Name: Nöral Hücre Transplantasyonunun İnsan Serebral Organoid Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Öğrenin, insan serebral organoidlerine nöral hücre transplantasyonu ve uzun süreli entegrasyon takibi için bu protokolü. İPSC kaynaklı nöral progenitör hücrelerin enjeksiyonu ve floresan mikroskopi ile hücre davranışını değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma için fonlar, Marcelle ve Jean Coutu vakfından ve Fonds de recherche du Québec - Santé'den (FRQS #295647) IRIC Hayırsever fonları aracılığıyla sağlandı. D.J.H.F.K., FRQS'den Chercheurs-boursiers Junior 1 bursu (#283502) şeklinde maaş desteğine sahiptir. M.I.I.R., İmmünoloji ve Kanser Araştırmaları Enstitüsü'nden IRIC Doktora Ödülü, Montreal Üniversitesi'nden Bourse de passage accélère de la maitrise au doctorat ve Bourse de Mérite aux cycles supérieurs tarafından desteklendi.

<ol><li>Spurlock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+penetrating+ballistic-like+brain+injury+induced+cognitive+deficits+after+neuronal+differentiation+of+transplanted+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Amelioration of penetrating ballistic-like brain injury induced cognitive deficits after neuronal differentiation of transplanted human neural stem cells.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (11), 1981(2017).</li>
<li>Zhou, Y., Shao, A., Xu, W., Wu, H., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advance+of+stem+cell+treatment+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Advance of stem cell treatment for traumatic brain injury.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 301(2019).</li>
<li>Hayashi, Y., Lin, H. -T., Lee, C. -C., Tsai, K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neural+stem+cell+transplantation+in+Alzheimer%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models.</a> Journal of Biomedical Science. 27 (1), 29(2020).</li>
<li>Kefalopoulou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+clinical+outcome+of+fetal+cell+transplantation+for+Parkinson+disease%3A+Two+case+reports%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: Two case reports.</a> JAMA Neurology. 71 (1), 83-87 (2014).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+graft-derived+dopaminergic+innervation+is+maintained+24+years+after+transplantation+in+the+degenerating+parkinsonian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensive graft-derived dopaminergic innervation is maintained 24 years after transplantation in the degenerating parkinsonian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (23), 6544-6549 (2016).</li>
<li>Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+stem+cell+therapies+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The future of stem cell therapies for Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).</li>
<li>Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell-based+therapy+for+Parkinson%27s+disease%3A+A+Kyoto+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">iPS cell-based therapy for Parkinson's disease: A Kyoto trial.</a> Regenerative Therapy. 13, 18-22 (2020).</li>
<li>Krause, M., Phan, T. G., Ma, H., Sobey, C. G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+therapies+for+stroke%3A+Are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cell-based therapies for stroke: Are we there yet.</a> Frontiers in Neurology. 10, 656(2019).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+Growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: Growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Jakel, R. J., Schneider, B. L., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+neural+stem+cells+to+model+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Using human neural stem cells to model neurological disease.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (2), 136-144 (2004).</li>
<li>Hodge, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+cell+types+with+divergent+features+in+human+versus+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex.</a> Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+divergence+of+vulnerability+and+responses+to+stressors+between+human+and+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Conservation and divergence of vulnerability and responses to stressors between human and mouse astrocytes.</a> Nature Communications. 12 (1), 3958(2021).</li>
<li>Morizane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+matching+improves+engraftment+of+iPSC-derived+neurons+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MHC matching improves engraftment of iPSC-derived neurons in non-human primates.</a> Nature Communications. 8 (1), 385(2017).</li>
<li>Khrameeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+transcriptome+map+of+human%2C+chimpanzee%2C+bonobo%2C+and+macaque+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution transcriptome map of human, chimpanzee, bonobo, and macaque brains.</a> Genome Research. 30 (5), 776-789 (2020).</li>
<li>Powell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+brains%3A+The+ethics+of+transplanting+human+neurons+into+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hybrid brains: The ethics of transplanting human neurons into animals.</a> Nature. 608 (7921), 22-25 (2022).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>García-Delgado, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+organoids+to+evaluate+cellular+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Brain organoids to evaluate cellular therapies.</a> Animals. 12 (22), (2022).</li>
<li>Lin, J. -R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+imaging+of+single+cells+using+a+high-throughput+cyclic+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method.</a> Nature Communications. 6 (1), 8390(2015).</li>
<li>Knapp, D. J. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+identifies+a+CD33%2B+subset+of+human+cord+blood+cells+with+high+regenerative+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis identifies a CD33+ subset of human cord blood cells with high regenerative potential.</a> Nature Cell Biology. 20 (6), 710-720 (2018).</li>
<li>Georgala, P. A., Carr, C. B., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Pax6+in+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The role of Pax6 in forebrain development.</a> Developmental Neurobiology. 71 (8), 690-709 (2011).</li>
<li>Britanova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb2+is+a+postmitotic+determinant+for+upper-layer+neuron+specification+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex.</a> Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+G2019S-LRRK2+sporadic+Parkinson%27s+disease+in+3D+midbrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling G2019S-LRRK2 sporadic Parkinson's disease in 3D midbrain organoids.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 518-531 (2019).</li>
<li>Smits, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Parkinson%27s+disease+in+midbrain-like+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids.</a> NPJ Parkinson's Disease. 5, 5(2019).</li>
<li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-I-interferon+signaling+drives+microglial+dysfunction+and+senescence+in+human+iPSC+models+of+Down+syndrome+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Type-I-interferon signaling drives microglial dysfunction and senescence in human iPSC models of Down syndrome and Alzheimer's disease.</a> Cell Stem Cell. 29 (7), 1135.e8-1153.e8 (2022).</li>
<li>Sun, X. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascularized+brain+organoids+to+study+neurovascular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions.</a> eLife. 11, e76707(2022).</li>
<li>Popova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglia+states+are+conserved+across+experimental+models+and+regulate+neural+stem+cell+responses+in+chimeric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human microglia states are conserved across experimental models and regulate neural stem cell responses in chimeric organoids.</a> Cell Stem Cell. 28 (12), 2153.e6-2166.e6 (2021).</li>
<li>Wang, S., Li, B., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+fluorophores+for+deep-tissue+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging.</a> ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

