li>Serolojik bir pipet yanlışlıkla kabindeki bir şeye dokunursa, dışarı atmaktan çekinmeyin. Kirlenmiş olabilecek bir pipet kullanmak yerine temiz bir serolojik pipetle yeniden başlayın.</li>
</ol>4. Hücrelerin kontrol edilmesi ve saklanması 
<ol><li>Hücreleri inkübatöre yerleştirmeden önce, mikroskop altında nasıl göründüklerini kontrol edin. Hücreler iyice askıya alınmışsa, tek hücreler gözlenmelidir.</li>
	<li>Konuşmayın, hapşırmayın, öksürmeyin veya inkübatörlere ağır nefes almayın. İnkübatör kapılarını hızla açın ve kapatın. Kapıları gerekenden daha uzun süre açık bırakmak, havada bulunan kirleticilerin inkübatörlere girmesine izin verebilir. NOT: Hücre kültürü odasında çalışırken maske takmak yardımcı olabilir, çünkü insan ağzında mikoplazma bulunabilir. Hücre kültürü odasında cep telefonu kullanmaktan kaçının, çünkü konuşma tavsiye edilmez.</li>
	<li>Şişeleri kabinden çıkarmadan önce tüm şişelerdeki kapakların sıkıca kapatıldığından emin olun.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını, ışığa duyarlı olduğu için kullanılmadığında karanlıkta 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Hücre kültürü çalışması tamamlandıktan sonra kabinin içine% 70 EtOH ile tekrar püskürtün ve yüzeyi bir kağıt havlu ile silin. Biyolojik tehlike çöp atık torbalarını boşaltın. Bu işlemi tekrarlayın ve farklı bir hücre hattına geçerken eldivenleri değiştirin.</li>
</ol>5. Süspansiyon hücre hatları ile çalışma
<ol><li>Cam şişelerde yetiştirilen süspansiyon hücreleri için, eldivenlerin% 70 EtOH ile iyice püskürtüldüğünden emin olun, ardından alüminyum folyoya ıslak eldivenlerle dokunun ve dolabın içine yerleştirmeden önce şişenin sadece altına püskürtün.</li>
	<li>Hücre sayımı için bir örnek alırken, kabından sadece bir adet 1,5 mL tüp çıkarın. Başka tüplere dokunmayın. Kapağı çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. İç kenara dokunmayın. Yanlardan dikkatlice tutun ve bittiğinde değiştirin.</li>
	<li>Şişenin tüm boynunu kaplayan çift katlı alüminyum folyo parçasını dikkatlice çıkarın. Folyo çıktıktan sonra cam şişeyi yalnızca alttan tutun - boynunuzdan dokunmayın. Hücre sayımı için örnek almak üzere 1 mL'lik bir serolojik pipet kullanın.</li>
	<li>Medyanın şişelerin yanından aşağı damlamasına izin vermeyin; eğer öyleyse,% 70 EtOH içeren bir kağıt havlu püskürtün ve hemen temizleyin.</li>
	<li>Şişeleri veya şişeleri biyolojik güvenlik dolaplarından çıkarmadan önce kapakların ve alüminyum folyoların sıkıldığından emin olun.</li>
</ol>6. Hücre inkübasyonu 
<ol><li>Farklı hücre tiplerinin çapraz kontaminasyonunu önlemek için farklı hücre tipleri için ayrı inkübatörler kullanın.</li>
</ol>7. Sıvı atık toplama
<ol><li>Sıvı atıkları, zemindeki dolabın dışında bulunan bir vakum kapanı şişesinde, 'Atık' etiketli ikincil bir kapta toplayın. NOT: Hortum, aylık olarak değiştirilen yüksek verimli bir partikül emici (HEPA) filtreye bağlanır.</li>
</ol>8. Temizleme
<ol><li>Biyolojik tehlike atık torbasını çıkarın ve cam şişeleri mümkün olan en kısa sürede yıkayın. Lavabonun yanında bir cam yıkama protokolü bulundurun. Yıkama protokolü için Ek Dosya 1'e bakın.</li>
	<li>Hücre kültürü cam eşyalarını bir cam yıkama tesisine göndermek yerine otoklavlayın. Laboratuvarın ana alanındaki cam eşyalardan ayrı tutun. NOT: SF-9 hücreleri, cam iyi temizlenmemişse, şişelerin yanında bir ölü hücre kenarı bırakır. Otoklav protokolü için Ek Dosya 1'e bakın.</li>
</ol>9. Organizasyon 
<ol><li>Hücre kültürü odasını, tüm malzemeler tek bir alanda bulunacak şekilde düzenleyin, böylece laboratuvar üyelerinin malzeme aramak için odadan ayrılma ihtiyacını en aza indirin.</li>
	<li>Hücreleri toplamak için kullanılan ve daha sonra hücre kültüründe yeniden kullanılan plastik şişeleri 'Sadece Hücre Kültürü Kullanımı İçin' olarak etiketleyin. Belirli bir hücre tipi için belirlenmiş hücre kültürü şişelerini kullanın. Kolay erişim için şişeleri hücre kültürü odasında saklayın.</li>
</ol>10. Bakteri, mantar ve mikoplazma kontaminasyonunun tanımlanması 
NOT: Yukarıdaki iş akışına uyulmaması bakteriyel, mantar ve mikoplazma kontaminasyonuna yol açabilir.
<ol><li>Her zaman çalışmaya başlamadan önce, ağır bulanıklık, bulanık toplar şeklinde ekstra büyüme ve yandaki yoğun hücre birikimleri için şişeleri gözlemleyin, bunların hepsi kirlenmenin göstergeleridir. NOT: Deneyimli bir göz, mikrobiyal kontaminasyonun neden olduğu bulanıklık ile gerçek hücreler arasındaki farkı söyleyebilir. Hücreler normalde berrak ortamın bulanık görünmesine neden olurken, bakteriyel kontaminasyon beyaz renkte ağır bulanıklığa neden olur.<ol><li>Ortamda yüzen yuvarlak, bulanık topların görünümünü not ederek küf kontaminasyonunu görsel olarak tanımlayın (bkz. Şekil 2).</li>
		<li>Ortam bulutlu, beyaz veya çalkantılı olduğunda bakteriyel kontaminasyonu görsel olarak tanımlayın (bkz. Şekil 2).</li>
		<li>Aylık mikoplazma testi yaparak mikoplazma kontaminasyonunu tanımlayın. PCR tabanlı bir test, kullanıcılara 1,5 mL'lik bir hücre örneği almalarını, 10 μL kullanarak hücre sayımı yapmalarını, 0,08 x 106 hücre / mL'ye seyreltmelerini, hücreleri aşağı döndürmelerini, kitte bulunan tamponu kullanarak hücreleri lize etmelerini ve son bir kez aşağı döndürmelerini söyler. Süpernatant, bir dizi mikoplazma türünü güçlendiren primerlerle inkübe edilir. Bantları görselleştirmek için bir DNA jeli çalıştırın. Bant olmaması, mikoplazmanın tanımlanmadığı anlamına gelir. NOT: Bu ana kirletici insan ağzında bulunabilir. Hücrelerdeki mikoplazma kontaminasyonunu çözdükten sonra ve deneyler için kullanmadan önce test etmek iyi bir uygulamadır. Daha sonra, hücreleri ayda bir kez mikoplazma kontaminasyonu açısından izleyin. Birçok şirket mikoplazma test kitleri sunmaktadır. Uygun olanı seçin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Johnson, Z. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+substrate+recognition+by+the+multidrug+resistance+protein+MRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1.</a> Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).</li>
<li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+as+biological+models%3A+practical+steps+for+more+reliable+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li>
<li>Segeritz, C. P., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+growing+cells+as+model+systems+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22%5BJournal%5D)">Cell culture: growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li>
<li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures%3A+Incidence%2C+sources%2C+effects%2C+detection%2C+elimination%2C+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li>
<li>Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%3A+sources%2C+consequences%2C+prevention%2C+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination.</a> Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).</li>
<li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+detection+of+mycoplasma+contamination+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).</li>
<li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li>
<li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li>
<li>Barth, O. M., Majerowicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+by+transmission+electron+microscopy+of+mycoplasma+contamination+in+sera+and+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).</li>
<li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+are+useful+model+systems+for+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines are useful model systems for medical research.</a> Cancers. 11 (8), 1098(2019).</li>
<li>Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you">https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you</a> (2020).</li>
<li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination: an overview.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).</li>
<li>Babic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-research%3A+Incidences+of+problematic+cell+lines+are+lower+in+papers+that+use+RRIDs+to+identify+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines.</a> eLife. 8, e41676(2019).</li>
<li>Visconti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+tandem+repeat+profiling+for+the+authentication+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells.</a> International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).</li>
<li>Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ghosts+of+HeLa%3A+How+cell+line+misidentification+contaminates+the+scientific+literature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature.</a> PLoS One. 12 (10), 0186281(2017).</li>
<li>Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties">https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties</a> (2023).</li>
<li>United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf">https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf</a> (2004).</li>
<li>Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html">https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html</a> (2023).</li>
<li>Coté, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+technique+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aseptic technique for cell culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).</li>
<li>Uphoff, C. C., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+Mycoplasma+contamination+from+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).</li>
<li>Bykowski, T., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aseptic technique.</a> Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98(2020).</li>
<li>Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article">https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article</a> (2020).</li>
<li>Phelan, K., May, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+tissue+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell tissue culture techniques.</a> Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).</li>
</ol>