CNS yaralanmalarının / nörodejeneratif bozuklukların tedavisi için hücre terapötik yaklaşımlarına olan önemli ilgi göz önüne alındığında 1,2,3,4,5,6,7,8, bir nakil ortamında hücre fonksiyon modelleri önem kazanmaktadır. Bu makale, etiketli insan NPC'lerinin insan serebral organoidlerine nakli için bir yöntemin yanı sıra canlı hücre takibi ve histoloji ve immünofloresan boyama ile son nokta değerlendirmesi sunmaktadır. Daha da önemlisi, nakledilen hücrelerin organoid ortamda göç, farklılaşma ve uzun süreli (4 ay) kalıcılık yeteneğine sahip olduğunu gösterdik. Bu tür uzun süreli kalıcılık, beyin dilimi kültürlerinin sürdürülebilirliği üzerinde belirgin bir artıştır17. Bu nedenle, bu sistem, hayatta kalma, çoğalma ve farklılaşma gibi potansiyel bir terapötik ortamda değerlendirilmesi gereken davranışların çoğunu incelemek için uygundur. Gerçekten de, yakın zamanda yapılan bir ortogonal çalışma, nakledilen NPC'lerin, NSG fare beyinlerinenakledilen NPC'lere kıyasla serebral organoidlerde benzer şekilde davrandığını göstermiştir 20, böylece organoidlerin bir nakil alıcısı olarak faydasını doğrulamıştır. Bu bir in vitro sistem olduğundan, sitokinlerin veya ilgilenilen ilaçların eklenmesi de kolaydır. Bu, iltihaplanma ve immünosupresanlar gibi belirli ortamların nakledilen hücreler üzerindeki etkilerini daha iyi anlamak ve terapötik bir ortamda karşılaşabileceklerini daha fazla taklit etmek için kullanılabilir. Gösterdiğimiz döngüsel immünofloresan protokolü (önceki araştırmalaradayanarak 21), bu yaklaşımın gücünü daha da genişleterek, çok çeşitli soy ve potansiyel olarak hastalığa özgü belirteçlerin aynı anda tek bir bölümde değerlendirilmesine izin verir ve böylece nakledilen hücrelerin ve doku üzerindeki etkilerinin doğru bir şekilde izlenmesine izin verir. Tabii ki, analizin hedeflerine bağlı olarak bunun yerine diğer uç nokta değerlendirme yöntemleri kullanılabilir. Örneğin, hücre morfolojisi birincil ilgi alanıysa 3D rekonstrüksiyon ile doku temizleme kullanılabilir veya belirli hücre tiplerinin nicelleştirilmesi nihai hedef ise akış sitometrisi ile ayrışma kullanılabilir. Bu yöntemin, CNS tümörleri gibi diğer hücre tiplerine kolayca genişletilebilir olmasını ve potansiyel olarak mikro-çevre ile ilgili bir bağlamda çalışmalarına izin vermesini bekliyoruz. Benzer şekilde, alıcı olarak kullanılan organoidler, hastalık modeli organoidleri 25,26,27 ile değiştirilebilirve potansiyel olarak bu koşullar için transplantasyon yaklaşımlarının modellenmesine izin verir.
Tüm modellerde olduğu gibi, burada sunulanın da kendi sınırlamaları vardır. Birincisi, iPSC'den türetilen organoidler gelişimsel olarak olgunlaşmamıştır19 ve bu nedenle, birçok nörodejeneratif hastalığın ortaya çıktığı yaşlanan beyne kıyasla önemli farklılıklara sahiptir. Serebral organoidler de gelişimdetekdüze değildir 19, bu nedenle aynı fizyolojik nişe tutarlı enjeksiyonu engeller. Ayrıca, ilgili beyin bölgelerinin hücre tipleriniiçerirken 18,19, in vivo ortamda da önemli olan endotelyal, mikroglial ve bağışıklık bileşenlerinden yoksundurlar14. Bu, konakçının hücre nakline nasıl tepki vereceğinin incelenmesini sınırlar. Vasküler28 ve mikroglial29 hücrelerin eklenmesinin yanı sıra organoid tutarlılığını ve bölgeselleşmeyi18 arttırmak, böylece organoid transplantasyon sisteminin modelleme gücünü geliştirmek için teknikler şu anda çevrimiçi hale geliyor. Bununla birlikte, burada sunulanların ötesinde daha fazla test ve optimizasyon gerektireceklerdir. Bu protokol ucuz olmasına ve özel ekipman gerektirmemesine rağmen, örneğin enjeksiyon derinliği gibi bir dizi önemli teknik husus vardır. Bunun nedeni, hem organoidlerin perfüze edilmemesi hem de bu nedenle, çok büyürlersegenellikle nekrotik bir merkeze sahip olmalarıdır 19 ve bu ışık, canlı hücre takibi için organoid çekirdekten geçemez. Bu nedenle, çok derine enjekte edilen hücreler ve içeri göç eden koloniler gözden kaçabilir. Bu, daha iyi doku penetransına30 sahip daha uzun dalga boylu floroforların kullanılmasıyla iyileştirilebilse de, organoid boyutuna ve tespit aparatına bağlı olarak, bu muhtemelen dikkate alınacaktır. Son olarak, beyin organoidleri gelişme durumunda olduğundan, ortam, enjekte edildiği organoidin gelişim aşamasına bağlı olarak muhtemelen farklılık göstereceğinden, transplantasyon zamanlaması bir diğer önemli husustur. Bu, enjeksiyon sırasında tutarlı bir organoid yaşı sağlanarak bir dereceye kadar kontrol edilebilse de, şüphesiz dikkate alınması gereken bir faktördür.
Bu protokol ucuzdur, basittir, hayvan içermez ve özel ekipman gerektirmez, bu nedenle transplantasyon modellemesini daha geniş bir laboratuvar yelpazesi için erişilebilir hale getirir. Hem nöral hücre terapötiklerinde hem de organoid model sistemlerde hızlı ilerleme hızıyla, burada sunulan organoid transplantasyon protokolünün bir dizi hastalık ve terapötik yaklaşım için yararlı bir model olacağını tahmin ediyoruz.