Yazarın herhangi bir çatışan çıkarı yoktur.

Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken birincil endişelerden biri olsa da, bu makalede özetlenen uygulamalar ve teknikler risklerin azaltılmasına yardımcı olacaktır. Kritik adımlar arasında, sadece hücre kültürü odasında kullanılan temiz bir laboratuvar önlüğü giymek, sık sık% 70 EtOH ile püskürtülen ve hücre hatları arasında geçiş yaparken değiştirilen temiz, pudrasız eldivenler kullanmak, her bireyi medya şişelerini paylaşmamaya teşvik etmek, kabini işten önce ve sonra iyice temizlemek, Serolojik pipetlerin a...

Hücre kültürünün araştırma laboratuvarında birçok kullanım alanı vardır. 20. yüzyılın başlarında hücre kültürünün kökenlerinden bu yana, hücre hatları bilimin ilerlemesine yardımcı olmuştur. Hücre hatlarının birçok avantajı vardır; Çeşitli hücre hatları, araştırmacıların hücre biyolojisini incelemelerine, daha ileri çalışmalar için bakülovirüs üretmelerine veya birkaç1'i adlandırmak için büyük miktarlarda ilgi çekici bir protein üretmelerine yardımcı olabilir. Bazı ek kullanımlar arasında doku büyümesinin incelenmesi, aşı geliştirmenin ilerlemesine yardımcı olunması, toksikoloji araştırması, sağlıklı organizmalarda ve hastalıklı modellerde genlerin rolünün incelenmesi ve hibrit hücre hatlarının üretimisayılabilir 2,3. Hücre hatları ayrıca ilaç üretimini de sağlayabilir3. Hücre hatları ile çalışırken uygun aseptik teknikler gereklidir; Bu makalede özetlenen uygulama ve teknikler, hücre kültürü çalışmalarının yapıldığı araştırma laboratuvarlarına uygulanabilir. Diğer laboratuvar ortamları tartışılmamıştır.
Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken genellikle birincil endişe kaynağıdır. Bu makale bağlamında, kontaminasyon genellikle mantar ve bakterileri ifade eder. Bu makalede özetlenen yöntemin genel amacı, kontaminasyonu önlemek için en iyi uygulamaları kapsamlı bir şekilde tanımlamaktır. Tüm laboratuvar üyeleri, bir araştırma laboratuvarının hücre kültürü odasında çalışırken bu uygulamalara uymalıdır. Laboratuvarlar, tüm çalışanların kontaminasyonu önlemek için bu en iyi uygulamaları kullanmada aktif katılımcılar olmasını sağlamalıdır. Doğru uygulamaların ve tekniklerin bilgisi, hücre kültürlerinin canlı, sağlıklı ve kontaminasyondan uzak kalmasını sağlamaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin gelişimi, literatür araştırmalarına, hücre kültürleriyle çalışma deneyimine ve hem acemilerin hem de deneyimli hücre kültürü çalışanlarının yıllık bazda başvurabilecekleri bir yönteme duyulan ihtiyaca dayanmaktadır.
Tüm araştırma hücre kültürü laboratuvarlarının izlemesi gereken açık, standartlaştırılmış bir tekniğe ihtiyaç vardır. Hücre kültürü kontaminasyonu ile ilgili literatürün çoğunda, mikoplazmanın tespiti, aseptik teknikler, kontaminasyon kaynakları, kontaminantların ortadan kaldırılması ve antibiyotik kullanımı vedüzenli testler 4,5,6,7,8 ile önlenmesi tartışılmaktadır. Bu bilgiler yararlı olsa da, literatürde takip edilmesi gereken uygun hücre kültürü tekniklerini gösteren hiçbir video bulunmamaktadır. Sunulan uygulamaların alternatif tekniklere göre avantajı, hataları daha sonra tespit etmek ve düzeltmek yerine, kontaminasyonu gerçekleşmeden önce önlemeye odaklanmaktır. Ayrıca, aseptik tekniklerin kapsamlı bir gösterimi, mantarların ve bakteri üremesinin önlenmesi hakkında bir tartışma ve biyogüvenlik kabini hava akımı ile ilgili bilgiler hem acemi hem de deneyimli hücre kültürü çalışanları için değerlidir.
Bakteriler ve mantarlar en yaygın iki kirletici türüdür. Bakteri kategorisinde, mikoplazma, küçük boyutu ve fark edilmeden kalırken çoğalma kabiliyeti nedeniyle büyük bir endişe kaynağıdır. Büyümek için ökaryotik hücrelere dayanan sert hücre duvarı olmayan, kendi kendini kopyalayan organizmalardır. Metabolik yetenekleri azalmıştır ve hücre kültürlerinin rutin görsel muayenesinde ve düzenli mikroskobik analizde tanınmadan kalırken büyük ölçüde çoğalabilirler, ancak iletim elektron mikroskobu mikoplazma 9,10'u tespit edebilir. Ayrıca, mikrobiyolojik filtrelerden geçebilirler10. Hücre kültürü ortamı mikoplazmaya besin maddeleri sağlar, ancak ne yazık ki medyayı antibiyotiklerle desteklemek mikoplazma10'u etkilemez. Genel olarak, medyayı antibiyotiklerle desteklemenin gerekli olmadığı unutulmamalıdır; Kirlenmeyi uzak tutmak için uygun teknikler yeterli olmalıdır. Mikoplazma ile enfeksiyon anında hücre ölümüne yol açmaz, ancak veri tekrarlanabilirliğini ve kalitesini etkilediği için araştırmacıları ilgilendirir.
Tüm laboratuvar personeli iyi hücre kültürü uygulamalarına sıkı sıkıya bağlı kalmalıdır. Kültürler yeni satın alındıktan sonra, şu anda yetiştirilirken, kriyoprezervasyondan önce ve sıvı azot 2,10'dan çözüldüklerinde mikoplazma için test edilmelidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya immünoboyama kullanılarak piyasada farklı testler mevcuttur. 3 Literatür, "insan izolatlarının, hücre kültüründe bulunan mikoplazma kirleticilerinin büyük bir yüzdesini temsil ettiğini"5 göstermektedir. 200'den fazla mikoplazma türü tanımlanmış olmasına rağmen, bunların yaklaşık altısı çoğu enfeksiyonu oluşturmaktadır. Bu altı tür M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale ve Acholeplasma laidlawii10'dur. Diğer kontaminasyon türlerinde olduğu gibi, hava ve aerosoller bunları hücre kültürlerine getirir5. Bu, "insan operatörü laboratuvardaki potansiyel olarak en büyük tehlikedir"7 nedeniyle diğer makalelerde de tekrarlanmaktadır. Bu insan hatası ile yapılsa da, standart bir prosedür izlenirse risk ortadan kaldırılabilir. Personelden dökülme sadece mikoplazma kontaminasyonu ile sınırlı değildir; Bir laboratuvardaki hücre kültürleri genellikle aynı mikoplazma türleriyle enfekte olur, bu da kontaminasyonun yanlış hücre kültürü teknikleri nedeniyle bir şişeden diğerine yayıldığını gösterir10.
Çapraz kontaminasyonun önlenmesi de uygun hücre kültürü tekniklerinin izlenmesinin bir başka nedenidir. Dünya çapında hücre hatlarının en az% 15-18'inin çapraz kontamine olabileceği veya yanlış tanımlanabileceği belirtilmektedir11,12. Hücre hatlarını mikoplazma kontaminasyonu açısından test etmenin yanı sıra, çapraz kontaminasyon10 için de test edilmelidirler. İnsan hücre hatları için, kısa tandem tekrarlama (STR) profillemesi adı verilen ucuz bir DNA tabanlı teknikle hücre hattı kimlik doğrulaması, hücre hattı kimliğini 2,10,13,14 doğrulamanın kolay bir yolu olduğu için mevcut uluslararası referans standardıdır. STR, yanlış etiketlenmiş veya çapraz kontamine olmuş hücre hatlarını tanımlayabilir, ancak yanlış doku orijinini tespit edemez10,13,14. Araştırma verilerinin geçerliliği, hücre hatlarının yanlış etiketlenmesi, yanlış tanımlanması veya kirlenmesi durumunda tehlikeye girebilir13. Diğer kontaminasyon türlerine benzer şekilde, aerosollerin yayılmasına neden olan zayıf teknik, bir şişeye giren yanlış hücre tipine yol açan yanlış temas veya farklı hücre hatlarına sahip aynı ortam şişesini ve reaktiflerini kullanan aynı ortam şişesi ve reaktifleri kullanarak çapraz kontaminasyon oluşabilir10. Medya şişelerinin paylaşılmaması gerekir; Bir şişe ortamın iki farklı hücre çizgisi arasında paylaşılması, bu hücre popülasyonlarının karıştırılmasına izin verebilir ve daha hızlı büyüyen hücre tipinin şişeyi tamamen ele geçirmesine neden olabilir. Bu değiştirme fark edilmez ve yanlış etiketlemeye ve yanlış tanımlamaya yol açar2. Bir hücre çizgisi,10'un işlenmesi veya etiketlenmesi sırasında kültürlerin karıştırılması durumunda başka bir hücre çizgisiyle de karıştırılabilir. Reaktifleri, medyayı ve şişeleri birbirinden ayrı tutmaya dikkat edilmelidir. Her laboratuvar üyesinin kendi medya şişeleri olmalıdır; Laboratuvar üyeleri arasında hiçbir paylaşım gerçekleşmemelidir. Hücre hatlarının kendileri nitelikli bir hücre bankasından ve sağlayıcıdan satın alınmalıdır. Laboratuvarlar hücreleri paylaşmamalıdır. Çalışmalar, STR ve mikoplazma testlerinin düzenli olarak kullanılmasına rağmen, literatürdeki birçok araştırma makalesinin yanlış tanımlanmış veya kontamine olmuş hücre hatlarını zaten kullandığını göstermektedir15. Bu sorunlu makaleleri bulmak ve okuyucuları bu konuda geriye dönük olarak bilgilendirmek için araştırmayı gözden geçirmek hantaldır. Önleme, bu sorunun ilk etapta ortaya çıkmamasını sağlamanın en iyi yoludur.
Öğelerin% 70 EtOH ile püskürtülmesinin basit eylemi organizmaları öldürebilir; % 70 EtOH, proteinleri denatüre ederek ve bakteri ve mantarlar da dahil olmak üzere en yaygın kirletici organizmalarda lipitleri çözerek çalışır16. Çalışmalar,% 70'in en etkili konsantrasyon olduğunu göstermiştir; Yüzey proteinleri% 70 EtOH ile hızlı bir şekilde pıhtılaşmaz, böylece hücreye girebilirler, içerdiği su ise proteinlerin denatüre etme işlemi için gereklidir. Hücre duvarının her iki tarafındaki su ve alkolün konsantrasyon farkı nedeniyle,% 70 EtOH hem enzimatik hem de yapısal proteinleri denatüre etmek için hücreye girer. Şişelerde küf büyümesi gözlenirse, tüm inkübatör önce% 70 EtOH ile püskürtülerek ve kuru olarak silinerek dekontamine edilmeli, ardından 60 ° C'de16 saat boyunca inkübasyon yapılmalıdır. Bu çoğu küfü ve bakteriyi öldürür.
Önleme uygulamalarının, kontaminasyon oluştuktan sonra ortadan kaldırmaya yönelik alternatif tekniklere göre temel avantajı, laboratuvar çalışanlarının kontaminasyonu erken önleyerek, hücre kültürlerinin sağlıklı olduğundan ve inkübatörlerin dekontaminasyonu veya hücre kültürlerinin atılması ile ilişkili yüksek maliyetler olmayacağından emin olabilmeleridir. Örneğin, mikoplazma kontaminantlarının daha sonra elimine edilmesi etkili değildir7. Laboratuvar personelinin uygun şekilde eğitildiğinden, hücre kültürü odasının kendi kendine yeten bir yer olduğundan ve standart bir prosedürün kullanıldığından emin olmak için erkenden zaman ayırmak, zamandan ve paradan tasarruf etmenizi sağlayacaktır.