İnsan beyni, nöral ve glial soyların çoklu hücre tiplerinden oluşan karmaşık bir organdır. Bunlar birlikte, bilişe yol açan karmaşık bir ağ oluşturur. Travmatik beyin hasarı (TBI)1,2, nörodejeneratif bozukluklar 3,4,5,6,7 ve inme8 dahil olmak üzere çok çeşitli nörolojik bozuklukların tedavisi için hücrelerin bu sisteme transplantasyonuna büyük ilgi vardır. Bununla birlikte, bu tür stratejilerin geliştirilmesindeki önemli bir sınırlama, beklenen transplantasyon sonuçlarını belirlemek için mevcut preklinik modellerin göreceli yetersizliğidir. Şu anda en çok kullanılan modeller, hücre potansiyelini belirlemek için in vitro kültür yöntemleri ve farelere ksenotransplantasyondur. Hücre kültürü yöntemleri, farklılaşmayı ve kendini yenileme potansiyelini9 değerlendirebilirken, bunlar, hücrelerin bir nakil bağlamında karşılaşacağı mikro ortamı taklit etmeyen optimal büyüme koşulları altında gerçekleştirilir. Ayrıca, hücrelerin büyüme şekli davranışlarını etkileyebilir10.
Fare beyinleri, mikroçevrenin tüm hücrelerini içerir ve bu nedenle, transplantasyon için son derece güçlü model sistemlerdir11. Bununla birlikte, fare ve insan korteksi12,13 arasında önemli farklılıklar vardır ve tüm büyüme faktörleri türler arasında çapraz reaksiyona girmez. Primat modelleri, insan sistemini daha iyi taklit eden ve aynı zamanda önemli klinik öncesi sonuçlar veren daha yakın bir alternatiftir14. Bununla birlikte, bu daha yakın akrabalar bile, hücresel yapılarında önemli farklılıklar gösterirler15. Bu model sistemlerin her ikisi de nakil sırasında hücre davranışı hakkında değerli bilgiler sağlarken ve nihai bir tedavinin cerrahi unsurlarını içerirken, kusurlu kalırlar. Aynı zamanda maliyetli ve teknik olarak zorlayıcıdırlar (yani, hayvanlar üzerinde beyin ameliyatı yapılması gerekir), bu nedenle olası verimi sınırlarlar. Ayrıca, insan beyin hücrelerinin hayvanlara nakledilmesiyle ilgili çok sayıda etik sorun vardır16. Beyin dilimi kültürleri, bir beynin kesilmesine ve birden fazla tedavi için kullanılmasına izin verir, böylece hayvan nakillerinin bazı sınırlamalarını ortadan kaldırır; Bununla birlikte, bunların sınırlı ömürleri (haftalar) vardır, hala hayvan kaynaklıdır ve (ince bir dilim olarak) hücrelerin enjeksiyonunu taklit etmek için yeterli hacim/yüzey bütünlüğüne sahip değildir17. Bu nedenle, kesinlikle hücre kültürü/potansiyel modeller ile in vivo transplantasyon arasında önemli bir boşluk vardır.
Serebral organoidler, beyinde bulunan ana nöral hücre tiplerini içeren bir in vitro modeldir ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) yüksek sayıda üretilebilir18,19. Bu tür organoidler, nakil ortamında ilgilenilen bir test hücresinin fonksiyonel kapasitesinin değerlendirilmesine izin verebilecek hücresel bir bağlam sağlar. Gerçekten de, yakın zamanda yapılan bir çalışma, insan serebral organoidlerine nakledilen nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) hayatta kaldığını, çoğaldığını ve obez bir diyabetik fareninbeynine nakledilen NPC'lere benzer şekilde farklılaştığını göstermiştir20. Serebral organoidler bu nedenle insan beyninin hücre tiplerini yakalayan, zulüm içermeyen, uzun ömürlü (>6 ay), uygun maliyetli bir sistemi temsil eder. Bu nedenle, nöral hücrelerin rejeneratif kapasitesinin erken aşama testi için ideal bir nakil alıcısını temsil edebilirler.
Bu makale, etiketli insan NPC'lerinin insan serebral organoidlerine transplantasyonu ve ardından izlenmesi için bir protokol sunmaktadır (Şekil 1). Bu, GFP etiketli NPC'lerin olgun (2-4 aylık) serebral organoidlere enjekte edilmesiyle başlar18. Nakledilen hücreler daha sonra 4 aylık bir süre boyunca canlı hücre floresan mikroskobu ile takip edilir. Bu süre zarfında, hem enjeksiyon bölgesindeki hücrelerin kalıcılığını hem de organoidin distal bölgelerine göçünü gösteriyoruz. Bitiş noktasında, önceki çalışmalara dayanarak ek boyama ve görüntüleme turlarına izin vermek için mevcut AlexaFluor bazlı boyaların söndürülmesi için bir protokol de dahil olmak üzere, bu organoidlerden türetilen histolojik kesitlerin antijen alımını, boyanmasını ve görüntülenmesini gösteriyoruz21. Bu nedenle bu protokol, bir nakil ortamında hücrelerin farklılaşma kapasitesinin, greft dayanıklılığının, yerinde hücre genişlemesinin ve nakil bölgesinden hücre göçünün ölçülmesinde faydalı olabilir. Bunun hem rejeneratif tıp/hücre tedavisi uygulamaları hem de tümör hücrelerini ilgili bölgeye özgü organoidlere aşılayarak tümör modellemesi için faydalı olacağını tahmin ediyoruz.