<table><tbody><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 Medya</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td></td></tr><tr><td>Cam Şaşkın Şişe</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>09-552-40</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pipetler</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Yardımı</td><td>Drummond</td><td>13-681-15A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipet</td><td>Corning</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>T75 şişesi</td><td>Corning</td><td>07-202-004</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td></td></tr><tr><td>*Bu video genel hücre kültürü teknikleri</td><td></td><td></td><td></td> hakkında olduğu için öğeler değişebilir</tr></tbody></table>

araştırma hücre kültürü laboratuvarında mantar ve bakterilerin kontaminasyonunu Önlemek İçin hücre kültürü teknikleri ve uygulamaları

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Hücre kültürü, kontrollü bir ortamda insan, hayvan ve böcek hücrelerini veya diğer dokuları büyütmek için gerekli olan hassas bir beceridir. Protokolün amacı, mantar ve bakterilerden kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için bir araştırma laboratuvarında kullanılan doğru teknikleri vurgulamaktır. Küçük boyutu ve hücre kültürü için kullanılan çoğu antibiyotiğe direnci nedeniyle hücre kültürü odasında büyük bir endişe kaynağı olan mikoplazma kontaminasyonundan kaçınmaya özel önem verilmektedir. Aynı teknikler sürekli büyümeyi sağlar ve sağlıklı hücreleri korur. Hem yeni hem de deneyimli hücre kültürü kullanıcıları için, kontaminasyon riskini azaltmak için bu en iyi uygulamalara tutarlı bir şekilde uymak önemlidir. Yılda bir kez, laboratuvarlar hücre kültürü en iyi uygulamalarını gözden geçirmeli ve gerekirse bir tartışma veya ek eğitim ile takip etmelidir. İlk etapta kontaminasyonu önlemek için erken önlem almak, kontaminasyon meydana geldikten sonra temizlemeye kıyasla zamandan ve paradan tasarruf etmenizi sağlayacaktır. Evrensel en iyi uygulamalar hücre kültürlerini sağlıklı tutar, böylece sürekli olarak yeni hücreleri çözme, pahalı hücre kültürü ortamı satın alma ve inkübatör dekontaminasyon ve arıza süresini azaltma ihtiyacını azaltır.

Bu makalede özetlenen uygun hücre kültürü teknikleri ve uygulamaları takip edilmezse, araştırma hücre kültürü laboratuvarında mantar ve bakteriler tarafından kontaminasyon meydana gelebilir. Şekil 2'de hem süspansiyonda hem de yapışkan kültürlerde kontaminasyon içeren şişeler görülmektedir.
Aseptik tekniklere uyulmadığında, küf kontaminasyonu 2-3 gün sonra ortaya çıkabilir. Ortamda yüzen yuvarlak bulanık toplar süspansiyon hücrelerinde fark edilirken, bağlı hücrel...

Bu protokol, mantar ve bakterilerin kontaminasyonunu önlemek için araştırma hücre kültürü laboratuvarında kullanılacak temel hücre kültürü tekniklerini ve uygulamalarını sunmaktadır. Bakteri kategorisinde, mikoplazma kontaminasyonunun önlenmesine özel önem verilecektir.

Araştırma Hücre Kültürü Laboratuvarında Mantar ve Bakterilerin Kontaminasyonunu Önlemek İçin Hücre Kültürü Teknikleri ve Uygulamaları

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...

Hücre kültürü, kontrollü bir laboratuvar ortamında çeşitli hücre ve doku türlerini büyütmek için gerekli olan hassas bir beceridir. Hücre kültürü çalışması yaparken birincil endişe kontaminasyondur. Bu kontaminasyon bakteri, küf veya mikoplazma şeklinde olabilir.Bu videoda özetlenen teknikler ve uygulamalar, hücrelerinizin canlı, sağlıklı ve kontaminasyonsuz kalmasını sağlayacaktır. Bu uygulamalara sıkı sıkıya bağlı kalınmalı ve tüm laboratuvar personeli yılda en az bir kez eğitim almalıdır. Çalışmaya başlamadan önce, sadece hücre kültürü odasında kullanılmak üzere tasarlanmış temiz bir laboratuvar önlüğü giyin.Başka hiçbir yüzeye dokunmamış yeni eldivenler giyin. Eldivenlerin sıkıca oturduğundan emin olun. Nitril pudrasız eldivenler en iyisidir.Laboratuvar önlüğü ve eldivenlerinin steril olması gerekmez. İşe hazırlanmak için eldivenleri, laboratuvar önlüğü kollarını ve biyolojik güvenlik kabininin içine% 70 etanol püskürtün. Çalışma yüzeyini, yanlara, arkaya, kabindeki herhangi bir öğeye ve ön cam panele hem içeriden hem de dışarıdan püskürtün.Çalışma yüzeyini ve cam paneli tüy bırakmayan bir kağıt havluyla kurulayın. Çalışma alanını kabinin içinde düzenlemek için biraz zaman ayırın. Su banyolarını hücre kültürü odasının içinde tutun ve bunları yalnızca ısınma ortamı veya hücreleri çözme gibi hücre kültürü amaçları için kullanın.Su banyoları boşaltılmalı ve haftada bir kez yıkanmalıdır. Kabine getirilen eşya miktarını sınırlayın ve ön veya arka ızgaraları bloke ederek biyolojik güvenlik kabini içindeki hava akışını kesmeyin. Kabinin içine yerleştirilen tüm eşyaları %70 etanol ile püskürtün ve kurulayın.Medya şişesinin üst kısmına püskürterek başlayın ve aşağı doğru ilerleyin. Temiz bir kağıt havluyla, medya şişesinin üstünden başlayarak kurumasını sağlayın ve kademeli olarak aşağıya doğru ilerleyin. Kapağa doğru geri dönmeyin.Bu dolapların çalışma şekli, odadan ve kabinin kendisinden ön ve arka ızgaralardan hava çekmeleridir. Hava, kabinin arkasına ve üstüne doğru gider. Orada, kirli hava filtre yığınından geçer ve filtrelenmiş temiz havanın bir kısmı kabindeki çalışma alanına doğru itilir.Kabin serolojik pipetleri barındıracak kadar büyükse, içine yerleştirilebilirler, aksi takdirde kabinin dışına monte edilmiş bir kapta saklanabilirler. Kullanmadan önce muhafazalı pipetin her iki tarafında da delik, yırtılma veya delinme olup olmadığını kontrol etmek iyi bir uygulamadır. Sargıyı sökmeyin.Bunun yerine, ambalajın uçlarını yavaşça soyun. Serolojik pipeti bir pipet yardımcısına yerleştirin ve sargıyı tek bir akışkan hareketle çıkarın. İmleci açık şişelerin veya şişelerin üzerine getirmeyin.Açık bir şişenin veya şişenin üzerine ulaşmak veya açık şişelerin üzerinde çalışmak önerilmez. Dolapların içindeki hava akımı, içindeki herhangi bir şeyi aşağı doğru iter. Uzanmak, kolunuzun veya eldiveninizin, örneğin kolunuzda bulunan herhangi bir kontaminasyonu hücre kültürünüze potansiyel olarak itebilecek öğelerin üstünde olmasını sağlayacaktır.Mümkün olduğunda, sıvı dökmeyin. Bunun yerine, serolojik bir pipet kullanarak ekleyin. İçeriği iyice karıştırın ve şişeyi başlatın.Medyanın neyle desteklendiğini yazın. Yapışkan kültürlerle çalışıyorsanız ve plastik bir şişeye ihtiyacınız varsa, tüm paketi püskürtün ve içeri alın. Eldivenleriniz kuruduğunda, tekrar etanol ile püskürtün.Yapışkan bir hücre hattıyla çalışırken, ortam veya yıkama solüsyonlarını aspire etmek için otoklavlanmış cam pipetler veya tek kullanımlık steril plastik pipetler kullanın. Metal kapağı saklama kabından dikkatlice çıkarın. Bir cam pipeti, kabı bir açıyla hafifçe sallayarak izole edin.Kabın içine ulaşırken, diğer pipetlere dokunmaktan kaçının. Seçilen pipeti yalnızca bir uçtan tutun. Şişelerdeki ve şişelerdeki kapakları mümkün olan en kısa sürede hızla değiştirin.Jantın çalışma yüzeyine temas etmemesi için kapakları çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. Kapağı üstten veya alttan tutmayın. Bunun yerine, yanlardan kapaklara dokunun.Sıvıları aspire ederken, kabinin dışında bulunan bir vakum tuzağı şişesini zemindeki ikincil bir kapta kullanın. Kabin içinde çalışırken atık oluşacaktır. Elleri kabinin içine ve dışına çok sık hareket ettirmek hava akışını keseceğinden, herhangi bir atığı geçici olarak kabinin içinde bırakmak iyidir.Çalışmanızı kesintiye uğratmaması için yan tarafa yerleştirin. Eldivenleri kuruduklarında cömertçe %70 etanol ile püskürtün. Islak damlamamaları için ellerinizi birbirine sürtün.Serolojik pipetler hakkında kısa bir not. Kaputtaki başka bir şeye yanlışlıkla dokunurlarsa, onları dışarı atmaktan çekinmeyin. Kirlenmiş olabilecek bir pipet kullanmak yerine temiz bir serolojik pipetle yeni başlamak en iyisidir.Hücreleri inkübatöre yerleştirmeden önce, mikroskop altında nasıl göründüklerini kontrol edin. Tek hücreler gözlenmelidir. Bu, hücrelerin tamamen yeniden askıya alındığını gösterir.