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td>proteolitik-kollajenolitik enzim karışımı</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-GFP Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>338008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-MAP2 (klon SMI 52)</td><td>BioLegend</td><td>801804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-GFAP Antikoru (klon SMI 25)</td><td>BioLegend</td><td>837510</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-Nestin (klon 10C2)</td><td>BioLegend</td><td>656804</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-Tubulin ve beta; 3 (TUBB3) (klon TUJ1)</td><td>BioLegend</td><td>801209</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik Asit Monohidrat</td><td>Fisher Chemical</td><td>A104-500</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu</td><td></td> Biotek-Denatüre <td></td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol (Susuz)</td><td>ChapTec-DMEM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>F12/ Glutamax</td><td>Thermo</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil Sülfoksit (DMSO), Steril</td><td>BioShop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>FIJI 1.53c</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Formalin çözeltisi, nötr tamponlu,% 10</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 ve nbsp;</td><td></td><td></td><td>-</td></tr> <tr><td>HistoCore Arcadia H</td><td>Leica Biosystems-Matrigel</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR)</td> <td>Corning</td><td>356231</td><td>Fenol Kırmızısı içermez, LDEV içermez</td></tr><tr><td>MX35 mikrotom bıçağı ve nbsp;</td><td>Epredia&nbsp;</td><td></td><td></td>3053835</tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-Ca -Mg)</td> <td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin Dihidroklorür</td><td>Termo</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü Y-27632</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; Paslanmaz Çelik Taban Kalıpları</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>Simport Scientific&nbsp; UNISETTE Biyopsi İşleme/Gömme Kaseti</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-9255</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Ön Beyin Nöron Farklılaşma Kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Nöral Progenitör Orta</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff SMADi Nöral İndüksiyon</td><td>Kiti Kök Hücre Teknolojileri</td><td>8581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Finesse ME Microtome</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Doku</td><td></td></tr> <tr><td>Hazırlama</td><td>Fisher Scientific</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>Doku-Tek VIP 6&nbsp; AI Doku İşlemcisi</td><td>Sakura</td> <td>Finetek-Toluene</td><td></td></tr> <tr><td>(histolojik)</td><td>ChapTec-Trypan</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>mavisi; %0,4 (ağırlık/hacim)</td><td>Thermo</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510.100</td><td></td></tr></tbody></table>

nöral hücre transplantasyonunun İnsan serebral organoid modeli

A Human Cerebral Organoid Model of Neural Cell Transplantation

Hücre nakli yaklaşımlarının ilerlemesi, nakledilen hücrenin fonksiyonel potansiyelinin doğru bir şekilde değerlendirilmesine izin veren model sistemleri gerektirir. Merkezi sinir sistemi için, ksenotransplantasyon son teknoloji ürünü olmaya devam etse de, bu tür modeller teknik olarak zorlu, verim açısından sınırlı ve pahalıdır. Dahası, mevcut çevresel sinyaller insan hücreleriyle mükemmel bir şekilde çapraz reaksiyona girmez. Bu makale, insan nöral hücrelerinin insan serebral organoidlerine nakli ve izlenmesi için ucuz, erişilebilir ve yüksek verimli uyumlu bir model sunmaktadır. Bu organoidler, ticari kitler kullanılarak insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden kolayca üretilebilir ve beynin anahtar hücre tiplerini içerir. 
Bu nakil protokolünü ilk olarak EGFP etiketli insan iPSC'den türetilmiş nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) bu organoidlere enjeksiyonu ile gösterdik. Daha sonra, canlı hücre floresan mikroskobu ile organoiddeki bu hücrelerin büyümesini izlemek için hususları tartışacağız ve nakledilen EGFP etiketli NPC'lerin 4 aylık bir süre boyunca bir organoidde izlenmesini göstereceğiz. Son olarak, nakledilen hücrelerin kesit alınması, siklik immünofloresan boyama ve lokal bağlamlarında görüntülenmesi için bir protokol sunuyoruz. Burada sunulan organoid transplantasyon modeli, nakledilen insan hücrelerinin ucuz ve gerçekleştirmesi kolay bir protokolle doğrudan bir insan mikro ortamında uzun süreli (en az 4 ay) izlenmesine izin verir. Bu nedenle, hem nöral hücre tedavileri (nakiller) hem de muhtemelen merkezi sinir sistemi (CNS) tümörlerini mikroçevresel olarak daha doğru bir şekilde modellemek için yararlı bir modeli temsil eder.