İnkübatörlere konuşmayın, hapşırmayın, öksürmeyin veya ağır nefes almayın. İnkübatör kapılarını hızla açın ve kapatın. Onları gerekenden daha uzun süre açık bırakmak, havada bulunan kirleticilerin inkübatörlere girmesine izin verebilir.Kabinden çıkarmadan önce tüm şişelerin kapaklarının iyice kapatıldığından emin olun. Medya ışığa duyarlıdır. Kullanılmadığında karanlıkta dört santigrat derecede saklanmalıdır.Hücre kültürü çalışmaları tamamlandıktan sonra kabinin içine tekrar %70 etanol püskürtün ve yüzeyi bir kağıt havlu ile silerek kurulayın. Biyolojik tehlike atık torbasını boşaltın. Bu işlemi tekrarlayın ve farklı bir hücre hattına geçerken eldivenleri değiştirin.Cam şişelerde yetiştirilen süspansiyon kültürleriyle çalışırken, eldivenlerin ıslak olduğundan emin olun. Alüminyum folyoya ıslak eldivenlerinizle dokunun ve ardından biyolojik güvenlik kabinine yerleştirmeden önce şişenin altına sadece püskürtün. Hücre sayımı için bir örnek alırken, kabından sadece bir adet 1,5 ml'lik tüp çıkarın.Diğer tüplerin hiçbirine dokunmayın. Kapağı çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. İç kenara dokunmayın.Yanlardan dikkatli bir şekilde kullanın ve işiniz bittiğinde değiştirin. Süspansiyon hücrelerini ve cam şişeleri tutarken, şişenin tüm boynunu kaplayan çift katlanmış alüminyum folyo parçasını dikkatlice çıkarın. Dört köşeyi de yavaşça çekin ve folyoyu çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin.Cam şişeyi sadece alttan tutun. Folyo çıktıktan sonra boynundan dokunmayın. Hücre sayımı için örnek almak üzere 1 ml'lik bir serolojik pipet kullanın.Medyanın şişelerin kenarından aşağı damlamasına izin vermeyin. Varsa,% 70 etanol içeren kağıt havlu püskürtün ve hemen temizleyin. Şişeleri veya şişeleri biyolojik güvenlik dolaplarından çıkarmadan önce kapakların veya alüminyum folyonun sıkıldığından emin olun.Farklı hücre tipleri için ayrı inkübatörler kullanın. Bu, farklı hücre tiplerinin çapraz kontaminasyonunu önleyecektir. Kabin dışındaki sıvı atıkları toplamak için vakum kapanı şişesinin zeminde atık etiketli ikincil bir kapta yerleştirilmesi önerilir.Hortum, aylık olarak değiştirilen bir filtreye bağlanır. Hortum kabinin yanından içeri girer. İş tamamlandıktan sonra biyolojik tehlike çöpünü çıkarın.Lavabonun yanındaki duvarda bir cam yıkama protokolü bulundurun. İlk olarak, atılan hücreleri% 10 çamaşır suyu ile yaklaşık beş dakika bekletin. Daha sonra ağartıcı karışımını atın ve şişeyi suyla iyice durulayın.Su ile sabun ekleyin, bir fırça ile çok iyi ovalayın, daha fazla su ile durulayın. Ve sonra son adım, cam eşyaları sağdaki musluktaki DI suyuyla durulamaktır. Cam şişeleri mümkün olan en kısa sürede yıkayın, cam eşyaları iyice ovalayın.Sf9 hücreleri, düzgün bir şekilde temizlenmezse bu ölü hücre kenarını terk edecektir. Bu şişeleri bir cam yıkama tesisine göndermek yerine sadece hücre kültürü, otoklav hücre kültürü cam eşyaları için kullanın. Otoklav üzerindeki vakum döngüsünü 40 dakika sterilize edilmiş süre ve 40 dakika kuruma süresi boyunca kullanın.Laboratuvarın ana alanındaki cam eşyalardan ayrı tutun. Hücre kültürü odasını, tüm malzemeler tek bir alanda bulunacak şekilde düzenleyin, böylece laboratuvar üyelerinin malzeme aramak için hücre kültürü odasından çıkma ihtiyacını en aza indirin. Hücreleri toplamak için kullanılan ve daha sonra hücre kültüründe yeniden kullanılan plastik şişeleri, yalnızca hücre kültürü kullanımı için etiketleyin.Belirli bir hücre tipi için belirlenmiş hücre kültürü şişelerini kullanın. Kolay erişim için bu şişeleri hücre kültürü odasında saklayın. Süspansiyonda yetişen kültürler için, küf medyada yüzen toplar olarak tanınacaktır.Bakteriyel kontaminasyona gelince, medyayı beyaz ve bulutlu hale getirecektir. Benzer şekilde, yapışkan hücreler için, küf kontaminasyonu bulanık yamalar olarak kolayca tanınabilir. Bakteriyel kontaminasyon normalde berrak ortam, beyaz ve bulutlu hale gelecektir.Birçok mikoplazma türü, PCR tabanlı bir test kullanılarak güvenilir bir şekilde tanımlanabilir. Soldaki bant, DNA için moleküler ağırlık standartlarını göstermektedir. Sağdaki dört bant pozitif kontrollerdir.Test edilen hücre tipleri altında hiçbir bant görünmez, çünkü mikoplazma tespit edilmemiştir. Hücre kültürü ortamı, pH göstergeleri mevcutsa rengi kırmızıdan sarıya değişecektir. Sarı renk, pH'ın düşük olduğunu ve ortamın değiştirilmesi gerektiğini gösterir.Hücre sayımı yapılırken ışık mikroskobu altında başka büyümeler veya hücre şekilleri gözlenirse, bu kontaminasyonun bir göstergesi olabilir. Hücre sayımından önce hemositometrenin kapsamlı bir şekilde temizlenmesi gerektiğini unutmayın, çünkü bu tür döküntüler hücre kültürünün kendisinde değil, sadece hemositometrede bulunabilir. Kontaminasyon, hücre kültürü çalışması yaparken birincil endişelerden biri olsa da, bu riskler bu videoda özetlenen uygulamaları ve teknikleri izleyerek azaltılabilir.Her ay aylık mikoplazma testi yapılırsa, laboratuvar personeli yıllık olarak eğitilir ve bu uygulamalara sıkı sıkıya bağlı kalınırsa, hücreleriniz sağlıklı ve kontaminasyonsuz kalacaktır. Bu aynı zamanda pahalı hücre kültürü ortamı satın alma, yeni hücreler satın alma ile ilgili maliyetleri azaltmaya yardımcı olacak ve inkübatör dekontaminasyon duruş süresini azaltacaktır. Unutmayın, başarılı hücre kültürünün anahtarı, ilk etapta kontaminasyonu önlemek için erken eylemdir.