Serebral organoid kimliğinin doğrulanması olarak, olgun (2 aylık) bir serebral organoidin histolojik kesitleri PAX6 (dorsal NPC'lerinbir belirteci 23) ve SATB2 (olgun, postmitotik, üst tabaka nöronlarının bir belirteci24) için boyandı. Beklendiği gibi, PAX6+ hücreleri organoidin iç kısmında ve SATB2+ hücreleri üst katmanlarda mevcuttu (Şekil 2). Bu sonuçlar, kullanılan serebral organoidlerin, farklılaşma kitinde belirtildiği gibi gerçekten dorsal ön beyin olduğunu desteklemektedir. Serebral organoid nakil sisteminin doza bağımlılığını belirlemek için, 2 aylık serebral organoidlere artan sayıda EGFP + iPSC türevi NPC enjekte edildi. 10.000 hücre ve üzerinde tutarlı EGFP + hücre yaması tespiti ile GFP floresansının giriş hücresi sayısına açık bir doz bağımlılığı mevcuttu (Şekil 3). Nakledilen NPC'lerin kalıcılığı ve göçü, nakledilen organoidlerin zaman içinde takip edilmesiyle değerlendirildi. Bunun için 50.000 iPSC'den türetilmiş EGFP+ NPC, aynı iPSC hattından üretilen 2-3 aylık serebral organoidlere nakledildi. Enjekte edilen organoidler ve kontroller, önümüzdeki 3-4 ay boyunca belirtilen zaman noktalarında EGFP pozitifliği açısından görüntülendi. Bu nakil serisinde, enjekte edilen bölgenin 4 aylık takip süresi boyunca kalıcılığını gözlemledik (Şekil 4A). Ek EGFP + hücre yamaları, transplantasyondan 9 gün sonra ortaya çıktı ve çalışma bitiş noktasına kadar (organoide bağlı olarak 3-4 ay) devam etti, bu da hücrelerin göçünü ve yeni bölgelerine entegrasyonunu gösterdi (Şekil 4A). Daha yüksek bir büyütmede, organoide uzun çıkıntılarla net nöral morfoloji gözlemlenebildi (Şekil 4B), enjekte edilen hücrelerin entegrasyonunu doğruladı.
Enjeksiyondan sonra enjekte edilen hücrelerin farklılaşma durumunu belirlemek için, 4 ay boyunca izlenen organoid ve kontrolü sabitlendi, parafine gömüldü, 15 μm kalınlığında dilimler halinde kesildi ve cam slaytlara monte edildi. Dilimler daha sonra ya tek bir floresan boyama turunda (EGFP, TUJ1, NESTIN) ya da ek belirteçler (MAP2, GFAP) eklemek için iki ardışık boyama döngüsünde işlendi ve boyandı. İlk tek turlu boyama, NPC durumunu koruyan hücrelerin bir karışımı (NESTIN+TUJ1−) ve nöral bir kadere doğru farklılaşmış hücrelerin (NESTIN−TUJ1+) bir karışımı da dahil olmak üzere enjeksiyon bölgesinde EGFP+ hücrelerinin varlığını doğruladı (Şekil 5). Hem kontrol hem de enjekte edilen organoidler için, TUJ1+ olgunlaşmamış-olgun nöronların çoğunluğu ile çok az NESTIN+ NPC gözlenmiştir (hepsi enjeksiyon bölgesinde EGFP+ nakledilen NPC'ler olmasa da çoğu) (Şekil 5). İki yuvarlak boyama daha fazla ayrıntı verdi ve organoidin dış bölgesinin çoğunda olgun nöronları (NESTIN−TUJ1+MAP2+GFAP−) ortaya çıkardı ve ortaya doğru olgunlaşmamış (NESTIN−TUJ1+MAP2−GFAP−) nöron alanları ortaya çıkardı (Şekil 6A,B). Astrositler (NESTIN−TUJ1−MAP2−GFAP+) hem enjekte edilen hem de kontrol organoidlerinde mevcuttu ve dış kenarların etrafına serpiştirildi (Şekil 6A,B). Enjekte edilen organoidde iki yuvarlak boyamanın gerçekleştirildiği dilim, olgun nöronların fenotipini benimsemiş olan enjeksiyon bölgesinden uzakta küçük bir EGFP + hücresi uydu kolonisi gösterdi (Şekil 6B, C). Bunlardan bazıları astrositlere yakın görünüyordu; bununla birlikte, GFAP boyamasıyla tam örtüşen EGFP + hücreleri yoktu, bu da astrositlerin kendilerini üretmekten ziyade bitişik olduklarını düşündürüyordu (Şekil 6B, C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig01.jpg"> Şekil 1: Etiketli hücrelerin serebral organoidlere transplantasyon modeli. Lentiviral transdüksiyon ile etiketli hücrelerin oluşturulmasına, bunların serebral organoidlere transplantasyonuna ve canlı hücre görüntüleme ve immünofloresan ile izlenmesine şematik genel bakış. Kısaltma: GFP = yeşil floresan proteini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig02.jpg"> Şekil 2: Erken ve geç organoidlerin mimarisini gösteren histolojik kesitlerin immünofloresansı. 2 aylık bir serebral organoid sabitlendi, parafine gömüldü, dilimlendi ve PAX6, SATB2 ve DAPI ile boyandı. Otofloresandan yanlış pozitif bir sinyali önlemek için pozlama ve entegrasyon süresini ayarlamak için boyanmamış bir bölüm kullanıldı. PAX6+ hücreleri organoidin iç kısmında, SATB2+ hücreleri ise üst katmanlarda mevcuttu. Z-yığını görüntüleri, 15 μm'lik doku kesitinin tamamından her 4.2 μm'de bir çekildi. Optik bölümler, varsayılan seçeneklerle Gen5 yazılımındaki odak istifleme seçeneği kullanılarak birleştirildi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: PAX6 = eşleştirilmiş kutu 6 proteini; SATB2 = özel AT-zengin dizi bağlayıcı protein 2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2.jpg"> Şekil 3: NPC'lerin serebral organoidlere doza bağlı aşılanması. Organoidler 0 (negatif kontrol), 1.000, 5.000, 10.000 veya 50.000 GFP + iPSC türevi NPC ile nakledildi. Transplantasyondan 1 hafta sonra, organoidler bir GFP filtre küpü ile bir Cytation 5 üzerinde görüntülendi. Negatif kontrol, otofloresansı en aza indirmek için maruziyet ve entegrasyon süresini ayarlamak için kullanıldı. Daha koyu renkler, negatif kontrole göre daha fazla EGFP floresansını gösterir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bunlar tüm organoidlerin 4x görüntüleridir. Görüntülemeden sonra, organoidler arasındaki değişken arka plan yoğunluğunu düzeltmek için görüntülemeden önce piksel yarıçapı 50 olan yuvarlanan top arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirildi. En yüksek aşılama bölgeleri olarak tanımlanan enjeksiyon bölgeleri, aşılamanın mevcut olduğu kırmızı bir okla gösterilir. Kısaltmalar: NPC'ler = nöral progenitör hücreler; GFP = yeşil floresan proteini; EGFP = geliştirilmiş