cell-culture-techniques-practices-to-avoid-contamination-fungi

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hücreleri confluency ulaşmak, pasajlandı veya geçişli olmalıdır. Bu video yapışmış ve süspansiyon hücreleri hem de alt kültüre için bir prosedür gösterecektir.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

Bir laboratuarda çalışırken, bulaşma kaynakları en aza indirmek için şarttır. Aseptik teknik Steril olmayan yüzeyler ile temas kaçınarak kültürler ve reaktifler transferi izin prosedürleri ifade eder. Serolojik pipet ile micropipettors Deneylerde kullanılan çözeltilerin sterilite bozmadan hassas cilt ölçmek için kullanılır.

Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Serolojik Pipetler ve Micropipettors ile Cilt Transferler

Kültür mikroorganizmalar için kullanılan medya ve reaktifler ile çalışırken, aseptik tekniği kontaminasyonu minimize edilmiştir sağlamak için uygulanan olmalıdır. Kaplama yöntemleri çeşitli rutin bir şekilde, izole yaymak veya numaralandırma bakteri ve faj, deney malzemelerinin steriliteyi korumaya işlemleri dahil, her biri için kullanılır.

Aseptik Laboratuvar Teknikleri: Kaplama Yöntemleri

Burada in vitro Homalodisca vitripennis hücreleri ve HoCV-1 yaymak için bir protokol mevcut. Orta HoCV-1 pozitif kültürlerden çıkarıldı ve RNA 168 saat süre ile, her 24 saat ekstre edilmiştir. Hücre yaşayabilirliği tripan mavi ile nicelendirildi. Tüm virüs parçacıkları sonrası enfeksiyon ekstre edildi. Çıkarılan RNA QRT-PCR ile belirlenmiştir.

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

İşte pluripotent kök hücreleri (PSC) ve nöral kök hücreleri (NSC), geleneksel biyogüvenlik kabini ve inkübatörünün yerini alarak maksimum sterilite ve tekrarlanabilirliğe izin veren kapalı bir hücre kültürü sisteminde büyütmek için bir protokol. Bu ekipman, klinik iyi üretim uygulaması (cGMP) ve klinik iyi laboratuvar uygulaması (cGLP) yönergelerine uygundur.

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

Bu yazıda hala, floresan görüntüler ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskop görüntüleri kullanılarak incelenmiştir kripokal hücreler ve amipler bir ortak kültürü hazırlamak için bir protokol ayrıntıları. Burada gösterildiği gibi nicel veriler bu tür niteliksel bilgileri tamamlayabilir.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

Toprağın opaklığı nedeniyle, kurucu mikroplar arasındaki etkileşimler hücresel çözünürlükle kolayca görselleştirilemez. Burada, mantar-mikrobiyal etkileşimleri araştırmak için yeni fırsatlar sunan iki mikroakışkan araç sunulmaktadır. Cihazlar çok yönlü ve kullanımı kolaydır, bu da hücresel düzeyde yüksek mekansal zamansal kontrol ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar.

Hücresel Düzeyde Mantar-Mikrobiyal Etkileşimleri Probalamak için Mikroakışkan Araçlar

Protokol, temiz oda ortamında mikrobiyal biyolojik yükü en aza indirmek için en iyi uygulamaları özetler ve çevresel izleme, proses izleme ve ürün sterilite testi gibi stratejileri içerir. Mevcut iyi doku uygulamaları standartlarını ve mevcut iyi üretim uygulamaları standartlarını karşılamak için gerekli olan üretim ve test tesisleri ile ilgilidir.

Temiz Oda Ortamları ve Hücresel Terapiler için Mikrobiyal Kontrol ve İzleme Stratejileri

Burada bizim laboratuvar donmuş bir stok tonlar insan embriyonik kök hücre hattı kültür başlar nasıl göstermektedir.

Donmuş Hücreler itibaren Kültür: İnsan Embriyonik kök hücrelerin

Droplets tarafından Başlığı Hücre Kapsülleme

Öğrenin, araştırma laboratuvarlarında mantar ve bakteri kontaminasyonunu önlemek için hücre kültürü tekniklerini. Bu yöntemler, hücre canlılığını koruyarak sağlıklı kültürler elde edilmesini sağlar.

Araştırma Hücre Kültürü Laboratuvarında Mantar ve Bakterilerin Kontaminasyonunu Önlemek İçin Hücre Kültürü Teknikleri ve Uygulamaları (Video) | JoVE Journal

Araştırma Hücre Kültürü Laboratuvarında Mantar ve Bakterilerin Kontaminasyonunu Önlemek İçin Hücre Kültürü Teknikleri ve Uygulamaları

Daha fazla video keşfet