GFP; iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2.jpg"> Şekil 4: Floresan canlı hücre görüntüleme ile nakledilen hücre büyümesinin, göçünün ve kalıcılığının izlenmesi. (A) Kontrol ve nakledilen (50.000 GFP + iPSC türevi NPC) organoidleri, iki bağımsız nakil setinden 2-4 ay boyunca floresan canlı hücre görüntüleme ile takip edildi. Her bir zaman noktasında otofloresansı en aza indirmek için maruziyet ve entegrasyon süresini ayarlamak için negatif kontrol organoidleri kullanıldı. EGFP görüntüleri, nakil sonrası belirtilen zamanlarda Cytation 5 üzerinde bir GFP filtre küpü kullanılarak yakalandı. Daha koyu renkler, o zaman noktası için negatif kontrole göre daha fazla EGFP floresansını gösterir. Organoidler boyunca değişken arka plan yoğunluğunu düzeltmek için görüntülemeden önce piksel yarıçapı 50 olan yuvarlanan top arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirildi. Organoidler, her zaman noktasında yaklaşık olarak aynı yönde yerleştirildi ve görüntüler, ekranın tutarlılığı ve nakledilen hücre büyümesini açıkça göstermek için döndürüldü. En erken zaman noktasında en yüksek aşılama bölgeleri olarak tanımlanan enjeksiyon bölgeleri kırmızı bir okla gösterilir. Şeklin altında örnek bir negatif kontrol organoidi gösterilmektedir. (B) Transplantasyondan sonraki 1. ve 15. haftalarda aşılanmış organoidlerden örnek 20x görüntüler gösterilmiştir. Nörit görünürlüğünü sağlamak için FIJI kullanılarak görüntülenmeden önce yerel kontrast artırıldı. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: NPC'ler = nöral progenitör hücreler; GFP = yeşil floresan proteini; EGFP = geliştirilmiş GFP; iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig05.jpg"> Şekil 5: Transplante edilen NPC'lerin enjeksiyon bölgesinde migrasyon ve nöral farklılaşma ile birlikte kalıcılığını ortaya koyan histolojik kesitlerin immünofloresansı. (A) enjekte edilmemiş ve (B) nakledilmiş organoidlerden alınan tek kanallı floresan görüntüleri. Sağdaki üst üste binen resim, ilgilenilen üç kanalı (NESTIN, TUJ1 ve EGFP) gösterir, ancak DAPI'yi içermez. Ekran minimumları, sadece negatif hücrelerden gelen sinyali hariç tutacak şekilde ayarlandı (enjekte edilmemiş kontrolden EGFP için ve bilinen işaretleyici kombinasyonlarına dayalı diğer kanallar için belirlenir). Ekran maksimumları, herhangi bir hücrede bu antikor için gözlemlenen en yüksek sinyale dayanıyordu. Doğrudan karşılaştırmaya izin vermek için enjekte edilmeyen ve nakledilen organoidler arasında görüntüleme aralıkları sabit tutuldu. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltmalar: NPC'ler = nöral progenitör hücreler; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TUJ1 = beta-III tübülin; EGFP = geliştirilmiş yeşil floresan proteini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2.jpg"> Şekil 6: Histolojik kesitlerin siklik immünofloresan kullanılarak aşılanmış hücre farklılaşma durumunun ve lokalizasyonunun değerlendirilmesi. Enjekte edilmemiş, (A) yaş uyumlu ve (B) nakledilen organoidlerden alınan tek kanallı floresan görüntüleri, belirtildiği gibi birinci ve ikinci boyama turu için gösterilir. Ekran minimumları, sadece negatif hücrelerden gelen sinyali hariç tutacak şekilde ayarlandı (enjekte edilmemiş kontrolden EGFP için ve bilinen işaretleyici kombinasyonlarına dayalı diğer kanallar için belirlenir). Ekran maksimumları, herhangi bir hücrede bu antikor için gözlemlenen en yüksek sinyale dayanıyordu. Görüntüleme aralıkları (ve tabii ki görüntüleme parametreleri), doğrudan karşılaştırmaya izin vermek için kontrol ve enjekte edilen organoidler arasında sabit tutuldu. Ölçek çubukları = 100 μm. Sağdaki her organoid için her boyama turu için üst üste bindirilmiş bir görüntü (DAPI hariç) gösterilir. (B) Görüntü kaydının gerçekleştirildiği enjekte edilen organoid için, tüm görüntüler her iki boyama turunda gözlemlenen bölgeye kırpılır. (B,C) Enjekte edilen organoid için, EGFP + hücre bölgeleri mavi renkle belirtilmiştir. Görüntü kaydı sırasında özellikleri eşleştirmek için DAPI'nin nasıl kullanıldığına ilişkin bir diyagram (C) içinde gösterilir ve ardından kayıtlı görüntünün genel bir birleşimi gösterilir. Kısaltmalar: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TUJ1 = beta-III tübülin; EGFP = geliştirilmiş yeşil floresan proteini; MAP2 = mikrotübül ile ilişkili protein 2; GFAP = glial fibriler asidik protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64770/64770fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Klon</td>
			<td>Florofor</td>
			<td>Konsantrasyon</td>
		</tr><tr><td>Anti-NESTIN</td>
			<td>10C2 Serisi</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1'ü 2,000 arada</td>
		</tr><tr><td>Anti-TUBB3</td>
			<td>TUJ1</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>1'ü 2,000 arada</td>
		</tr><tr><td>GFP Karşıtı</td>
			<td>FM264G</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1'ü 200 arada</td>
		</tr><tr><td>Anti-GFAP</td>
			<td>SMI 25</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1'ü 500 arada</td>
		</tr><tr><td>Anti-MAP2</td>
			<td>SMI 52</td>
			<td>AlexaFluor 488</td>
			<td>1'ü 1,000 arada</td>
		</tr><tr><td>Anti-PAX6</td>
			<td>O18-1330 Serisi</td>
			<td>AlexaFluor 647</td>
			<td>100'ü 1 arada</td>
		</tr><tr><td>SATB2 Önleme</td>
			<td>EPNCIR130A</td>
			<td>AlexaFluor 594</td>
			<td>1'ü 500 arada</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Boyama için antikor konsantrasyonları. Kısaltmalar: TUBB3 = beta-tubulin III; GFP = yeşil floresan proteini; GFAP = glial fibriler asidik protein; MAP2 = mikrotübül ile ilişkili protein 2; PAX6 = eşleştirilmiş kutu 6 proteini; SATB2 = özel AT açısından zengin dizi bağlayıcı protein 2.

Burada, etiketli nöral hücrelerin insan serebral organoidlerine nakli ve izlenmesi için bir protokol açıklıyoruz.

Nöral Hücre Transplantasyonunun İnsan Serebral Organoid Modeli

The advancement of cell transplantation approaches requires model systems that allow an accurate assessment of transplanted cell functional potency. For ...

Hücre tedavilerine olan ilginin artmasıyla birlikte, bu hücrelerin işlevselliğini değerlendirmek için yeni yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu protokol, bu hücre engraftasyonunun nöral bağlamda in vitro uzun vadeli değerlendirmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajları, tüm bileşenlerin insan kaynaklı olmasıdır.Ayrıca, aşılama kolayca izlenebilir ve organoidden gelen ortam kolayca değiştirilebilir, bu da farklı ilaçların veya tedavilerin test edilmesine izin verir. Bu tekniği göstermek, laboratuvarımda yetenekli bir doktora öğrencisi olan Iliana Ibanez olacak. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin veya iPSC'den türetilmiş nöral progenitör hücrelerin veya NPC'lerin tek hücreli süspansiyonunu buzdan çıkararak ve bunları 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyerek başlayın.Süpernatanı çıkarın ve enjeksiyon başına iki mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için hücre peletini mililitre çözünmüş bazal membran matrisi başına 3 miligramda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu kullanana kadar hemen buzun üzerine yerleştirin. Önceden soğutulmuş şırıngayı daha sonra kullanmak üzere 20 santigrat derece dondurucudan bir buz kovasına aktarın.Daha sonra, beyin organoid plakasını inkübatörden çıkarın ve organoidi geniş çaplı bir uç kullanarak 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Organoidleri stabilize etmek ve enjeksiyonu kolaylaştırmak için, organoide zarar vermeden ortamı mümkün olduğunca çıkarın. Enjeksiyonu kolaylaştırmak için organoidi içeren 35 milimetrelik çanağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.Organoidler enjekte edilmeye hazır olduğunda, soğutulmuş bir P20 pipet ucu kullanarak EGFP etiketli NPC hücrelerini nazikçe yeniden süspanse edin ve bu hücrelerin iki mikrolitresini önceden soğutulmuş steril bir cam slayt üzerine taşıyın. Buzdan önceden doldurulmuş bir insülin şırıngası alın ve iğnenin eğimi aşağı bakacak şekilde 2 mikrolitre hücre süspansiyonunu yavaşça yukarı çekin. Mikroskobu üzerine odaklamadan önce organoid içeren tabağın kapağını açın.Çanağı bir elinizle tutun, iğnenin eğimini yukarı yerleştirin. Öte yandan, hücreyi yavaşça organoid yüzeye enjekte edin. Hücreleri enjekte ettikten sonra, kapağı tekrar tabağa yerleştirin ve enjekte edilen organoidi bir ila iki dakika inkübe edin.Ardından, organoidi geniş delikli bir uca sahip 24 oyuklu bir plakaya aktarmadan önce plakaya 500 mikrolitre organoid ortam ekleyin. Organoidi 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte her iki günde bir tam bir ortam değişikliği ile inkübe edin. Floresan mikroskobuna enjekte edilmemiş veya negatif kontrol organoidi yükleyin.Minimum otomatik floresan için aydınlatma yoğunluğunu 1 ile 2 arasında ve pozlama süresini 80 ile 100 milisaniye arasında ayarlayın. Ardından, pozitif kontrol organoidini yükleyin ve etiketli hücrelerin görünür olduğundan emin olmak için maruz kalma süresini artırın. Enjeksiyon için geliştirilmiş yeşil floresan proteini veya EGFP plus bölgesini bulmak için organoidi geniş çaplı bir pipet ucuyla yeniden konumlandırın.Organoidi yüklemeden önce ortamı organoidden tamamen çıkarın. Ve seçilen ayarlarla görüntüleyin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, organoidin kurumasını önlemek için hemen yeni bir ortam ekleyin.Tüm organoidler için besiyeri çıkarma ve görüntülemeyi tekrarladıktan sonra, organoidleri normal inkübasyona ve besiyeri değişikliklerine döndürün. Görüntülemeyi istediğiniz aralıklarla tekrarlayın. Slaytı iki dakika boyunca toluen ile doldurulmuş bir Coplin slayt boyama kavanozuna yerleştirin ve bu adımı tekrarlayın.Ardından, cam slaytı iki dakika boyunca %100 etil alkolle doldurulmuş bir cam Coplin slayt boyama kavanozuna aktarın. Slaytı iki dakika boyunca suyla dolu bir Coplin kavanozuna aktarmadan önce bu adımı tekrarlayın. Yıkamayı suyla tekrarlayın.Ardından, su banyosuna plastik bir kap yerleştirin ve plastiğin banyonun dibine temas etmemesini sağlayın. Sitrat tamponunu plastik kabın içine dökün ve 95 ila 100 santigrat dereceye ulaşmasına izin verin. Tampon istenen sıcaklığa ulaştığında, slaytları tamponun içine yerleştirin ve kabı bir kapakla gevşek bir şekilde kapatın ve slaytları su banyosunun içinde 30 ila 40 dakika bırakın.İnkübasyondan sonra, plastik kabı su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika soğumaya bırakın. Slaytları PBS ile her biri iki dakika boyunca üç kez yıkayın. Numuneye dokunmadan PBS'yi bir kağıt mendille çıkarın.Geçirgenlik tamponunu hazırlayın ve bir cam slayt boyama kavanozunu bununla doldurun. Slaytları geçirgenleştirme tamponuna daldırın ve 10 dakika inkübe edin. Her biri iki dakika boyunca üç PBS yıkamasını tekrarlayın.Ardından, her bir numuneyi kaplayacak şekilde boyama karışımı hazırlayın ve slaytı oda sıcaklığında bir saat inkübe etmeden önce organoid slayda 25 mikrolitre ekleyin. İnkübasyondan sonra, her biri iki dakika boyunca üç PBS yıkamasını tekrarlayın ve slaytı bir cam slayt boyama kavanozu içinde damıtılmış suyla durulayarak tuzları çıkarın. Ardından, floresan mikroskobu kullanarak slaydı görüntülemeden önce her numuneye 10 mikrolitre sıvı yuvası ve DAPI ekleyin.2X söndürme tamponu ile yarıya kadar doldurulmuş cam Coplin boyama kavanozuna 45 mililitre PBS ekleyin ve slaytları bu kavanozun içine yerleştirin. Kavanozu gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Boyama ve görüntülemeyi tekrarlamadan önce floroforların etkili bir şekilde söndürülüp söndürülmediğini kontrol etmek için floresan mikroskobu kullanın.10.000 hücre ve üzerinde tutarlı EGFP artı hücre yaması tespiti ile giriş hücresi sayısına GFP floresansının net bir doz bağımlılığı mevcuttu. EGFP pozitifliği için görüntülenen enjekte edilen organoidler ve kontroller, enjekte edilen bölgenin dört aylık izleme süresi boyunca kalıcılığını gösterdi. Ek EGFP pozitif hücre yamaları, transplantasyondan dokuz gün sonra ortaya çıktı ve çalışma bitiş noktasına kadar devam etti, bu da hücrelerin göçünü ve yeni bölgelerine entegrasyonunu gösterdi.Daha yüksek bir büyütmede, organoide uzun çıkıntılarla net nöral morfoloji gözlemlenebildi ve enjekte edilen hücrelerin entegrasyonunu doğruladı. İlk tek tur boyama, NPC durumunu koruyan hücrelerin bir karışımı ve nöral bir kadere doğru farklılaşmış olanlar da dahil olmak üzere, enjeksiyon bölgesinde EGFP artı hücrelerin varlığını doğruladı. Kontrol ve enjekte edilen organoidler için, TUJ1 artı olgunlaşmamış olgun nöronların çoğunluğu ile çok az sayıda Nestin artı NPC gözlendi.İki yuvarlak boyama daha fazla ayrıntı verdi ve organoidin dış bölgesinin çoğunun etrafındaki olgun nöronları ortaya çıkardı ve ortaya doğru olgunlaşmamış nöron alanları ortaya çıkardı. Astrositler, enjekte edilen ve kontrol organoidlerinde mevcuttu ve dış kenarların etrafına serpiştirildi. Enjekte edilen organoidde iki yuvarlak boyamanın gerçekleştirildiği dilim, olgun nöronların fenotipini benimsemiş olan enjeksiyon bölgesinden uzakta küçük bir EGFP artı hücre uydu kolonisi gösterdi.Bu kolonilerin bazıları astrositlere yakın görünmektedir. Bununla birlikte, GFP boyamasıyla tam örtüşen hiçbir EGFP artı hücresi, astrositlerin kendilerini üretmekten ziyade bitişik olduklarını öne sürmedi. Organoidi enjekte ederken, organoidi tamamen yok edebileceğiniz için çok fazla kuvvet uygulamaktan veya çok hızlı yapmaktan kaçınmanız gerekir.Bu nedenle, yaşam takibinden sonra, organoidler ilişkilendirilebilir ve akış sitometrisi analizi veya tek hücre dizileme yaklaşımları için kullanılabilir. Bu, hücrelerin moleküler durumunu bilmemizi sağlayacaktır. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıklar için hücre tedavisini ilerletmek, ayrıca beyin tümörlerini veya metastazlarını modellemek için son derece yararlı olabilir.

a-human-cerebral-organoid-model-of-neural-cell-transplantation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaynak: Palma-Tortosa, S., et.al. İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri. J. Vis. Uzm. (2022)Bu video, kök hücre kaynaklı nöronal progenitör hücrelerin insan kortikal doku dilimlerine naklini göstermektedir. Prosedür, bir bazal membran matrisinde progenitör hücrelerin izole edilmesini ve yeniden askıya alınmasını, ardından bunların bir transwell düzeneğine yerleştirilen kortikal bir dilime enjekte edilmesini içerir.

Kök Hücre Kaynaklı Nöronal Progenitörlerin İnsan Kortikal Dilimlerine Nakli

Kaynak: Ibanez-Rios, M.I., et al., Nöral Hücre Naklinin İnsan Serebral Organoid Modeli. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, floresan etiketli nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) bir hücre-matris karışımı kullanılarak insan serebral organoidlerine enjeksiyonunu göstermektedir. Yöntem tekrarlanabilir ve hayvansızdır ve minimum organoid bozulma ile transplantasyona olanak tanır. Nöral nakilleri ve merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıklarını modellemek için değerli bir platform sunar.

Transplantasyon Modellemesi için Floresan Nöral Progenitör Hücrelerin İnsan Serebral Organoidlerine Enjeksiyonu

Serebral organoids erken insan beyni geliştirme vitroaraştırmak için yeni bir modeli sistemi temsil eder. Bu makale verimli bir şekilde homojen dorsal ön-tipi organoids İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre de dahil olmak üzere kritik karakterizasyonu ve doğrulama adımları oluşturmak için ayrıntılı yöntembilim sağlar.

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

Bu çalışmada, iki spesifik insan nöral organoidleri, insan sinirsel organoidlerin içinde sadece insanlarda ve 2) nöron dopaminerjik olarak eğitim için ilgili ve doğru bir model olarak 1) insan glioblastoma gelişimi türetmek için protokoller tanıtır ve açıklanmaktadır üç boyutlu bir organoid üreten farklılaşma.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

Bu çalışmada, standart besleyicisiz hPSC kültürlerini kullanarak basit ama sağlam bir kortikal organoid kültür sistemi için ayrıntılı bir teknik sunuyoruz. Bu, in vitro beyin yaşlanmasının yönlerini modelleyen organoidler üretmek için hızlı, verimli ve tekrarlanabilir bir protokoldür.

Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Yeniden Üretilebilir Üretimi In Vitro

Bu protokol, yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonu ile birlikte tanımlamakta ve insan nörodejeneratif bozuklukları için kök hücre bazlı tedavileri daha fazla test etmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır.

İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri

Primat serebral organoidlerinin elektroporasyonu, primat (pato) fizyolojik neokorteks gelişimine yakın bir model sistemde farklı progenitör tiplerine ve nöronlara geçici genetik modifikasyonları tanıtmak için kesin ve etkili bir yaklaşım sağlar. Bu, nörogelişimsel ve evrimsel süreçlerin incelenmesine izin verir ve hastalık modellemesi için de uygulanabilir.

Genetik Modifikasyon için Primat Serebral Organoidlerinin Hedefe Yönelik Mikroenjeksiyonu ve Elektroporasyonu

Burada, insan beyni organoidlerini çoklu olgunlaşma aşamalarında civciv koryoallantoik membranına (CAM) aşılamak için bir protokol sunuyoruz. Beyin organoidleri, kılavuzsuz standartlaştırılmış protokoller izlenerek büyütüldü.

Erken Güdümsüz İnsan Beyni Organoid Nörovasküler Niş İzin Veren Civciv Embriyo Korioallantoik Membran Modellemesi

Burada, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyon ile akut genetik manipülasyonunu sunuyoruz. Bu kortikal organoid modeller, ventrikül benzeri yapılar dilimlemeden sonra kolayca tanımlanabildiğinden, insan kortikal gelişiminin, nörogelişimsel bozuklukların ve kortikal evrimin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağladığından, enjeksiyona özellikle uygundur.

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

Öğrenin, insan serebral organoidlerine nöral hücre transplantasyonu ve uzun süreli entegrasyon takibi için bu protokolü. İPSC kaynaklı nöral progenitör hücrelerin enjeksiyonu ve floresan mikroskopi ile hücre davranışını değerlendirin.

Nöral Hücre Transplantasyonunun İnsan Serebral Organoid Modeli

Daha fazla video keşfet